Konstruktion av en högupplöst mikroskop med konventionella och holografiskt optiskt fångstmetoder Capabilities

Summary

Den här beskrivna systemet utnyttjar en traditionell optisk fälla samt en oberoende holografisk optisk fångstmetoder linje, kan skapa och manipulera flera fällor. Detta möjliggör skapandet av komplexa geometriska arrangemang av brytningsfel partiklar samtidigt medger samtidiga höghastighetståg, högupplösta mätningar av aktiviteten hos biologiska enzymer.

Abstract

Högupplösta mikroskop system med optiska fällor medger exakt manipulering av olika brytningsindex föremål, såsom dielektriska pärlor ¹ eller cellulära organeller ^2,3, liksom för hög spatial och temporal upplösning avläsning av sin position i förhållande till mitten av fällan. Systemet som beskrivs häri har en sådan "traditionella" fälla som arbetar vid 980 nm. Det ger dessutom en andra optiskt systemet av fällor som använder en kommersiellt tillgänglig holografisk paket att samtidigt skapa och manipulera komplexa trapping mönster i synfältet hos mikroskopet ^4,5 vid en våglängd av 1064 nm. Kombinationen av de två systemen möjliggör manipulering av flera brytningsfel objekt samtidigt och samtidigt bedriva hög hastighet och hög mätningar upplösning av rörelse och kraft produktion vid nanometer och piconewton skala.

Introduction

Optisk infångning är en av de viktigaste teknikerna i biofysik ^6. Ett avgörande framsteg inom optisk infångning har varit utvecklingen av holografiska fällor som möjliggör skapande av tredimensionella fångstmetoder mönster snarare än konventionella punkt fällor ^7. Sådana holografiska fällor har fördelen av mångsidighet i positionering av brytningsfel objekt. Men konventionella fällor kan lätt anpassas för att bli mer symmetrisk än kommersiellt tillgängliga holografiska kit. De möjliggör även snabb exakt spårning av de fångade objekten. Här beskriver vi ett system (figur 1), som kombinerar de två trapping tillvägagångssätt i ett instrument och ger användaren möjlighet att utnyttja fördelarna med både som är lämpligt.

De allmänna övervägandena konstruera optiska fällor (baserat på en eller flera laserstrålar) diskuteras i detalj någon annanstans ^8-10. Vi presenterar här de överväganden som är specifika för vår setup och ge detaljer om vår inriktning förfarande. Till exempel har system med två optiska trapping balkar beskrivits tidigare (t ex ref. ^11), typiskt med användning av en laserstråle för att fånga en refraktiv objekt och använda den andra (avsiktligt lågeffektstrålen) för frikopplat avläsning av positionen för den instängda objektet . Här däremot, både laserstrålar måste vara hög effekt (300 mW eller högre) eftersom båda kommer att användas för att fånga. För mätningar av biologiska system, bör de lasrar som används för att fånga faller optimalt inom ett specifikt NIR fönster av våglängd för att minimera ljus inducerad proteinnedbrytning ^1. Här har vi valt att använda 980 nm diod och 1064 nm DPSS lasrar på grund av deras låga kostnader, hög tillgänglighet och användarvänlighet.

Vi har också valt att använda en (Spatial Light Modulator SLM) för att skapa och manipulera flera fällor samtidigt i realtid ^4,5. Dessa anordningar är kommersiellt tillgängligamen deras integration i en komplett installation innebär unika utmaningar. Här beskriver vi ett praktiskt angreppssätt som behandlar dessa potentiella svårigheter och ger ett mycket mångsidigt instrument. Vi tillhandahåller ett explicit exempel för den beskrivna specifika inställningar som kan användas som en guide för modifierade konstruktioner.

