Summary
Il sistema qui descritto impiega una trappola ottica tradizionale e una linea intrappolamento ottico olografico indipendente, capace di creare e manipolazione di più trappole. Questo consente la creazione di complessi arrangiamenti geometrici di particelle di rifrazione e che permetta ad alta velocità misurazioni simultanee, ad alta risoluzione della attività degli enzimi biologici.
Abstract
Sistemi microscopio ad alta risoluzione con trappole ottiche consentono di intervenire precisa di vari oggetti rifrazione, come dielettrici perline uno o organelli cellulari 2,3, nonché per lettura ad alta risoluzione spaziale e temporale della loro posizione rispetto al centro della trappola. Il sistema qui descritto presenta uno di tali "tradizionale" trappola operante a 980 nm. Esso fornisce inoltre un secondo sistema intrappolamento ottico che utilizza un pacchetto olografico disponibile in commercio per creare e manipolare simultaneamente schemi di cattura complessi nel campo visivo del microscopio a 4,5 ad una lunghezza d'onda di 1064 nm. La combinazione dei due sistemi permette la manipolazione di oggetti multipli refrattivi allo stesso tempo mentre condurre simultaneamente misure ad alta risoluzione di moto e di produzione di forza a scala nanometrica e piconewton alta velocità e.
Introduction
Intrappolamento ottico è una delle tecniche chiave in biofisica 6. Un avanzamento cruciale intrappolamento ottico è stato lo sviluppo di trappole olografici che consentono la creazione di modelli di intrappolamento tridimensionali anziché trappole point convenzionali 7. Queste trappole olografiche possiedono il vantaggio di versatilità nel posizionamento di oggetti rifrazione. Tuttavia trappole convenzionali possono essere facilmente allineate per essere più simmetrica rispetto commercialmente disponibili kit olografiche. Permettono anche per un veloce monitoraggio preciso degli oggetti intrappolati. Qui si descrive un sistema (Figura 1) che combina i due approcci di cattura in un apparecchio e permette all'utente di sfruttare i vantaggi di entrambi come appropriato.
Le considerazioni generali di costruzione di trappole ottiche (sulla base di fasci laser singole o multiple) sono discussi in dettaglio altrove 8-10. Qui, delineare le considerazioni specifiche per il nostro setup e fornire i dettagli della nostra procedura di allineamento. Per esempio, i sistemi con due fasci intrappolamento ottico sono state descritte in precedenza (es. rif. 11), tipicamente utilizzando un raggio laser per intrappolare un oggetto di rifrazione e utilizzando l'altro (fascio potenza volutamente basso) per la lettura disaccoppiato della posizione dell'oggetto intrappolato . Qui tuttavia, entrambi i fasci laser devono essere ad alta potenza (300 mW o superiore) perché entrambi sono da utilizzare per la cattura. Per misurazioni di sistemi biologici, i laser utilizzati per intrappolare dovrebbero rientrare in modo ottimale all'interno di una specifica finestra NIR di lunghezza d'onda per ridurre al minimo la degradazione proteica indotta luce 1. Qui abbiamo scelto di usare 980 nm diodo e 1064 nm laser DPSS a causa del loro basso costo, alta disponibilità e facilità di funzionamento.
Abbiamo anche scelto di utilizzare un modulatore spaziale di luce (SLM) per creare e manipolare più trappole contemporaneamente in tempo reale 4,5. Questi dispositivi sono disponibili in commerciotuttavia la loro integrazione in un setup completo rappresenta una sfida unica. Qui si descrive un approccio pratico che affronta queste potenziali difficoltà e fornisce uno strumento estremamente versatile. Forniamo un esempio esplicito per il setup specifico descritto che può essere utilizzato come guida per i disegni modificati.
