Opførelse af en høj opløsning Mikroskop med konventionelle og Holografisk Optiske fældefangst Capabilities

Summary

Det heri beskrevne system anvender en traditionel optisk fælde samt en uafhængig holografisk optisk indfangning linje, stand til at skabe og manipulere flere fælder. Dette giver mulighed for oprettelse af komplekse geometriske arrangementer af refraktive partikler samtidig tillader samtidige høj hastighed, høj opløsning målinger af aktiviteten af ​​biologiske enzymer.

Abstract

Høj opløsning mikroskopsystemer med optiske fælder tillader præcis manipulation af forskellige refraktive objekter, såsom dielektriske perler ¹ eller cellulære organeller ^2,3, samt for høj rumlig og tidsmæssig opløsning udlæsning af deres position i forhold til midten af fælden. Det heri beskrevne system har en sådan "traditionel" fælde opererer ved 980 nm. Det desuden giver en anden optisk indfangning system, der bruger en kommercielt tilgængelig holografisk pakke til samtidig at skabe og manipulere komplekse fældefangst mønstre i synsfeltet for mikroskopet ^4,5 ved en bølgelængde på 1.064 nm. Kombinationen af ​​de to systemer giver mulighed for manipulation af flere refraktive objekter samtidigt samtidig gennemføre høj hastighed og høj opløsning målinger af bevægelse og kraft produktion på nanometer og piconewton skala.

Introduction

Optisk trapping er en af de vigtigste teknikker i biofysik ^6.. En afgørende avancement i optisk indfangning har været udviklingen af holografiske fælder, der giver mulighed for etablering af tre-dimensionelle fældefangst mønstre snarere end konventionelle punkt fælder ^7.. Sådanne holografiske fælder besidder den fordel alsidighed i positionering af refraktive objekter. Men konventionelle fælder kan nemt tilpasses til at være mere symmetrisk end kommercielt tilgængelige holografiske kits. De giver også mulighed for hurtig præcis sporing af de fangne ​​objekter. Her beskriver vi et system (fig. 1), som kombinerer de to fældefangst tilgange i ét instrument og giver brugeren mulighed for at udnytte fordelene ved både som passende.

De generelle overvejelser konstruere optiske fælder (baseret på en enkelt eller flere laserstråler), er diskuteret i detaljer andetsteds ^8-10. Her skitserer vi de overvejelser der er specifikke for vores setup og give detaljer af vores tilpasning procedure. For eksempel har systemer med to optisk indfangning stråler blevet beskrevet før (f.eks ref. ^11), typisk ved hjælp af en laserstråle til at indfange et brydningsindeks objekt og bruge den anden (bevidst laveffektstrålebundt) for afkoblet udlæsning af positionen af de fangne ​​objekt . Her er dog begge laserstrålerne skal være høj strøm (300 mW eller højere), fordi begge skal anvendes til indfangning. For måling af biologiske systemer, bør lasere, der anvendes til fældefangst optimalt falder inden for et bestemt NIR vindue bølgelængde for at minimere lys induceret protein nedbrydning ^1.. Her har vi valgt at bruge 980 nm diode og 1.064 nm DPSS lasere på grund af deres lave omkostninger, høj tilgængelighed og let betjening.

Vi har også valgt at bruge en rumlig lysmodulator (SLM) til at oprette og manipulere flere fælder samtidigt i realtid ^4,5. Disse enheder er kommercielt tilgængeligemen deres integration i et komplet setup præsenterer unikke udfordringer. Her beskriver vi en praktisk tilgang, som omhandler disse potentielle vanskeligheder og giver en meget alsidig instrument. Vi udgør et eksplicit eksempel for den specifikke beskrevne setup, hvilket kan anvendes som en rettesnor for ændrede motiver.