Protocol

Ett. Installation av 980 nm Våglängd enda optisk Trap

1. Optisk fångst vid 980 nm våglängd är ofta optimala för biofysik experiment och billiga laserdioder är lätt tillgängliga med uteffekt så hög som 300 mW. Det är föredraget för en diodlaser som skall pigtailed med polarisationsbevarande bevara singelmodfiber med en känd modfältet diameter. Fibern måste vara tillräckligt lång för att fungera som ett mode-filter och är normalt avslutas med antingen en FC / PC eller FC / APC-kontakt. Av dessa är FC / APC föredra att minimera tillbaka reflektion av ljus och potentiella återkoppling instabiliteter.
2. Säkra 980 dioden nm laser i ett fäste som möjliggör makt och temperaturkontroll. Det är bäst att fixa fästet till en optisk bord direkt att maximera passiv värmeavledning och därigenom minimera risken för diod fel på grund av ett fel i temperatur regulator.
3. Montera PC / APC fiberkopplingsdon till optiken balk koUimerande. Det ärkritisk för att säkerställa att den kollimerade strålen har minimal divergens så justerbara fiberportar är mest användbara. Se till att den valda fiberport matchar diametern modfältet hos dioden pigtail fibern. Om strålen skall rastered användning akustooptiska deflektorer (AOD) eller elektro-optiska deflektorer (EOD) sedan den kollimerade laserstrålen midjan måste också vara något mindre än storleken på deflektorns öppning.
4. Säkra kollimerande adapter till den optiska bord på tillräckligt avstånd från mikroskop för att möjliggöra för balk routing, expansion, och placering av andra önskade komponenter. Justera fiber port för att säkerställa konsekvent strålmidja över avstånd jämförbara med övergripande strålgången till mikroskopet.
5. Installera speglar som anges i figur 1. Ta målet från mikroskopet och använder speglarna att dirigera strålen genom öppningen i målet montering scenen. Om du vill kan placeringen av dikroiska speglar DM1 och DM3 utelämnas tillssenare. DM2 och DM3 är både shortpass och sända synligt ljus samtidigt reflektera nära IR och ovan.
6. Det är bra att tillfälligt montera en röd laserpekare i stället för målet, i linje med den optiska axeln för mikroskopet. En anpassad mekanisk adapter är nödvändig för att säkerställa centrering av laserpekaren. Synlig strålen från laserpekaren kan sedan dras tillbaka till mitten av öppningen hos fibern hamnen och kan sedan användas för att installera linserna (se nedan).
7. Installera 980 nm strålexpanderaren (L8 och L9) på behörigt avstånd från den fiber port för framtida införande av styrkomponenter (AOD eller EOD) som behövs ^1. Den expanderade strålen måste något överfylla baksidan focal öppning av målet. (Här, objektiv med brännvidder på 125 mm och 60 mm är i en Keplerian arrangemang till ungefärlig dubbel strålmidjan). Använd synlig stråle laserpekare (se avsnitt 1.6) för att säkerställa korrekt lins placering och grovuppriktning.
8. Install 980 nm styrning linser (L2 och L3) i ett teleskop arrangemang som anges (här både har 60 mm brännvidd) ^1. L3 är monterad i ett plan-konjugat till baksidan-fokalplan av målet. Mount L3 på en precision XYZ positionering skede för att möjliggöra strålstyming. Det är användbart för XYZ scenen för att ha digitala indikatorer för sina mikrometer, vilket möjliggör repeterbar positionering och ompositionering av fällan. Den 0,5 "utbud av resor är vanligtvis tillräckligt, kan dock längre resor för L3 positionering längs den optiska axeln vara till hjälp. Använd synlig stråle laserpekare (se avsnitt 1.6) för att säkerställa korrekt lins placering och grovuppriktning.

2. Installation av Laservarnare

1. Installera den dikroiska spegeln DM3 ovanför kondensorn såsom visas i fig. 1. En anpassad montering krävs typiskt. Säkra quad fotodioden (QPD) eller en positionskänslig detektor (PSD) ⁸ till sidan av kondensoranordningen och ENSure att 980 nm laserstrålen reflekteras av DM3 slår den ungefär på mitten. Vid användning QPD, se till att den är monterad på en liten XY-bord för att möjliggöra exakt centrering av sensorn på laserstrålen.
2. Installera L1 (typiskt en 30 mm lins) mellan DM3 och sensorn. Placera L1 för att fokusera strålen till en enda fläck på sensorn.
3. Montera notchfilter strax före L1 att blockera 1064 nm strålen samt eventuella herrelösa synliga reflektioner ljus från mikroskopet illuminator och omgivande belysning.

