Summary
Doğrudan bir yöntem, hücre tiplerinde çeşitli mezenkimal geçiş (EMT) epitel indüklenmesi için tarif edilmektedir. Immünositokimya EMT eyalette hücrelerin analiz yöntemleri dahildir.
Abstract
Mezenkimal geçiş (EMT) epitel gelişimi sırasında uygun bir şekillenmesinde için gereklidir. Bu sürecin düzenlenmemesi fibroz önemli bir olay ve metastatik bir duruma karsinomların ilerlemesinin olarak işaret edilmiştir. EMT altında yatan süreçleri anlamak, erken tanı ve bu hastalık durumlarının klinik kontrolü için şarttır. In vitro EMT Güvenilir indüksiyon tanı amaçlı ortak bir gen ekspresyon imzaları belirlemek için yararlı bir ilaç keşfi için bir araç gibi değildir. Burada hücre tiplerinin çeşitli EMT endüksiyonu için basit bir yöntem ortaya koymaktadır. Hücre bağışıklık kimyası öncesi ve sonrası EMT indüksiyon analizi için yöntemler de dahildir. Ayrıca, antikor bazlı dizi analizi ve göç / istila deneyleri aracılığıyla bu yöntemin etkinliğini göstermektedir.
Introduction
Mezenkimal geçiş (EMT) için bir epitel polarize epitel hücresi yüksek hareketli, fibroblast benzeri mezenkimal hücre sonuçlanan değişiklikler çeşitli maruz olan bir süreçtir. Bu işlem, göç ve işgal için artan bir yetenek ile sonuçlanır, gen ekspresyonu değişiklikler ve adherens birleşme degradasyonu yoluyla, kısmen meydana gelir. Fizyolojik, EMT embriyonik gelişim ve yara iyileşmesi sırasında önemli rol oynar. EMT üzerinde kontrol kaybı, fibrozis ve karsinom 1,2 metastaz yol açabilir.
Epitel hücrelerinin yüzeyi üzerinde E-kaderin indirgeme EMT 3,4 ile hücrenin ilerlemesinde önemli bir adımdır. E-kadherin direkt komşu hücreler üzerinde cadherin proteinleri ile etkileşime giren bir tek-geçişli bir transmembran proteindir. Hücre yapışmasında rolüne ek olarak, E-kadherin etkiler hücre E-kadherin An sitoplazmik kuyruğu arasındaki etkileşim ile sinyalizasyondüzenleyici proteinler da çeşitli, özellikle β-katenin. β-katenin adherens birleşme stabilizasyonu bir rol oynar. Doğal Wnt sinyallemesinin sırasında β-katenin E-kaderin salınır ve Wnt yolu 3,4,5 in bir alt transkripsiyon faktörü olarak hareket çekirdeğe transloke. Çekirdeğin içinde, β-katenin Büküm, Bilgi, Fibronektin ve matris metaloproteazların 3,6 çeşitli dahil olmak üzere birçok EMT ilgili faktörler transkripsiyonunu artırmak için gösterilmiştir.
Wnts ek olarak, TGF-β sinyal normal gelişim sırasında ve hastalık durumlarının 7,8,9 hem de EMT indüklenmesinde önemli bir rol oynadığı gösterilmiştir. TGF-β damak oluşumu sırasında ve gelişen kalp 10 meydana EMT katılır. Ayrıca, fibroz ve metastaz 7 kanser ilerlemesinde rol oynadığı ispatlanmıştır.