Protocol

1.. Installation af 980 nm Bølgelængde Single Optical Trap

1. Optisk trapping ved 980 nm bølgelængde er ofte optimal for biofysik eksperimenter og billige laserdioder er let tilgængelige med udgangseffekt så højt som 300 mW. Det er at foretrække for en diodelaser, der skal pigtailed med polarisering-bevarelse singlemode fiber med en kendt mode field-diameter. Fiberen skal være tilstrækkelig lang til at fungere som et mode-filter og er typisk afsluttet med enten en FC / PC eller FC / APC stik. Af disse er FC / APC foretrække at minimere tilbage refleksion af lys og potentiel feedback-ustabilitet.
2. Fastgør 980 nm laserdiode i en mount som giver mulighed for magt og temperaturstyring. Det er bedst at fastgøre mount til en optisk tabel direkte at maksimere passiv køleplade og derved minimere risikoen for diode fejl på grund af en fejl i temperatur controller.
3. Monter pc / APC fiberkonnektor til strålen kollimerende optik. Det erkritisk for at sikre, at den kollimerede stråle har minimal divergens så justerbare fiberporte er mest nyttige. Sørg for, at den valgte fiber port matcher tilstand felt diameter diode grisehale fiber. Hvis strålen skal bitmapobjekt hjælp akustisk-optiske deflektorer (AOD) eller elektro-optiske deflektorer (EOD), så den kollimerede laserstråle taljen skal også være lidt mindre end størrelsen af ​​deflektoren åbning.
4. Fastgør kollimerende adapteren til den optiske bordet i tilstrækkelig afstand fra mikroskopet for at muliggøre stråle routing, ekspansion, og placering af andre ønskede komponenter. Juster fiber port for at sikre en ensartet stråle taljen over afstande sammenlignes med den samlede stråle sti til mikroskopet.
5. Installere spejle er angivet i figur 1.. Fjern målet fra mikroskopet og bruge spejle på rute strålen gennem åbningen i målet montage fase. Hvis det foretrækkes, kan placering af den dikroiske spejle DM1 og DM3 udelades indtilsenere. DM2 og DM3 er både shortpass og transmittere synligt lys samtidig afspejler nær IR og derover.
6. Det er nyttigt at midlertidigt at montere en rød laser pointer i stedet for mål tilpasset den optiske akse af mikroskopet. En brugerdefineret mekanisk adapter er nødvendig for at sikre centrering af laser pointer. Synlig stråle fra laser pointer kan derefter dirigeres tilbage til midten af ​​åbningen af ​​fiberen porten og kan derefter anvendes til at installere linser (se nedenfor).
7. Installer 980 nm stråle expander (L8 og L9) i en passende afstand fra fiber-port til fremtidig indsættelse af styrekomponenter (AOD eller EOD), som er nødvendigt ^1.. Den udvidede stråle skal lidt overfylde bagsiden omdrejningspunkt blænde af målet. (Her objektiver med brændvidder på 125 mm og 60 mm er i en Kepler arrangement til ca fordoble stråleindsnævring). Brug synlig laser pointer stråle (se afsnit 1.6) for at sikre korrekt linse placering og ru tilpasning.
8. Install de 980 nm styretøj linser (L2 og L3) i et teleskop arrangement som angivet (her begge har 60 mm brændvidde) ^1.. L3 er monteret i et plan konjugat til back-brændplan af målet. Mount L3 på en præcision XYZ positionering fase for at tillade strålestyring. Det er nyttigt for XYZ scenen for at få digitale indikatorer for sine mikrometer, der giver mulighed for gentagen positionering og repositionering af fælden. Den 0.5 "vifte af rejser er normalt tilstrækkelig, kan dog længere rejse for L3 positionering langs den optiske akse være nyttig. Brug synlig laser pointer stråle (se afsnit 1.6) for at sikre korrekt linse placering og ru tilpasning.

2.. Installation af Laser Detector

1. Installer dikroiske spejl DM3 over kondensatoren som vist i figur 1.. En brugerdefineret mount er typisk kræves. Fastgør quad foto diode (QPD) eller en position følsom detektor (PSD) ^8. til den side af kondensatoren samling og ensure, at 980 nm laserstråle reflekteres af DM3 slår det nogenlunde på midten. Ved brug QPD, at den er monteret på en lille XY-scene for at muliggøre præcis centrering af sensoren på laserstrålen.
2. Installer L1 (typisk en 30 mm objektiv) mellem DM3 og sensoren. Position L1 således at fokusere strålen til en enkelt plet på sensoren.
3. Installer notch filter lige før L1 at blokere 1.064 nm stråle samt eventuelle omstrejfende synlige lysreflekser fra mikroskop illuminator og ambient belysning.