Tre. Installation av 1,064 nm våglängd Holographic Trap

1. Den holografiska del av installationen är uppbyggd kring en kommersiellt tillgänglig hårdvara / mjukvara Den holografiska speglar används i detta paket är klassade till maximalt infallande effekt på 5 eller 10 W / cm ^2. Single Mode TEM00 balkar i detta effektområde kan lätt anskaffas från en DPSS laser vid 1064 nm våglängd.
2. Montera 1064 nm laser på en upphöjdplattform för att grovt matcha höjden av strålgången för 980 linjen (se avsnitt 1).
3. Om inte direkt styrbar, kan laser makt justeras manuellt genom att installera en halv våg plattan (HWP) och ett polarisationsfilter (PBS) direkt efter laserutmatningen bländare. Det är bra att montera polarisatorn i en roterande scen för att kunna matcha holografisk spegel krav på balk polarisering.
4. Installera 1,064 nm strålexpanderaren (L6 och L7). Laserstrålen midjan måste utökas för att matcha den diagonala storleken på den holografiska spegeln. För stora expansionsförhållanden (över 10X) kan det vara ett bekymmer att hålla storleken hos tänjningsanordningen liten. Det kan sålunda vara önskvärt att använda objektiv med ovanligt liten brännvidd (här: 16 mm och 175 mm).
5. Montera andra speglar som anges för att styra 1064 nm strålen genom målet.
   1. Secure DM1 dikroitisk (45 ° infallsvinkel) i en kinematisk montera och placera enheten i 980 nm strålgången så att den möjliggör undiminished överföring av denna balk.
   2. Aktivera laserpekare ljus. Den DM1 spegel bör återspegla tillräcklig mängd av synligt ljus att korrekt positionera den spatiala Ijusmodulatorn (SLM) i banan för denna stråle. SLM måste också vara vinklad så att inkommande och utgående laserstrålar är så nära som möjligt vinkelrätt infall. Dock infallsvinkeln måste vara tillräckligt stor för att säkerställa att laserstrålen inte är klippt av lins fästen och andra optiska komponenter. En 5 ° vinkel bör vara lätt att uppnå och är tillräckligt liten. Slutligen avståndet från DM1 till SLM måste mätas noggrant så att införandet av linser L4 och L5 (se 3.6 nedan) kan böja SLM spegelplanet och back-fokalplan målet.
   3. Installera en spegel för att rikta ljuset från 1064 nm strålexpanderare till SLM. Se till att laserpekare ljuset träffar öppningen strålspridaren på mitten.
6. Installera linser L4 och L5 (här: objektiv med 125 mm och 200 mm respektive). Detta teleskop par konjugat SLM spegelplanet på baksidan fokalplan målet och dessutom minskar strålmidjan att endast något överfylla bakre öppningen av målet. Vi valde objektiv med lång brännvidd till rymden SLM ifrån DM1. Detta inte bara rensar rum för andra laserlinjen men också tenderar att göra anpassningen lättare.
7. Ta laserpekaren. Låt monteringsadapter för att tjäna som grov inriktningsöppning.