Pr Burada tarif edilen prosedürovides genetik manipülasyon için gerek kalmadan hücre tiplerinin çeşitli EMT tutarlı indüksiyonu. Bu prosedür, E-kaderin bir kokteylini kullanan, sFRP-1 ve Dkk-1 bloke edici antikorlar ve Wnt-5a ve TGF-β1 rekombinant proteinleri. Bu kokteyl Wnt ve TGF-β sinyalini yükselten E-kadherin-tabanlı yapışmasını engellemek için tasarlanmıştır. Sağlam EMT indüksiyonu için yeteneği, bu işlemin nasıl biyoloji ve tedavi amaçlı olarak işlemek için anlamak için çok önemlidir. EMT Mevcut ortak belirteçleri, E-kadherin (EMT olarak azaldı) ve (EMT upregüle) Vimentin, kanserlerde birlikte ifade bulunabilir ve bu yüzden potansiyel olarak metastatik hücrelerin 12 en iyi ve en tanı markerleri olarak sağlamaz. Önemli olarak, EMT geçirmiş hücre tiplerinin çeşitli analiz kanser ve fibroz 11 tanı amacıyla kullanılabilecek ortak bir gen ekspresyon imzaları geliştirmek için yararlıdır. Buna ek olarak, son çalışmalar göstermiştir ki EMT EMT geçirmiş hücreler, bu hücreler, 13 hedefleyebilir bileşiklerin belirlenmesi için ilaç tarama için yararlı olabileceğini düşündürmektedir, kanser kök hücrelerinin oluşumunda rol oynayabilir.
Protocol
1.. EMT indüksiyonu
- Bir su banyosu içerisinde 37 ° C'ye kadar sıcak kültür ortamı. Kullanılan kültür ortamı ilgi hücrelerin standart bir kültür için kullanılan ortam olarak aynıdır. Örneğin, A549 insan akciğer karsinoma hücre çizgisi% 10 cenin sığır serumu ve 2 mM glutamin ile desteklenmiş F12 Kaighn en yetiştirilir.
- Bir ayrışma solüsyonu (örneğin TrypLE Express) kullanarak ilgi Hasat hücreleri.
- Bir 15 ml konik bir tüp içinde önceden ısıtılmış kültür ortamında hücrelerin süspansiyonu.
- 5 dakika boyunca 400 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj.
- Dikkatli bir atık kabı içine dökerek süpernatant kaldırmak.
- Önceden ısıtılmış kültür ortamı içinde hücre pelletini askıya alınması.
- Trypan Mavi kullanarak canlı hücreleri saymak. Hücre süspansiyonunun bir numune alın ve 0.4% Trypan Blue çözeltisi içinde seyreltin. Bir menositometrede seyreltilmiş numunenin 10 ul yerleştirin ve canlı hücreler (mavi açmazlar hücreler) saymak. Hücre d belirlemek için hücre sayıları kullanınçözümde densite.
- Doku kültürü üzerine plaka hücreleri cm2 başına 0.9-1.0 x 10 4 hücre plakaları veya şişeleri tedavi. Örneğin, 0.5 x 10 6 hücre 1X EMT inducing Media Supplement (6 ml ortam 100 mm plaka başına) içeren kültür ortamı içinde, 100 mm levha kaplanmıştır.
- Kültür, 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde hücreleri kaplama. Günlük hücre morfolojisi izleyin.
- Üç gün sonra kaplama, medya kaldırmak ve 1X EMT Endükleyen Medya Desteği içeren taze önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin. Bir 37 ° C /% 5 CO2 inkübatörü içinde kültüre devam edin.
- Beş gün sonra kaplama, hücreler analiz için hazırdır. Hücre morfolojisi ters ışık mikroskobu ile görüntülenmiştir.
2. Immünositokimya Protein İfade Analizi
- % 95 etanol ihtiva eden bir petri lamelleri yerleştirerek bir 24-delikli plaka için steril 12 mm lamelleri hazırlayın. Yavaşça bizden etanol itibaren lamelleri çıkarınBir iğne ve kavisli bir forseps ve alev sterilize ing. Bir 24-yuvalı plakanın bir oyuğuna steril lamel yerleştirin. Kalan lamelleri ile tekrarlayın.
- 1.7 - Bölüm 1.1 'de tarif edildiği gibi hücre süspansiyonu hazırlayın.
- Levha 1.6 x 10 4 hücre / ml 'de 0.5 1X EMT inducing Media Ek içeren önceden ısıtılmış kültür ortamı içinde.
- Büyüme ve bölümlerde 1.9 açıklandığı gibi hücreleri beslemek - 1.11.
- Beş gün sonra kaplama, ortamını çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 300 ul / oyuk içinde% 4 paraformaldehit ile hücreleri düzeltmek.
- Fiksatif çıkarın ve hücreler 1X PBS, 500 ul / kuyu ile 2x durulayın.
- Bloke edici tampon içinde 400 ul / gözenek hücreleri inkübe edin, oda sıcaklığında 1 saat boyunca (% 1 sığır serum albümini (BSA),% 10 normal eşek serumu, 0.3% Triton X-100 içeren PBS 1X).
- Üreticileri de primer antikor içinde inkübe oda sıcaklık 3 saat boyunca bloke etme tampon maddesi içinde de 400 ul / konsantrasyon tavsiyee ya da gece boyunca 4 ° C'de Doğrudan bir florokrom konjuge bir birincil antikor kullanılırken, karanlıkta örnekleri inkübe edin.
- Her yıkama 5 dakika için% 0.1 BSA içeren PBS 1X 500 ul / oyuk içinde hücreler üç kez yıkayın. Doğrudan bir florokrom konjuge bir birincil antikor kullanılırken, 2,12 doğrudan adım devam edin.
- Karanlıkta, oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 1 BSA içeren PBS 1X 400 ul / oyuk içinde üreticinin tavsiye ettiği konsantrasyonunda ikinci bir antikor olarak hücreleri inkübe edin.
- Her yıkama 5 dakika için% 0.1 BSA içeren PBS 1X 500 ul / oyuk içinde hücreler üç kez yıkayın.
- Eğer arzu edilirse, DAPI çözeltisi ile çekirdek counterstain.
- Deiyonize su hücreleri durulayın ve lamelleri montaj medyayı kullanarak bir slayt aşağı yüz montaj.
Representative Results
. T98G glioblastoma hücreleri, HT29 kolon adenokarsinomu hücre: Burada anlatılan EMT uyaran kültür koşulları hücre tiplerinin çeşitli EMT endüksiyonu için güçlü bir yöntem sağlar 1 ve 2, 4, farklı insan hücre çizgileri için bir morfoloji ve markör ifade seviyelerini gösteren Şekil , A549 akciğer karsinoma hücreleri ve MCF10A meme epitelyum hücreleri. Bir Mesenchymal, iğ şeklinde morfolojisi (- 1 H Şekil 1E) için - EMT Endükleyen Medya Desteği ile tedavi edildi hücreler klasik epitel morfolojisi (1D Şekil 1A) değiştirildi. EMT kaynaklı hücreler uyarılmamış hücrelere göre daha az yoğun sıkı koloniler içine paketlenmiş ortaya çıktı. Indüklenmeyen MCF10A örnekleri daha gevşek paketlenmiş hücreleri ile çevrili sıkıca paketlenmiş kümeleri içeriyordu. Bunlar, sıkıca paketlenmiş kümeler (Şekil 2B) E-kadherin pozitif ve EMT inducing Media Suppl ile işlenmesi üzerine ortadanası, (Şekil 2H).
EMT da epitelyal ve mezenkimal işaretleri belirteçlerin yukarı düzenlemesinin baskılanması ile değerlendirildi. E-kadherin ifadesinin aşağı regülasyonu, tipik olarak farklı hücre tipleri 3,4 in EMT uyarılmasını takip görülmektedir 2 muamele edilmemiş hücrelerin çoğunluğunda (Şekil 2A - 2D, kırmızı) E-kaderin yüzey ekspresyonunu gösterir Şekil. Sonra yokluğuna kıyasla EMT indüksiyon (Şekil 2E - 2H, kırmızı). Verilen bir hücre serisi, T98G önce analizini engellemiştir EMT indüksiyon, e-kaderin, son derece düşük bir bazal seviyeye sahip olduğu bulunmuştur. Mezenkimal işaretleyici, Fibronektinin upregülasyonu, EMT Endükleyen Medya Supplement (, - yeşil - 2D Şekiller 2E karşı 2H Şekil 2A) ile indüksiyon sonrası da görünür oldu.
E-kaderin ve fibronektinin ekspresyon seviyeleri, bağışıklık kimyası görülenbundan başka, toplam hücre lizatlarının Batı lekeleme (Şekil 3) ile teyit edilmiştir. Western blot E-kaderin ve immünsitokimya tarafından görülen Fibronektin ifade upregülasyonu infekte doğruladı. Bantlar EMT indüksiyonundan sonra göreli kat değişimi saptamak için dansitometrisi ve GAPDH için normalize kullanılarak nicelleştirilmiştir. E-kadherin seviyeleri, sırasıyla, A549 ve MCF10A hücrelerinde 6.4 ve 3.4 kat azaltılmıştır. Fibronektin seviyeleri, sırasıyla, 4.1 4.6 artmış ve 2.3 T98G kat, A549 ve MCF10A hücreler edilmiştir. Western blot HT29 hücreleri sonrası EMT indüksiyon E-kadherin protein seviyelerinde önemli bir azalma göstermemektedir, ancak sonuçlar, immünositokimya ayırt edilmesi mümkün olan E-kaderin (2F karşı Şekil 2B), yüzey ekspresyonunda bir azalma gösterirler toplam hücre lizatlarının Batı lekeleme.
Ayrıca EMT durum, ek bilinen işaretleyici değerlendirmekEMT s pre-ve post-EMT indüksiyon analiz edildi. Daha önceki sonuçlarla uyumlu olarak, E-kadherin EMT neden olduğunu gösteren, incelenen tüm hücre hatlarında downregüle edildi. Buna ek olarak, mezenkimal belirteçler, Vimentin ve salyangoz, EMT inducing Media Ek ile muamele (Şekil 4), aşağıdaki A549, T98G ve MCF10A hücrelerinde yukarı-regüle edilmiştir. HT29 hücre hattı bu hücreler, EMT indüksiyonu için alternatif yollar kullanmak olduğunu gösteriyor olabilir, (veriler gösterilmemiştir) veya EMT indüksiyonu olmadan ya da bu mezenkimal markerlerin ifadesi göstermemiştir.
TGF-β belirli bir hücredeki EMT oluşturmak için yeterli olan 7,8,9 kapsamları rağmen, diğer hücre tipleri TGF-β 14 ilavesinden sadece yanıt vermez. MCF7 insan meme kanseri hücreleri ve PANC-1 insan pankreas karsinoma hücreleri, hem tek başına 14, sinyalizasyon TGF-β yanıt rapor bulunmaktadır. Her iki satır vitr de EMT geçirebileceği olmadığını belirlemek içino, hücreler EMT inducing Media Ek mevcudiyetinde kültürlenmiştir. Hücreler, EMT inducing Media Ek içindeki bir yoğunlukta tek başına rekombinant TGF-β1 ile uyarıldı. Bu hücrelerde, kontrol hücrelerindekine görülenlere benzer sıkıca paketlenmiş hücre kolonileri (veriler gösterilmemiştir) ve yüzey E-kadherin seviyelerinin edildi oluşan, bunların epitel morfolojisi muhafaza (Şekiller 5C ve 5D, Şekiller 5A ve 5B karşı). Bunun aksine, EMT inducing Media Ek ile uyarılan hücreler yüzey E-kadherin düzeylerinde ciddi bir azalma (Şekil 5E ve 5F) gösterdi. Hücreler daha kompakt hale geldi ve daha mili gibi (veri gösterilmemiştir) gibi bu hücreler, aynı zamanda, daha mezenkimal morfolojisi elde edilmiştir. Bu sonuçlar, burada açıklanan yöntem, EMT uyaran EMT morfolojisi ve TGF-β-i, tipik olarak dirençli hücrelerde markör ifade değişiklikleri teşvik etmek mümkün olduğunu göstermektedirnduced EMT.
Markör ifade ilgili değişimlere ek olarak, mezenkimal hücre özellikli bir geçiş ve işgal etme yeteneğidir. Göç ve üreticinin talimatlarına uygun olarak 96 oyuklu BME Hücre Yayılması Deneyi ile analiz edildi veya EMT inducing Media Ek olmadan kültürlenen hücrelerin istilası. Kısaca, hücreler 8.0 um gözenekli filtre ekler ihtiva eden (50,000 hücre / oyuk) 96 oyuklu plakalar üzerine tohumlandı. 48 saat sonra, geçiş filtreden göç eden hücrelerin boyanması kalsein AM ile değerlendirildi. Her bir numune, benzer sonuçlar ile iki kez, üç kez test edildi. Bir deney Örnek sonuçlar Şekil 6A'da gösterilmektedir. Hücre göçü istatistiksel olarak anlamlı artışlar (P-değeri <0.003) EMT indüksiyonundan sonra hem A549 ve PANC-1 hücreleri ile görüldü. (Örneğin hücre dışı bir matris boyunca göç) işgal bu hücrelerin kabiliyetini değerlendirmek için aynı deney olduBir bazal membran ekstresi kaplı filtre ile gerçekleştirilir. EMT kaynaklı hücre Şekil 6B'de görüldüğü gibi, muamele edilmemiş hücreler ile karşılaştırıldığında işgali yetenekleri arasında istatistiksel olarak anlamlı (p-değeri <0.001) artış gösterdi.
EMT sağlam indüksiyon bu hücrelerde yer alan gen ekspresyon değişiklikler ve sinyal analizi için yararlıdır. Tedavi edilen ve edilmeyen hem hücrelerinden lizatları kullanılarak antikor tabanlı dizi analizi tek bir numunede bulunan moleküllerin çeşitli ekspresyon seviyelerini analiz etmek için bir yöntemdir. Bir örnek olarak, un neden olduğu ve Proteome Profiler İnsan Phospho-MAPK dizisi Kiti kullanılarak MCF7 ve A549 hücreleri, EMT kaynaklı gelen lizatlarda fosforile edilmiş MAPK aile üyelerinin seviyeleri analiz edilmiştir. Dizi benzer sonuçlar ile bağımsız EMT-indüksiyon tedavileri iki kez çalıştırıldı. 7. bir dizi temsilci verileri göstermektedir. Her iki hücre tipi CREB (S133) artan fosforilasyonunu sergiledi, ERK1 (T2 02/Y204) ve EMT kaynaklı hücrelerinde ERK2 (T185/Y187) kontrol ile karşılaştırıldığında. Sinyal olayları farklar hem de iki hücre tipleri arasında gözlenmiştir. MCF7 hücreleri, artan p70S6K (T421/S424) fosforilasyon göstermiştir ve fosforilasyon ise A549 hücreleri, GSK-3 β (S9) fosforilasyon bir artış göstermiştir.
Şekil 1. EMT inducing Media Ek ile uyarıldıktan sonra mezenkimal morfolojisi indüksiyon (A - D). Dört hücre tiplerinde epitel morfolojisi EMT inducing Media Ek olmayan, standart kültür ortamı içinde, 5 gün boyunca kültür, aşağıdaki gösterilen (E - H). Mezenkimal morfolojisi Dört hücre tipleri, 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek ile kültüre gösterdi.
Şekil 2. Epitel işaretleyici ifade ve EMT kaynaklı hücrelerinde mezenkimal markör ifadesinin yukarı regülasyonu downregülasyonu. Hücreler epitel işaretleyici, E-kadherin (kırmızı) ekspresyonunu tespit etmek için bağışıklık ile boyandı ve mezenkimal işaretleyici, Fibronektin (yeşil). (A - D) 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek olmadan kültürlenmiş kontrol hücreleri (E -. H), 5 gün için EMT inducing Media Ek ile kültürlenen hücreler. Tüm hücreler DAPI (mavi) ile ters.
Şekil 3,. Western blot An ile epitelyal ve mezenkimal markör ifade teyidi . (-) 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek dört hücre tipleri toplam hücre lizatlarının Western blot alysis (EMT) ile ya da olmadan muamele edilmiş olduğuna işaret etmektedir. Solda gösterildiği gibi E-kaderin, Fibronektin ve GAPDH yükleme kontrolü için Gruplar bulunmaktadır. Sağdaki gösterildiği gibi boyut işaretleyici olarak kullanılabilir.
Şekil 4. Mezenkimal belirteçler, EMT kaynaklı hücrelerinde vimentin ve salyangoz yukarı regülasyonu. Hücreler epitel işaretleyici, E-kadherin (gri) ifadesini tespit etmek için renkli bağışıklık ile boyandı ve mezenkimal belirteçleri, Vimentin (yeşil) ve salyangoz (kırmızı) . (A - C) 5 gün boyunca EMT inducing Media takviyesi olmadan kültürlenmiş kontrol hücreleri. (D - C) 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek ile kültürlenen hücreler.
Şekil 5,. 5 gün boyunca, TGF-β1 10 ng / ml ihtiva eden ortam içinde kültürlendi, 5 gün boyunca tek başına ortam ile kültürlenmiştir TGF-β1 duyarlı olmayan hücrelerde EMT indüksiyonu. (A ve B) Hücreleri. (C ve D) hücreler. (E ve 5 gün boyunca EMT inducing Media Ek olarak kültür F) hücreler. Tüm hücreler, E-kadherin ifadesi (kırmızı) için boyandı ve DAPI (mavi) ile karşı edilir.
Şekil 6,. EMT kaynaklı hücre göçü ve yayılması kapasitelerini artmıştır. 48 saat için inkübe edildikten sonra bir 8 um gözenekli filtreden geçirilmiş hücre A. ortalama sayısı. B. ortalama sayısı48 saat için kuluçkalamadan sonra, bazal membran ekstresi ile kaplanmış bir 8 um gözenek filtresi üzerinden işgal mümkün hücreleri. Hata çubukları 3 tüpler üzerine standart sapmayı göstermektedir.
EMT indüksiyon Şekil 7. Antikor-tabanlı dizi ekspresyon analizi. A549 (A ve C) gelen lizatlar ile veya EMT inducing Media Ek olmadan kültürlenmiş MCF7 (B ve D) hücreler Proteome Profiler İnsan Phospho-MAPK dizisi Kiti kullanılarak dizi analizi için kullanıldı. Noktalar A vurgulanır ve B sonra densitometrisi sayıldı. Un-uyarılan EMT kaynaklı lizatlarının karşılaştırmalar (C ve D), aşağıda gelen çubuk grafiklerde gösterilmektedir. büyük rakam <görmek için buraya tıklayın/ A>.
Discussion
EMT indüksiyonu için önceki yöntemleri genel olarak TGF-β uyarılmasını ya da genetik modifikasyon kullandık. Tek başına TGF-β bazı hücre tiplerinde EMT uyarılması için gösterilmiş olmakla birlikte, şimdi TGF-β EMT için gerekli olduğu gösterilmiştir, ancak, tüm hücre tipleri 6,14 yeterli değildir. EMT indüksiyonu için genetik modifikasyonu kullanılarak, zaman alıcı ve emek yoğundur. Burada anlatılan bir yöntem olup, anti-insan E-kadherin, anti-insan sFRP-1, anti-insan DKK-1, yeniden birleştirici insan Wnt-5a, ve güvenilir EMT uyarılması için rekombinant insan TGF-β1 gibi faktörlerin bir kombinasyonunu kullanır. Bu faktörler kombinasyonu E-kadherin-tabanlı yapışma, EMT indüksiyon 4 için kritik bir adım engellemek için tasarlanmıştır ve Wnt-5a protein ekleme hem de Wnt inhibitörlerine karşı bloke edici antikorlar kullanılarak Wnt sinyal geliştirmek olup, sFRP-1 ile Dkk -1. Wnt ve TGF-β sinyal mezenkimal hücre, stat indüklemek ve korumak için bir otokrin döngüsüne hareket gösterilmiştire 6. Bu indüksiyon yöntem genetik manipülasyon ortadan kaldırır ve tek başına TGF-β ile daha etkilidir. Daha da önemlisi, daha önce (Şekil 5) 14 TGF-β uyarıya yanıt için değil sadece gösterilmiştir MCF7 ve PANC-1 hücreleri de dahil olmak üzere, hücre tiplerinde EMT indüksiyonu gözlemlemek mümkün bulunmaktadır.
EMT inducing Media Supplement göstermek daha az kompakt ve daha yüksek iğ şeklindeki morfoloji (Şekil 1) ile muamele edilmiş hücreler. Buna ek olarak, EMT (Şekil 2 ve 3) belirgin özelliğidir Fibronektin ifadesinde bir artış olan bir yüzey E-kadherin ifade eş zamanlı bir azalma vardır. Örneğin vimentin ve salyangoz gibi ek işaretçileri de mezenkimal uyarılmamış kontrol ile karşılaştırıldığında, EMT neden hücreleri (Şekil 4) yukarı-regüle edilmiştir. Artan göç ve istila yetenekleri mezenkimal hücrelerin ana fonksiyonel özellikleri vardır. In vitro olarak (Şekil 6) ve geçiş işgal belirgin bir şekilde artan bir kapasitenin mevcudiyeti gösterdi.
Şekil 7 'de gösterilen bir dizi antikor ekspresyon verileri kullanarak gösterildiği gibi, EMT indüksiyonu için bu basit yöntem, EMT sinyallemesinin çalışma için yararlıdır. Farklı hücre tipleri bu gibi fosforilli CREB artış ve MCF7 ve A549 EMT kaynaklı hücreler hem de görülen ERK1 / 2 olarak EMT ilişkili ortak sentezleme imza elde etmek için ön-ve post-EMT indüksiyonu karşılaştırılabilir. CREB S133 fosforilasyonu bağlanma DNA uyarır ve TGF-β1 kaynaklı EMT 15 aşağı hareket gösterilmiştir. ERK1 / 2 fosforilasyonunun da TGF-β1 kaynaklı EMT 16 aşağı hareket gösterilmiştir. P70S6 karşı A549 hücrelerinde GSK-3β fosforilasyonundaki artışı ile görüldüğü gibi hücre tipleri arasında sinyal yollarının farklılıklar da izah edilebilirMCF7 K fosforilasyon. Serin 9 da GSK-3β fosforilasyon de fonksiyon azalır ve GSK-3β pro-EMT transkripsiyon faktörü, salyangoz 17 inhibe ettiği gösterilmiştir. Bunun aksine, p70S6K Salyangoz aktivitesi neden olur ve bu da fosforilasyonun, bu proteinin 18 aktivasyonu ile ilişkilidir.
Genel olarak, özellikle de daha önce sadece TGF-β cevap gösterilmemiştir hücrelerinde EMT, ve basit ve güvenilir bir indüksiyon, EMT biyolojisini anlama prognoz markerleri olarak kullanımı için ortak sentezleme imzalar belirlenmesi ve kanser için yeni terapötik maddelerin geliştirilmesi ve değerlendirilmesi için yararlı ve fibrotik hastalık.
Disclosures
R & D Systems, Inc, kâr amacı gütmeyen, kamu şirketidir.
Üretim ve bu yazıda Ücretsiz Erişim R & D Systems, Inc tarafından desteklenmektedir
Acknowledgments
Yazarlar yararlı tartışma ve el yazması gözden Julia Hatler ve Martin Ramsden (R & D Systems) kabul etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Epithelial cells of interest | We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1 | ||
| EMT Inducing Media Supplement | R&D Systems | CCM017 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | R&D Systems | 240-B | Used at 10ng/ml |
| Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody | R&D Systems | NL648R | Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry |
| Anti-E-Cadherin | R&D Systems | MAB1838 | Used at 0.1 μg/ml for western blotting |
| Anti-Fibronectin | R&D Systems | MAB1918 | Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting |
| Anti-GAPDH | R&D Systems | AF5718 | Used at 0.2 μg/ml for western blotting |
| Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody | R&D Systems | NL009 | Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry |
| Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody | R&D Systems | HAF109 | Used at 1:2000 for western blotting |
| Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody | R&D Systems | HAF007 | Used at 1:2000 for western blotting |
| EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit | R&D Systems | SC026 | Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail. |
| 96 Well BME Cell Invasion Assay | R&D Systems | 3455-096-K | This kit was used according to the manufacturer's recommendations. |
| Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit | R&D Systems | ARY002B | This kit was used according to the manufacturer's recommendations19. |
| Mounting Media | R&D Systems | CTS011 | |
| 0.4% Trypan Blue Solution | Life Technologies | 15350-061 | |
| 1X Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
| 95% Ethanol | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A3311 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Triton-X-100 | Roche Molecular Biochemicals | 789-704 | Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration. |
| DAPI Solution | Sigma | D9542 | Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS. |
| Fine pointed curved forceps | Thermo-Fisher Scientific | 08-875 | |
| 12 mm coverslips | Carolina Biological | 633009 | |
| Nonfat dry milk | Used at 5% in TBST for blocking in western blotting | ||
| TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20] | For western blotting blocking and washing | ||
| PVDF Membrane | For western blotting | ||
| 4-20% SDS-page gel | For western blotting | ||
| ECL substrate | For western blotting | ||
| 15 ml conical tubes | |||
| Plates/flasks, tissue culture treated | |||
| 24-well plates, tissue culture treated | |||
| Pipettes / pipette tips | |||
| Pipet Aid / pipets | |||
| Hemocytometer | |||
| 37 °C Water Bath | |||
| 37 °C/5%CO2 Incubator | |||
| Centrifuge | |||
| Inverted light microscope | |||
| Fluorescence microscope |
References
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. Journal of Clinical Investigation. 119, 1420-1428 (2009).
- Thiery, J. P. Epithelial-mesenchymal transitions in tumour progression. Nature Reviews Cancer. 2, 442-454 (2002).
- Heuberger, J., Birchmeier, W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2, 1-23 (2010).
- Onder, T. T. Loss of E-cadherin promotes metastasis via multiple downstream transcriptional pathways. Cancer Research. 68, 3645-3654 (2008).
- Tian, X. E-cadherin/β-catenin complex and the epithelial barrier. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 1-6 (2011).
- Scheel, C. Paracrine and autocrine signals induce and maintain mesenchymal and stem cell states in the breast. Cell. 145, 926-940 (2011).
- Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-β-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Research. 19, 156-172 (2009).
- Kasai, H. TGF-β1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition. EMT). Respiratory Research. 6, 56-70 (2005).
- Miettinen, P. J., et al. TGF-β induced transdifferentiation of mammary epithelial cells to mesenchymal cells: involvement of type I receptors. Journal of Cell Biology. 127, 2021-2036 (1994).
- Pelton, R. W., et al. Differential expression of genes encoding TGFs β1, β2, and β3 during murine palate formation. Dev. Biol. 141, 456-460 (1990).
- Taube, J. H. Core epithelial-to-mesenchymal transition interactome gene-expression signature is associated with claudin-low and metaplastic breast cancer subtypes. PNAS. 107, 15449-15454 (2010).
- Roussos, E. T., et al. AACR special conference on epithelial-mesenchymal transition and cancer progression and treatment. Cancer Research. 70, 7360-7364 (2010).
- Polyak, K., Weinberg, R. A. Transitions between epithelial and mesenchymal states: acquisition of malignant and stem cell traits. Nature Reviews Cancer. 9, 265-273 (2009).
- Brown, K. A. Induction by transforming growth factor-β1 of epithelial to mesenchymal transition is a rare event in vitro. Breast Cancer Research. 6, 215-231 (2004).
- De Falco, V., et al. CD44 proteolysis increases CREB phosphorylation and sustains proliferation of thyroid cancer cells. Cancer Research. 72, 1449-1458 (2012).
- Xie, L. Activation of the Erk pathway is required for TGF-β1-induced EMT in vitro. Neoplasia. 6, 603-610 (2004).
- Bachelder, R. E., et al. Glycogen synthase kinase-3 is an endogenous inhibitor of Snail transcription: implication for the epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cell Biology. 168, 29-33 (2005).
- Pon, Y. L. p70 S6 kinase promotes epithelial to mesenchymal transition through Snail induction in ovarian cancer cells. Cancer Research. 68, 6524-6532 (2008).
- Wegner, G. J., et al. Profiling changes in receptor tyrosine kinase phosphorylation using antibody arrays. J. Vis. Exp. , (2012).