3.. Installation af 1.064 nm Bølgelængde Holographic Trap

1. Den holografiske del af opsætningen er bygget op omkring en kommercielt tilgængelig hardware / software-pakke De holografiske spejle, der anvendes i denne pakke er normeret til en maksimal hændelse effekt på 5 eller 10 W / cm ^2. Single-mode TEM00 bjælker i denne effektområde kan let stammer fra DPSS laser på 1.064 nm bølgelængde.
2. Monter 1.064 nm laser på en forhøjetplatform til nogenlunde højden af ​​strålegangen for 980 linje (se afsnit 1).
3. Hvis ikke direkte kontrollerbar, kan laser magt justeres manuelt ved at installere en halv bølge plade (HWP) og en polarisator (PBS) lige efter laseroutput blænde. Det er nyttigt at montere polarisatoren i en roterende stadium at kunne matche holografiske spejl krav til stråle polarisering.
4. Installer 1.064 nm stråle expander (L6 og L7). Laserstrålen taljen skal udvides til at matche den diagonal holografiske spejl. For store ekspansionsforhold (ovenfor 10X) kan det være et ønske om at holde størrelsen af ​​ekspanderen lille. Det kan således være ønskeligt at anvende linser med usædvanlig lille brændvidde (her: 16 mm og 175 mm).
5. Installer de andre spejle som indikeret at lede 1.064 nm stråle gennem mål.
   1. Sikker DM1 dichroic (45 ° indfaldsvinkel) i en kinematisk mount og placere samlingen i 980 nm strålegang, så det giver mulighed for undiminished transmission af denne stråle.
   2. Aktiver laser pointer lys. Den DM1 spejl bør afspejle tilstrækkelig mængde af synligt lys til korrekt placere rumlige lysmodulator (SLM) i vejen for denne stråle. SLM skal også være vinklet således, at de indgående og udgående laserstråler er så tæt som muligt på normale forekomst. Men indfaldsvinklen skal være tilstrækkeligt stort til at sikre, at laserstrålen ikke er klippet af linse mounts og andre optiske komponenter. En 5 ° vinkel bør være let opnåelige og er tilstrækkelig lille. Endelig er afstanden fra DM1 til SLM skal måles nøjagtigt, således at indsættelsen af ​​linserne L4 og L5 (se 3.6 nedenfor) kan konjugere SLM spejl flyet og back-brændplan af målet.
   3. Installere et spejl til at dirigere lyset fra 1.064 nm stråle expander til SLM. Sørg for, at laser pointer lyset rammer strålen expander blænde på midten.
6. Installer linser L4 og L5 (her: linser med 125 mm og 200 mm henholdsvis). Denne teleskop pair konjugater SLM spejl flyet på bagsiden brændplan af målet og reducerer også stråle taljen til kun lidt overfyldes bagsiden blænde af målet. Vi valgte objektiver med lange brændvidder til rummet SLM væk fra DM1. Dette er ikke kun rydder plads til den anden laser linje, men også en tendens til at gøre tilpasningen lettere.
7. Fjern laser pointer. Lad monteringsadapteren at tjene som grov justering blænde.

4.. System Installation og justering Notes

1. Lens L3 og SLM skal placeres således, at optisk konjugeret til bagsiden brændplan af målet. Den fælles omdrejningspunkt L4 og L5 er optisk konjugeret til prøveplanet hvis optisk indfangning stråler indsprøjtes i uendeligt rum af mikroskopet.
2. synger IR card fremviser justere 980 nm stråle til at gå sammen midterakse åbningen i laser pointer adapter.
3. Brug IR-kort to sikre, at 1.064 nm stråle rammer det samme sted som 980 nm stråle på DM1, L2 og L3 og at 1.064 nm stråle går langs midteraksen af ​​åbningen i laser pointer adapteren.
4. Udskift laser pointer montering adapter med et mål. Høj numerisk apertur olie eller vand mål er typisk.
5. Juster 980 nm fælden som beskrevet i ⁹ med "walking" laserstrålen indtil en radialt symmetrisk interferensmønster ses på kameraet.
6. Med den holografiske spejl off (dvs. der fungerer som en passiv spejl) anvender SLM og DM1 til "walk" den ubrudte 1.064 nm stråle at tilpasse 1.064 nm fælde.
7. SLM frembringer en betydelig afbøjede stråle, som resulterer i en stærk ubevægelige laser fælde i synsfeltet. Dette er nyttigt for tilpasning, men kan være uønsket af eksperimenter. At blokere denne fælde kan man indsætte en lille uigennemsigtig genstand i vejen for ubrudte lys på det sted konjugat prøveplanet (f.eks the fælles omdrejningspunkt L4 og L5). Størrelsen af ​​denne centrale plet blocker skal være noget større end diameteren af ​​den Airy disken for det fokuserede lys (en blokker med 100-300 um diameter til det beskrevne system).
8. djust 1.064 nm stråle polarisering hjælp polarisatoren at matche SLM orientering. Drej halvbølge plade at indstille udgangseffekten af ​​strålen som ønsket.
9. Hvis det ønskes, skal du indsætte AOD eller EOD stråle styretøj elementer i 980 nm laser linje. Sikre ordentlig konjugation af disse elementer til back-brændplan af målet og re-justere fælden. Det er nyttigt at montere styreelementer på en goniometrisk scene.

Representative Results

Den samlede setup giver føreren mulighed for at fange flere refraktive objekter i realtid og placere dem i alle tre dimensioner, inden for synsfeltet. Illustrerer vi holografiske kapaciteter af instrumentet ved at fange 11 mikrosfærer (figur 2). Fælden begrænser hvert objekt manuelt omplaceres på fældefangst, således at den endelige ordning skildrer logoet for University of Utah, hvor dette eksperiment blev udført. En kombineret funktion af holografisk og konventionelle fælde er vist i figur 3.. Den konventionelle fælde flytter central perle gradvist hurtigere (trap hastigheder på 1,3, 10 og 82 um / sek er vist), mens holografisk definerede fælder står stille. Ved den højeste hastighed, opstår hele bevægelse af perlen under optagelsen af ​​en ramme af video og fremstår således som ekstrem motion blur. Det er muligt at flytte den konventionelle fælde hurtigt nok at perlerne er tvunget fra trapping potentiale ved hydrodynamic træk (ikke vist).

Bemærk, at samling af komplekse former anvender flere mikrosfærer kan føre til et tilfælde, hvor antallet af mikrosfærer i synsfeltet er utilstrækkelig til fuld montering (som det fremgår af figur 2). I sådanne tilfælde skal operatøren bevæge sig fysisk synsfeltet forhold til prøven (dvs. flytte prøven fase i mikroskopet) for at afdække yderligere mikrosfærer samtidig bevare de objekter, der allerede fanget.

Figur 1. Skematisk af den høje opløsning mikroskop system med to fælder bjælker. Komponenter mærket L1-L9 er grundlæggende linser. Komponenter mærket DM1-DM3 er dichroic spejle. Linser L2 og L3 anvendes til styring. Linser L4 og L5 fungerer som et beam reduktionsgear og spacer. Linser L6/L7 og L8/L9 er beam expander par for deres respektive laserstråler. Umærkede komponenter afbildet som faste sorte rektangler er grundlæggende spejle. Komponenter mærket MC og MO er mikroskopet kondensator og objekt, hhv. Andre komponenter er en quad foto diode (QPD), notch filter (NF), Peltier temperatur controller etape (PTC), hot-filter (HF), fysisk lys modulator (SLM), akustisk-optisk deflektor (AOD), skodder (S1 og S2), halvbølge plade (HWP) og polariserende stråledeler (PBS).

Figur 2. En rumlig arrangement der repræsenterer en University of Utah logo er lavet ved hjælp 11 operatør defineret og kontrolleret holografiske fælder. De indespærrede objekter er refraktive perler (se tabel of Materials for mere detalls) suspenderet i demineraliseret vand. Røde og grønne cirkler viser trap positioner. Rammer (a) - (f) repræsenterer flere faser logo konstruktion.

Figur 3. To rækker af fælder er lavet ved hjælp 6 operatør defineret og kontrolleret holografiske fælder. En yderligere konventionelle fælde defineres mellem de to rækker og dens stilling justeres ved forskellige hastigheder som angivet. Perlen flyttes til en maksimal rumlig forskydning på 4,1 um og derefter tilbage til den oprindelige placering. En video af perle bevægelse er indspillet i 47 fps. Som fælde repositionering hastigheden øges, bliver gradvist større motion blur observeret i videoen. De indespærrede objekter er refraktive perler (se tabel af materialer til flere detaljer) suspenderet i demineraliseret vand. Frame tider er vist i rødt. Trap repositionering hastighed vises for hver række. Grønne skalapanelerne svarer til 5 um i hver retning.

Discussion

Vi har bygget et instrument, der kombinerer to optiske fælder af forskellige typer (Figur 1) for at give separate fældefangst faciliteter for objekt manipulation og måling. Den "traditionelle" optisk fælde er bygget op omkring en 980 nm diode laser. Denne stråle er udvidet, styres og derefter sprøjtet ind i vores inverteret mikroskop ("lyserød" stråle i figur 1). Det holografiske optiske fælde er opbygget omkring en 1.064 nm DPSS laser. Strålen udvides til at passe til størrelsen af ​​den rumlige lysmodulator (SLM), reflekteret fra SLM ved lav indfaldsvinkel, reduceret til lidt overfyldes bagsiden fokal åbning af målet, kombineres med "konventionelle" trapping ved hjælp af et dikroisk spejl, og endelig injiceres i vores mikroskop ("mørkerød" stråle i figur 1). Bemærk, at SLM skal placeres i et plan, som er optisk konjugeret til bagsiden brændplan af målet.