4. Installation och anpassning Notes

1. Lens L3 och SLM ska placeras så att den är optiskt konjugerad till baksidan fokalplan målet. Den gemensamma brännpunkt L4 och L5 är optiskt konjugerad till preparatplanet om de optiska trapping strålarna injiceras i oändlighet utrymmet i mikroskop.
2. sjunga IR-kort viewer rikta 980 nm strålen att gå längs mittaxel öppningen i laserpekaren adaptern.
3. Använd IR-kort to se till att den 1064 nm strålen träffar samma plats som den 980 nm strålen på DM1, L2 och L3 och att den 1064 nm strålen går längs centrumaxeln för öppningen i laserpekaren adaptern.
4. Byt laserpekaren montering adapter med ett mål. Hög numerisk apertur olja eller vatten mål är typiskt.
5. Passa in 980 nm fällan som beskrivs i ⁹ med "walking" laserstrålen tills en radiellt symmetrisk interferensmönster ses på kameran.
6. Med den holografiska spegeln av (dvs. verkar som en passiv spegel) använda SLM och DM1 att "gå" den icke-spridd 1064 nm stråle för att rikta in 1064 nm fällan.
7. SLM ger en signifikant icke-spridd stråle som resulterar i en stark oflyttbara laser fälla i synfältet. Detta är användbart för inriktning men kan vara oönskade för experiment. För att blockera denna fälla man kan sätta en liten ogenomskinlig objekt i vägen för obrutet ljus vid platsen konjugatet till provet planet (t.ex. the gemensamma brännpunkt L4 och L5). Storleken på denna centrala plats blockerare måste vara något större än diametern på Airy disk för fokuserat ljus (en blocker med 100-300 nm diameter för det beskrivna systemet).
8. djust 1,064 polarisering nm stråle med polarisationsfilter för att matcha SLM orientering. Rotera halwågsplattan att ställa in uteffekten hos strålen som önskas.
9. Om så önskas, sätter AOD eller EOD balkelementen styrning till 980 nm laser linje. Säkerställ korrekt konjugering av dessa element på baksidan-fokalplan målet och åter rikta fällan. Det är bra att montera styr-element på en goniometrisk skede.

Representative Results

Den sammansatta installationen ger operatören möjlighet att fånga flera brytningsfel objekt i realtid och placera dem i alla tre dimensioner inom synfältet. Vi belyser de holografiska kapacitet instrumentet genom att fånga 11 mikrosfärer (Figur 2). Fällan begränsar varje objekt manuellt omplaceras efter svällning så att den slutliga arrangemanget skildrar logotyp vid University of Utah där detta experiment utfördes. En kombinerad funktion av holografiska och konventionell fälla visas i figur 3. Den konventionella fällan flyttar central pärla successivt snabbare (fälla hastigheter på 1,3, 10 och 82 um / sek visas), medan holografiskt definierade fällor stå stilla. Vid den högsta hastigheten sker hela rörelsen av kulan under inspelningen av en ram av video och därmed framstår som extrem rörelseoskärpa. Det är möjligt att flytta den konventionella fällan snabb nog att pärlorna tvingas från det fångande potentialen av hydrodynamic dra (ej visad).

Notera att monteringen av komplexa former som utnyttjar multipla mikrosfärer kan leda till ett fall där antalet mikrosfärer i synfältet är otillräcklig för fullständig montering (vilket framgår i fig. 2). I sådana fall behöver operatören fysiskt flytta synfältet i förhållande till provets (dvs. ompositionera provsteget i mikroskopet) att exponera ytterligare mikrosfärer under bibehållande av de objekt som redan fångade.

Figur 1. Skiss över högupplöst mikroskop systemet med två fångstmetoder balkar. Komponenter märkta L1-L9 är grundläggande linser. Komponenter märkta DM1-DM3 är dikroiska speglar. Linser L2 och L3 används för styrning. Linser L4 och L5 fungera som en beam reduktionsventilen och spacer. Linser L6/L7 och L8/L9 är strålexpanderare par för sina respektive laserstrålar. Omärkta komponenter avbildas som fasta svarta rektanglar är grundläggande speglar. Komponenter märkta MC och MO är mikroskopet kondensor och objekt, respektive. Övriga komponenter är en quad fotodiod (QPD), notchfilter (NF), Peltier temperaturregulator stadium (PTC), varma filtret (HF), Spatial Light Modulator (SLM), akusto-optisk deflektor (AOD), fönsterluckor (S1 och S2), halvvågsplatta (HWP) och polarisationsstrålsplittraren (PBS).

Figur 2. En rumsliga arrangemang representerar ett University of Utah logotyp görs med 11 operatören definierade och kontrollerade holografiska fällor. De instängda objekten är brytningsfel pärlor (se tabell av material för mer details) suspenderades i avjoniserat vatten. Röda och gröna cirklarna visar fälla positioner. Ramar (a) - (f) representerar successiva steg logotypen konstruktion.