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Protocol
1. Installazione di 980 nm Lunghezza d'onda singola trappola ottica
- Intrappolamento ottico a 980 nm di lunghezza d'onda è spesso ottimale sono facilmente disponibili con potenza di uscita alto come 300 mW esperimenti di biofisica e diodi laser poco costoso. È preferibile per un laser a diodi ad essere Pigtailed con polarizzazione-preserving fibra monomodale con un diametro del campo modalità noto. La fibra deve essere sufficientemente lungo per agire come filtro modalità e tipicamente è terminato sia con FC / PC o connettore FC / APC. Di questi, FC / APC è preferibile per minimizzare riflessione posteriore di instabilità di feedback chiari e potenziali.
- Fissare il 980 nm diodo laser in un supporto che permette di potere e di controllo della temperatura. E 'meglio per risolvere il mount di un tavolo ottico direttamente a massimizzare passiva affondamento di calore e quindi ridurre al minimo il pericolo di fallimento diodo a causa di un malfunzionamento del regolatore di temperatura.
- Montare il connettore in fibra PC / APC per le ottiche collimanti fascio. Èfondamentale per assicurare che il fascio collimato è minimo di divergenza così porte in fibra regolabili sono più utili. Assicurarsi che la porta a fibre ottiche scelto corrisponde al diametro del campo modalità della fibra codino diodo. Se il fascio deve essere rastered utilizzando deflettori acusto-ottica (AOD) o deflettori elettro-ottici (EOD) allora la vita di fascio laser collimato deve essere leggermente inferiore alla dimensione dell'apertura deflettore.
- Fissare l'adattatore di collimazione al tavolo ottico ad una distanza sufficiente dal microscopio per consentire la trave di routing, l'espansione e il posizionamento di altri componenti desiderati. Regolare la porta in fibra di assicurare coerenza vita trave su distanze paragonabili al percorso complessivo del fascio al microscopio.
- Installare specchi indicate in Figura 1. Rimuovere l'obiettivo dal microscopio e utilizzare gli specchi per indirizzare il fascio attraverso l'apertura nella fase di montaggio obiettivo. Se preferito, il posizionamento degli specchi dicroici DM1 e DM3 può essere omesso finosuccessivamente. DM2 e DM3 sono entrambi shortpass e trasmissione della luce visibile, mentre riflettendo vicino IR e sopra.
- È utile temporaneamente montare un puntatore laser rosso al posto dell'obiettivo, allineato sull'asse ottico del microscopio. Un adattatore meccanico personalizzato è necessario per assicurare la centratura del puntatore laser. Raggio visibile dal puntatore laser può quindi essere instradato indietro al centro dell'apertura della porta fibra e può quindi essere utilizzato per installare le lenti (vedi sotto).
- Installare il 980 nm beam expander (L8 e L9) a debita distanza dal porto di fibra per consentire futuro inserimento dei componenti dello sterzo (AOD o EOD), se necessario 1. Il raggio estesa deve leggermente riempire troppo il diaframma focale posteriore dell'obiettivo. (Qui, obiettivi con lunghezze focali di 125 mm e 60 mm sono in una disposizione kepleriano di raddoppiare circa la vita del fascio). Utilizzare visibile fascio laser pointer (vedi sezione 1.6) per garantire il posizionamento della lente corretta e l'allineamento approssimativo.
- Install le lenti dello sterzo 980 nm (L2 e L3) in una disposizione telescopio come indicato (qui entrambi hanno 60 mm di focale) 1. L3 è montato in un piano coniugato al piano di back-focale dell'obiettivo. Monte L3 su un palco di posizionamento di precisione XYZ per consentire orientamento del fascio. E 'utile per la fase di XYZ disporre di indicatori digitali per le sue micrometri, permettendo il posizionamento ripetibile e riposizionamento della trappola. La "gamma di viaggi 0.5 è in genere sufficiente, tuttavia più viaggi per il posizionamento L3 lungo l'asse ottico può essere utile. Usa puntatore laser visibile (vedi sezione 1.6) per garantire il posizionamento della lente corretta e l'allineamento approssimativo.
2. Installazione del rivelatore del laser
- Installare il specchio dicroico DM3 sopra del condensatore, come mostrato in Figura 1. Un supporto personalizzato è in genere necessaria. Fissare il fotodiodo quad (QPD) o un rivelatore sensibile alla posizione (PSD) 8 al lato del gruppo condensatore e ensure che la 980 nm raggio laser riflesso da DM3 sta colpendo è all'incirca sul centro. Quando si utilizza QPD, assicurarsi che sia montato su un piccolo palco XY per consentire un corretto centraggio del sensore sul raggio laser.
- Installare L1 (tipicamente una lente 30 mm) tra DM3 e il sensore. Posizione L1 in modo da concentrare il fascio di una sola macchia sul sensore.
- Installare il filtro notch poco prima di L1 per bloccare il fascio di 1.064 nm, nonché degli eventuali randagi riflessi di luce visibile dal illuminatore microscopio e illuminazione ambientale.
3. Installazione di 1.064 nm Holographic Trappola
- La parte olografica del setup è costruito intorno a un pacchetto hardware / software disponibile in commercio Gli specchi olografici usati in questo pacchetto sono tarati ad una potenza massima di incidente di 5 o 10 W / cm 2. Monomodali TEM00 travi di questa gamma di potenza possono essere facilmente acquistati da un laser DPSS a 1.064 nm di lunghezza d'onda.
- Montare il laser 1064 nm su un elevatopiattaforma che corrisponda approssimativamente l'altezza del percorso del fascio per la linea 980 (vedere sezione 1).
- Se non direttamente controllabile, potenza del laser può essere regolata manualmente mediante l'installazione di una piastra semi onda (HWP) e un polarizzatore (PBS) a destra dopo diaframma uscita laser. È utile per montare il polarizzatore in una fase rotante per poter abbinare requisito specchio olografico per la polarizzazione del fascio.
- Installare il 1.064 nm beam expander (L6 e L7). La vita di fascio laser deve essere ampliato in base alle dimensioni diagonale dello specchio olografico. Per grandi rapporti di espansione (sopra 10X) può essere una preoccupazione di mantenere la dimensione dell'espansore piccola. Così può essere desiderabile utilizzare lenti con insolitamente piccola lunghezza focale (qui: 16 mm e 175 mm).
- Installare gli altri mirror, come indicato di dirigere il fascio di 1.064 nm attraverso l'obiettivo.
- Sicuro DM1 dicroico (45 ° angolo di incidenza) in un supporto cinematico e posizionare il gruppo nel percorso del raggio 980 nm in modo che permette di undiminished trasmissione di tale trave.
- Attiva luce puntatore laser. Lo specchio DM1 dovrebbe riflettere sufficiente quantità di luce visibile per posizionare correttamente il modulatore spaziale di luce (SLM) nel percorso di questa trave. L'SLM deve anche essere inclinate in modo che i raggi laser in entrata e in uscita sono il più vicino possibile incidenza normale. Tuttavia l'angolo di incidenza, deve essere sufficientemente grande da garantire che il raggio laser non è troncato da monta lente e altri componenti ottici. Un angolo di 5 ° deve essere facilmente raggiungibile ed è sufficientemente piccolo. La distanza tra DM1 alla SLM deve essere accuratamente misurata in modo che l'inserimento di lenti L4 e L5 (vedi 3.6) può coniugare piano di riflessione SLM e il piano focale posteriore dell'obiettivo.
- Installare uno specchio per dirigere la luce da 1.064 nm beam expander al SLM. Assicurarsi che la luce puntatore laser colpisce l'espansore apertura del fascio sul centro.
- Installare lenti L4 e L5 (qui: lenti con 125 millimetri e 200 mm rispettivamente). Questa coppia telescopio coniuga il piano di riflessione SLM al piano focale posteriore dell'obiettivo e riduce anche il punto vita trave a solo leggermente riempire eccessivamente l'apertura posteriore dell'obiettivo. Abbiamo scelto obiettivi con lunghezze focali lunghe per lo spazio della SLM lontano da DM1. Questo cancella non solo spazio per la seconda linea di laser, ma tende anche a rendere più facile l'allineamento.
- Rimuovere il puntatore laser. Lasciare l'adattatore di montaggio per servire come apertura allineamento grossolano.
4. Sistema di installazione e allineamento Note
- Lente L3 e SLM devono essere posizionati in modo da essere otticamente coniugata al piano focale posteriore dell'obiettivo. Il punto focale comune di L4 e L5 è otticamente coniugata al piano campione se i fasci ottici di cattura sono iniettati nello spazio infinito del microscopio.
- cantare scheda visore IR allineare il fascio 980 nm per andare lungo l'asse centrale del diaframma nell'adattatore puntatore laser.
- Utilizzare carta di IR to Assicurarsi che il fascio 1.064 nm colpisce lo stesso punto come il raggio 980 nm su DM1, L2 e L3 e che il fascio 1.064 nm va lungo l'asse centro dell'apertura nell'adattatore puntatore laser.
- Sostituire l'adattatore di montaggio puntatore laser con un obiettivo. Obiettivo olio o acqua ad alta apertura numerica è tipica.
- Allineare la trappola nm 980, come descritto in 9 per "camminare" il raggio laser fino a quando una figura di interferenza radiale simmetrico è visto sulla fotocamera.
- Con l'olografico specchio off (cioè agisce come uno specchio passivo) utilizzare SLM e DM1 a "camminare" il undiffracted 1.064 fascio nm per allineare la trappola nm 1.064.
- Il SLM produce un significativo fascio undiffracted che si traduce in un forte trappola laser inamovibile nel campo di vista. Questo è utile per allineamento ma può essere indesiderabile per esperimenti. Bloccare questa trappola si può inserire un oggetto opaco piccola nel percorso della luce undiffracted nella posizione coniugato al piano del campione (ad es the punto focale comune di L4 e L5). La dimensione di questa macchia bloccante centrale deve essere in qualche modo più grande del diametro del disco di Airy per la luce concentrata (un bloccante con 100-300 micron di diametro per il sistema descritto).
- egolare 1.064 nm polarizzazione del fascio utilizzando il polarizzatore per abbinare l'orientamento SLM. Ruotare la piastra semionda per impostare la potenza del fascio di uscita come desiderato.
- Se lo si desidera, inserire EOD fascio elementi sterzanti AOD o nella linea di laser a 980 nm. Garantire la corretta coniugazione di questi elementi al piano di back-focale dell'obiettivo e riallineare la trappola. E 'utile per montare gli organi di sterzo su un palcoscenico goniometrica.
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Representative Results
La configurazione assemblata permette all'operatore di intrappolare più oggetti rifrazione in tempo reale e posizionarli in tre dimensioni all'interno del campo di vista. Illustriamo le capacità olografiche dello strumento intrappolando 11 microsfere (Figura 2). La trappola confinare ogni oggetto è ricreare manualmente posizionato su di intrappolare in modo che la disposizione finale raffigura il logo della University of Utah, dove è stato eseguito questo esperimento. Una funzione combinata di trappola olografica e convenzionali è mostrato in Figura 3. La trappola convenzionale muove centrale tallone progressivamente più veloce (velocità di trappola di 1,3, 10 e 82 micron / sec sono visualizzate), mentre le trappole olograficamente definiti rimangono stazionari. Alla massima velocità, l'intero moto del tallone si verifica durante la registrazione di un fotogramma video e appare quindi come sfocatura movimento estremo. È possibile spostare la trappola convenzionale abbastanza veloce che le microsfere sono costretti dal potenziale intrappolamento da hydrodynamic trascinamento (non mostrato).
Si noti che l'assemblaggio di forme complesse utilizzando più microsfere può portare ad un caso in cui il numero di microsfere nel campo di vista è insufficiente per intero assemblaggio (come è evidente nella figura 2). In tali casi, l'operatore deve spostare fisicamente il campo di vista rispetto al campione (cioè riposizionare la fase del campione nel microscopio) per esporre ulteriori microsfere mantenendo gli oggetti già intrappolati.
Figura 1. Schematica del sistema microscopio ad alta risoluzione con due fasci di cattura. Componenti etichettati L1-L9 sono lenti di base. Componenti etichettati DM1-DM3 sono specchi dicroici. Lenti L2 e L3 sono utilizzati per sterzo. Lenti L4 L5 e agire come un beam riduttore e distanziale. Lenti L6/L7 e L8/L9 sono coppie espansore del fascio per i rispettivi fasci laser. Componenti senza etichetta viene dipinto come solidi rettangoli neri sono specchi di base. Componenti dotati di marchio MC e MO sono il condensatore microscopio e oggetto, rispettivamente. Altri componenti sono un fotodiodo quad (QPD), filtro notch (NF), Peltier stadio regolatore di temperatura (PTC), filtro caldo (HF), modulatore spaziale luce (SLM), acustoottico deflettore (AOD), persiane (S1 e S2), piastra di semionda (HWP) e polarizzatore beam splitter (PBS).
Figura 2. A disposizione spaziale che rappresenta un logo Università di Utah è realizzato con 11 operatori trappole olografiche definiti e controllati. Gli oggetti intrappolati sono perle di rifrazione (vedere Tabella dei materiali per più details) sospeso in acqua deionizzata. Cerchi rossi e verdi mostrano le posizioni trappola. Cornici (a) - (f) rappresentano fasi successive in costruzione logo.
Figura 3. Due file di trappole sono fatte usando 6 operatore trappole olografiche definiti e controllati. Una trappola convenzionale aggiuntiva è definita tra le due righe e la sua posizione viene regolata a varie velocità come indicato. Il tallone viene spostato in uno spostamento spaziale massima di 4,1 micron e poi di nuovo alla posizione originale. Un video di movimento tallone viene registrato a 47 fps. Come speed trap riposizionamento è aumentata, progressivamente più grandi motion blur si osserva nel video. Gli oggetti intrappolati sono perle di rifrazione (vedere Tabella dei Materiali per maggiori dettagli) sospese in acqua deionizzata. Frame tempi sono indicati in rosso. Trappola velocità riposizionamento è mostrato per ogni riga. Scala barre verdi corrispondono a 5 micron in ogni direzione.
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Discussion
Abbiamo costruito uno strumento che combina due trappole ottiche di tipo diverso (Figura 1) per fornire strutture trapping separate per manipolazione di oggetti e misura. La trappola ottica "convenzionale" è costruito intorno a un laser a diodo 980 nm. Questo fascio viene espanso, guidato e poi iniettato nel nostro microscopio invertito ("luce rossa" trave in Figura 1). La trappola ottica olografica è costruito intorno a un nm DPSS laser a 1.064. Il fascio viene espanso per adattarsi alle dimensioni del modulatore spaziale di luce (SLM), riflesso dalla SLM a basso angolo di incidenza, ridotto a riempire troppo leggermente l'apertura posteriore focale dell'obiettivo, combinata con la linea trapping "convenzionale" usando un dicroico specchio, e infine iniettato nella nostra microscopio ("rosso scuro" trave in Figura 1). Notare che il SLM deve essere collocato in un piano che è otticamente coniugare al piano focale posteriore dell'obiettivo.
Nel protoCol sezione, si descrivono le considerazioni di progettazione e di allineamento che ci permettono di ridurre al minimo ingombro spaziale della configurazione e ancora permetterci relativamente facile costruzione. Abbiamo anche descrivono il blocco della componente undiffracted prodotto dalla SLM, che può essere necessario per un pacchetto commerciale come il sistema usato qui, ma è un po 'impegnativo e ad oggi scarsamente documentata.
Il progetto qui descritto è altamente personalizzabile. Abbiamo incluso brevi citazioni di diverse personalizzazioni popolari di alto livello per le trappole ottiche e come si potrebbe integrare quelli in nostro design. Per esempio, una singola trappola può essere governata in diversi modi, tra cui deflettori acustico-ottico (AOD), deflettori elettro-ottici (EOD) 12, mobili o riflettori deformabili o semplicemente rastering la lente di sterzo (L3 nel nostro setup) 1. Analogamente, la posizione di un oggetto intrappolato può essere determinato utilizzando molti schemi e sensori. In tali casi, la disposizione tipica e allinearezione di componenti rilevanti è descritto brevemente. Ci aspettiamo che questo lavoro può fornire un modello per i disegni più complessi in futuro.
Diverse considerazioni pratiche e limitazioni d'uso sono di nota. Primo, le trappole ottiche non devono essere posizionati troppo vicini tra loro in modo da non interferire con le loro interessanti potenzialità vicino centro trappola. Se è necessario chiudere posizionamento di due trappole, allora è possibile definire una trappola linea che collega i due punti in modo che il potenziale attrattivo della trappola si estende lungo tutta la linea. Un altro aspetto pratico è che gli oggetti intrappolati non possono essere spostati in modo veloce che essi sperimentano eccessiva resistenza idrodinamica (la soglia esatta dipende forza trap) altrimenti la resistenza può spingere gli oggetti fuori dalla trappola.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Finanziamento è stato fornito dalla University of Utah. Vorremmo ringraziare il Dott. J. Xu (UC Merced) e il Dr. Reddy BJN (UC Irvine) per le discussioni utili.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Optical table | Newport corporation | ST-UT2-56-8 | Irvine, CA |
| Microscope, Inverted, Eclipse Ti | Nikon USA | MEA53220 | Melville, NY |
| Plan apo 100X oil objective (1.4 NA) | Nikon USA | MRD01901 | Melville, NY |
| Oil condenser Lens 1.4 NA | Nikon USA | MEL41410 | Melville, NY |
| EMCCD camera | Andor technology USA | Ixon DU897 | South Windsor, CT |
| 1/3" CCD IEEE1394 camera | NET USA Inc | Foculus FO124SC | Highland IN |
| Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength | Klastech Laser Technologies | Senza-1064-1000 | Dortmund; Germany |
| laser diode, TEM00, SLM, 980 nm | Axcel Photonics | BF-979-0300-P5A | Marlborough, MA |
| laser diode mount | ILX Lightwave | LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984 | Bozeman, MT |
| adjustable fiber ports | Thorlabs | PAF-X-11-B | Newton, NJ |
| holographic system | Arryx | HOTKIT-ADV-1064 | Chicago, IL |
| holographic mirror | Boulder Non-linear Systems | this is a part of HOTKIT-ADV-1064 | Lafayette, CO |
| Calcite polarizer | Thorlabs | GL10-B | Newton, NJ |
| half-wave plate | Thorlabs | WPH05M-1064 | Newton, NJ |
| Polarizer rotation mount | Thorlabs | PRM1 | Newton, NJ |
| half-wave plate rotation mount | Thorlabs | RSP1 | Newton, NJ |
| Shutter | Thorlabs | SH05 | Newton, NJ |
| dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI | Chroma Technology | t750spxrxt | Bellows Falls, VT |
| dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI | Thorlabs | DMSP1000R | Newton, NJ |
| custom mechanical adapter | Thorlabs | SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore | Newton, NJ |
| notch filter | Semrock | FF01-850/310-25 | Rochester, NY |
| Acousto-Optic deflector (2-axis) | intraAction | DTD-584CA28 | Bellwood, IL |
| goniometric stage | New Focus | 9081 | Santa Clara, CA |
| 60 mm steering lenses | Thorlabs | LA1134-B | Newton, NJ |
| 16 mm aspherical expander lens | Thorlabs | AC080-016-C | Newton, NJ |
| 175 mm expander lens | Thorlabs | LA1229-C | Newton, NJ |
| Spot blocker (cabron-steel sphere) | Bal-Tec | 0.0100" diameter | Los Angeles, CA |
| Microspheres (Carboxyl-polystyrene) | Spherotech | CP-45-10 | Lake Forest, IL |
References
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