I protocol afsnit beskriver vi design og tilpasning overvejelser, der tillader os at minimere rumlig fodaftryk setup og stadig muliggøre relativt let konstruktion. Vi beskriver også den blokering af den afbøjede komponent produceret af SLM, som kan være nødvendigt for en kommerciel pakke ligesom det anvendte system her, men er noget udfordrende og til dato dårligt dokumenteret.

Designet er beskrevet her, er meget tilpasses. Vi har inkluderet korte omtaler af flere populære højt niveau tilpasninger til optiske fælder, og hvordan man ville integrere dem i vores design. For eksempel kan en enkelt fælde styres på flere måder, herunder akustisk-optiske deflektorer (AOD), elektro-optiske deflektorer (EOD) ^12, løsøre eller deformerbare reflektorer eller blot rastering rattet linse (L3 i vores setup) ^1.. Tilsvarende kan positionen af ​​en fanget objekt bestemmes ved hjælp af mange ordninger og sensorer. I sådanne tilfælde, justere den typiske placering ogling af relevante komponenter er kort beskrevet. Vi forventer, at dette arbejde kan give en skabelon for mere komplekse designs i fremtiden.

Adskillige praktiske overvejelser og brugen begrænsninger er af note. Først bør de optiske fælder ikke være placeret for tæt på hinanden, så de ikke forstyrrer deres attraktive potentialer nær fælde center. Hvis tæt positionering af to fælder er nødvendig, så er det muligt at definere en linje fælde forbinder de to punkter, således at den attraktive potentiale fælden strækker sig langs hele linjen. Et andet praktisk problem er, at de fangne ​​objekter ikke kan flyttes så hurtigt, at de oplever overdreven hydrodynamisk træk (den nøjagtige grænse afhænger fælde styrke) ellers træk kan skubbe objekter ud af fælden.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Optical table	Newport corporation	ST-UT2-56-8	Irvine, CA
Microscope, Inverted, Eclipse Ti	Nikon USA	MEA53220	Melville, NY
Plan apo 100X oil objective (1.4 NA)	Nikon USA	MRD01901	Melville, NY
Oil condenser Lens 1.4 NA	Nikon USA	MEL41410	Melville, NY
EMCCD camera	Andor technology USA	Ixon DU897	South Windsor, CT
1/3" CCD IEEE1394 camera	NET USA Inc	Foculus FO124SC	Highland IN
Laser, TEM00, SLM, 1,064 nm wavelength	Klastech Laser Technologies	Senza-1064-1000	Dortmund; Germany
laser diode, TEM00, SLM, 980 nm	Axcel Photonics	BF-979-0300-P5A	Marlborough, MA
laser diode mount	ILX Lightwave	LDX-3545, LDT-5525, and LDM-4984	Bozeman, MT
adjustable fiber ports	Thorlabs	PAF-X-11-B	Newton, NJ
holographic system	Arryx	HOTKIT-ADV-1064	Chicago, IL
holographic mirror	Boulder Non-linear Systems	this is a part of HOTKIT-ADV-1064	Lafayette, CO
Calcite polarizer	Thorlabs	GL10-B	Newton, NJ
half-wave plate	Thorlabs	WPH05M-1064	Newton, NJ
Polarizer rotation mount	Thorlabs	PRM1	Newton, NJ
half-wave plate rotation mount	Thorlabs	RSP1	Newton, NJ
Shutter	Thorlabs	SH05	Newton, NJ
dichroic mirrors (DM2 & DM3); 45 ° AOI	Chroma Technology	t750spxrxt	Bellows Falls, VT
dichroic mirror (DM1); 45 ° AOI	Thorlabs	DMSP1000R	Newton, NJ
custom mechanical adapter	Thorlabs	SM1A11 and AD12F with enlarged inner bore	Newton, NJ
notch filter	Semrock	FF01-850/310-25	Rochester, NY
Acousto-Optic deflector (2-axis)	intraAction	DTD-584CA28	Bellwood, IL
goniometric stage	New Focus	9081	Santa Clara, CA
60 mm steering lenses	Thorlabs	LA1134-B	Newton, NJ
16 mm aspherical expander lens	Thorlabs	AC080-016-C	Newton, NJ
175 mm expander lens	Thorlabs	LA1229-C	Newton, NJ
Spot blocker (cabron-steel sphere)	Bal-Tec	0.0100" diameter	Los Angeles, CA
Microspheres (Carboxyl-polystyrene)	Spherotech	CP-45-10	Lake Forest, IL