Figur 3. Två rader av fällor görs med 6 operatören definierade och kontrollerade holografiska fällor. Ytterligare konventionell fälla definieras mellan de två raderna och dess position justeras vid olika hastigheter som anges. Kulan flyttas till en maximal spatial förskjutning av 4.1 m och sedan tillbaka till den ursprungliga platsen. En video av kula rörelse mäts vid 47 fps. Som fälla ompositionering hastigheten ökas, successivt större rörelseoskärpa observerats i videon. De instängda objekten är brytningsfel pärlor (se tabell av material för mer detaljer) suspenderade i avjoniserat vatten. Frame tidpunkter visas i rött. Trap ompositionering hastighet visas för varje rad. Gröna skala staplarna motsvarar 5 ^ m i vardera riktningen.

Discussion

Vi har konstruerat ett instrument som kombinerar två optiska fällor av olika typer (figur 1) för att tillhandahålla separata fångstmetoder bekvämligheter för objektet manipulation och mätning. Den "vanliga" optiska fällan är byggd runt en 980 nm diodlaser. Denna stråle expanderas, styrs och injiceras sedan i vår inverterat mikroskop ("ljusröd" strålen i fig 1). Det holografiska optiska fällan är byggd runt en 1064 nm DPSS laser. Strålen expanderas för att passa storleken på den (Spatial Light Modulator SLM), reflekteras från SLM vid låg infallsvinkel, reduceras till något överfylla baksidan fokus öppning av målet, i kombination med den "vanliga" infångning linje med en dikroisk spegel, och slutligen injiceras i vår mikroskop ("mörkröd" strålen i fig 1). Observera att SLM måste placeras i ett plan som är optiskt konjugat till det bakre fokalplanet av målet.

I protocol avsnitt beskriver vi designen och anpassningen överväganden som gör att vi kan minimera fysisk fotavtryck av installationen och ändå möjliggöra relativt enkel konstruktion. Vi beskriver också blockering av obrutna delen produceras av SLM, vilket kan vara nödvändigt för ett kommersiellt paket som det system som används här, men är något utmanande och hittills dåligt dokumenterade.

Designen beskrivs här är mycket anpassningsbar. Vi har inkluderat korta omnämnanden av flera populära hög nivå anpassningar för optiska fällor och hur man skulle integrera dem i vår design. Till exempel kan en enda fälla styras på flera sätt, bland annat akustooptiska avvisare (AOD), elektro-optiska avvisare (EOD) ^12, lös eller deformerbara reflektorer eller helt enkelt rastrering styrningen linsen (L3 i vår setup) ^1. På liknande sätt kan positionen för en instängd objekt bestämmas med användning av många system och sensorer. I sådana fall den typiska placeringen och riktalingen av relevanta komponenter beskrivs kortfattat. Vi förväntar oss att detta arbete kan ge en mall för mer komplexa mönster i framtiden.

Flera praktiska överväganden och begränsningar användning är att notera. Först bör de optiska fällor inte placeras för nära varandra för att inte störa sina attraktiva potentialer nära fällan centrum. Om nära positionering av två fällor är nödvändig, då är det möjligt att definiera en linje fälla förbinder de två punkter så att den attraktiva potentialen av fällan sträcker sig längs hela linjen. En annan praktisk fråga är att de fångade föremålen inte kan flyttas så snabbt att de upplever alltför hydrodynamiska dra (den exakta gränsen beror på fällan styrka) annars dra kan pressa föremålen ur fällan.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optical table	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Microscope, Inverted, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Oil condenser Lens 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD camera	Andor technology USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 camera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund; Germany
laser diode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
laser diode mount	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984	Bozeman, MT
adjustable fiber ports	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographic system	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holographic mirror	Boulder Non-linear Systems	this is a part of HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcite polarizer	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
half-wave plate	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarizer rotation mount	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
half-wave plate rotation mount	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
custom mechanical adapter	Thorlabs	SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore	Newton, NJ
notch filter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Acousto-Optic deflector (2-axis)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometric stage	New Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm steering lenses	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm aspherical expander lens	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm expander lens	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spot blocker (cabron-steel sphere)	Bal-Tec	0.0100" diameter	Los Angeles, CA
Microspheres (Carboxyl-polystyrene)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL