Summary
המקומות תלת ממדיים של אובייקטים בחולשה-פיזור יכולים להיות מזוהים באופן ייחודי באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי מוטבע הולוגרפית (DIHM), הכולל שינוי קל במיקרוסקופ רגיל. התוכנה שלנו משתמשת היוריסטי הדמיה פשוטה יחד עם ריילי-זומרפלד גב ההתפשטות להניב את המיקום ואת הגיאומטריה של אובייקט שלב מיקרוסקופי תלת ממדים.
Abstract
אובייקטים בחולשה-פיזור, כגון חלקיקי colloidal קטנים ורוב תאים ביולוגיים, הם נתקלו לעתים קרובות במיקרוסקופ. אכן, מגוון רחב של טכניקות פותחו כדי להמחיש טוב יותר אובייקטי השלב הבאים; ניגוד השלב ודסק"ש הם בין השיטות הפופולריות ביותר לשיפור קונטרסט. עם זאת, עמדת הקלטה וצורה בכיוון מחוץ להדמית מטוס נותרים מאתגרות. דו"ח זה מציג את שיטה ניסיונית פשוטה כדי לקבוע במדויק את המיקום וגיאומטריה של אובייקטים בשלושה ממדים, באמצעות מיקרוסקופ הולוגרפי מוטבע דיגיטלי (DIHM). באופן כללי, הנגיש נפח הדגימה מוגדר על ידי גודל חיישן המצלמה בכיוון לרוחב, ולכידות התאורה בכיוון הצירי. כרכי מדגם אופייניים נעים בין 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר x 200 מיקרומטר באמצעות תאורת LED, ל5 מ"מ x 5 מ"מ x 5 מ"מ ויותר, באמצעות תאורת לייזר. אור ההארה זו מוגדר כך שגלי מטוס הם אירוע על המדגם. אובייקטים בנפח הדגימה אז מפזרים אור, אשר מפריע לאור unscattered כדי ליצור דפוסי התערבות בניצב לכיוון התאורה. תמונה זו (הולוגרמה) מכילה את מידע העומק הנדרש לשחזור תלת ממדי, ויכולה להיות שנתפס על מכשיר הדמיה סטנדרטי כגון ה-CMOS או מצלמת CCD. שיטת גב התפשטות ריילי-זומרפלד מועסקת למקד מחדש מבחינה מספרית תמונות מיקרוסקופ, והיוריסטי הדמיה פשוטה המבוסס על שלב Gouy האנומליה משמשת לזיהוי פיזור אובייקטים בתוך הנפח המשוחזר. שיטה פשוטה אך חזקה כתוצאה ממדידה חד משמעית, ללא מודל של המיקום וצורה של אובייקטים בדגימות מיקרוסקופיות.
Introduction
מיקרוסקופ הולוגרפי מוטבע דיגיטלי (DIHM) מאפשר הדמיה תלת ממדית מהירה של דגימות מיקרוסקופיות, כגון מיקרואורגניזמים שחייה 1,2 ומערכות חומר רכים 3,4, עם שינויים מינימאליים להתקנת מיקרוסקופ רגילה. במאמר זה הפגנה פדגוגית של DIHM מסופקת, סביב תוכנה שפותחה במעבדה שלנו. נייר זה כולל תיאור של איך להגדיר את המיקרוסקופ, לייעל את האיסוף וניתוח נתונים, ולעבד את התמונות שתועדו לשחזר נתונים תלת ממדיים. התוכנה (המבוססת בחלקו על תוכנה שפותח על ידי DG גריר ואחרים 5) ותמונות דוגמא זמינה באופן חופשי באתר האינטרנט שלנו. תיאור מסופק על הצעדים הדרושים כדי להגדיר את המיקרוסקופ, לשחזר נפחים תלת ממדים מהולוגרמות ולעבד כמויות של עניין וכתוצאה מכך באמצעות קרן חופשית התחקות חבילת תוכנה. העיתון מסכם בדיון על גורמים המשפיעים על איכות השיקום, והשוואה של DIHM עם שיטות מתחרות.
למרות DIHM תואר לפני כמה זמן (לסקירה כללית של העקרונות והפיתוח שלה, לראות את קים 6), כוח המחשוב הנדרש ומומחיות עיבוד תמונה עד כה במידה רבה להגביל את השימוש בה לקבוצות מחקר מומחה עם דגש על פיתוח מכשיר. מצב זה משתנה לאור ההתקדמות שחלה באחרונה בטכנולוגית המצלמה מחשוב ו. מחשבים אישיים מודרניים יכולים בקלות להתמודד עם העיבוד ודרישות אחסון נתונים; מצלמות CCD או CMOS נמצאות ברוב המעבדות מיקרוסקופית, והתוכנה הנדרשת הוא עשויה להיות זמינה באופן חופשי באינטרנט על ידי קבוצות שהשקיעו זמן בפיתוח הטכניקה.
תוכניות שונות הוצעו להדמית התצורה של עצמים מיקרוסקופיים בשלושה ממדי נפח דגימה. רבים מאלה סורקים טכניקות 7,8, שבו ערימה של תמונות שתועדה על ידי מ 'echanically תרגום מטוס התמונה באמצעות המדגם. מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal הסריקה הוא אולי הדוגמא המוכרת ביותר. בדרך כלל, צבע פלואורסצנטי מתווסף לאובייקט שלב על מנת להשיג רמה סבירה של ניגוד מדגם, והסדר confocal משמש למקם פליטת ניאון מרחבית. שיטה זו הובילה להתקדמות משמעותית, למשל במדע קולואיד שבו אפשרה גישה לדינמיקה תלת ממדית של מערכות צפופות 9-11. השימוש בתיוג הוא הבדל חשוב בין מיקרוסקופיה confocal פלואורסצנטי וDIHM, אבל תכונות אחרות של שתי הטכניקות הן כדאי להשוות. יש DIHM יתרון מהירות משמעותי בכך שיש לו את המכשיר ללא חלקים נעים. מראות הסריקה מכאניות במערכות confocal להציב גבול עליון לשיעור רכישת נתונים - בדרך כלל סביב 30 מסגרות / שניות לתמונת פיקסל 512 x 512. ניתן לקבל ערימה של תמונות כאלה ממטוסי מוקד שונים על ידי פיזי Translating שלב המדגם או עדשה אובייקטיבית בין מסגרות, מה שמוביל לשיעור לכידה סופי של כ כרך אחד לשנייה עבור מחסנית מסגרת 30. לשם השוואה, מערכת הולוגרפית המבוססת על מצלמת CMOS מודרנית יכולה ללכוד 2,000 מסגרות / שנייה באותו גודל התמונה ורזולוציה; כל תמונת מעובדת `מחובר 'לתת תמונת מצב בלתי תלויה בנפח הדגימה. כדי לחזור ולהדגיש: דגימות ניאון אינן נדרשות לDIHM, אם כי מערכת פותחה שמבצעת שחזור הולוגרפי של נושא ניאון 12. כמו גם מידע נפח תלת ממדים, DIHM יכול לשמש גם כדי לספק תמונות לעומת שלב הכמותי 13, אבל זה מעבר להיקף של הדיון כאן.
תמונות הנתונים הגולמיים DIHM הן דו ממדיות, ובמובנים מסוימים נראות כמו תמונות מיקרוסקופ רגילות, אם כי מחוץ לפוקוס. ההבדל העיקרי בין DIHM ומיקרוסקופ שדה בהיר סטנדרטי טמון בטבעות העקיפה המקיפות את אובייקטי in את שדה הראיה, אלו הן בשל האופי של התאורה. DIHM דורש מקור קוהרנטית יותר מ שדה בהיר - בדרך כלל LED או לייזר. הטבעות העקיפה בהולוגרמה מכילות את המידע הדרוש כדי לשחזר תמונה תלת ממדית. ישנן שתי גישות עיקריות לפרשנות נתוני DIHM; מיקוד מחודש ראוי ומספרי ישיר. הגישה הראשונה היא ישימה במקרים בהם הצורה המתמטית של התבנית העקיפה ידועה מראש 3,4; תנאי זה מתקיים על ידי קומץ קטן של אובייקטים פשוטים כמו כדורים, גלילים, ומכשולים חצי מטוס. התאמה ישירה היא גם ישימה במקרים בהם המצב הצירי של האובייקט ידוע, והתמונה יכולה להיות מצוידת באמצעות טבלה להסתכל למעלה של תבניות תמונה 14.
הגישה השנייה (מיקוד המחודש מספרי) היא די כללית יותר ומסתמכת על שימוש בטבעות העקיפה בדמות הולוגרמה דו ממדים לשחזר את השדה האופטי מבחינה מספרית במספר המטוסים (במרווחים באופן שרירותי) המוקדים ברחבי נפח הדגימה. מספר שיטות הקשורים קיימות עבור עושה 6 זה; עבודה זו משתמשת ריילי-זומרפלד חזרה טכניקת התפשטות כפי שתאר לי וגריר 5. התוצאה של הליך זה היא ערימה של תמונות המחקות את ההשפעה של שינוי מטוס מיקרוסקופ המוקד (ומכאן השם `מיקוד המחודש מספרי") באופן ידני. ברגע שערימה של תמונות כבר נוצרה, יש לקבל את עמדתו של הנושא בהיקף המוקד. מספר היוריסטיות ניתוח תמונה, כמו שונות עוצמת מקומית או תוכן תדר המרחבי, הוצג לכמת את חדות מיקוד בנקודות שונות במדגם 15. בכל מקרה, כאשר מדד תמונה מסוים מוגדל (או למזער), האובייקט נחשב בפוקוס.
בניגוד לתוכניות אחרות שמבקשות לזהות מטוס מוקד מסוים שבו אובייקט הוא "בפוקוס", השיטה בעבודה זו מרימה את points ששוכב בתוך האובייקט של עניין, אשר עשוי להאריך על פני מגוון רחב של מטוסי מוקד. גישה זו חלה על מגוון רחב של נושאים, והוא מתאים במיוחד להארכה, דגימות בחולשה-פיזור (אובייקטי שלב), כגון קולואידים בצורת מוט, שרשרות של חיידקים או שוטונים אוקריוטים. בדגימות כגון ניגוד התמונה משתנה כאשר האובייקט עובר דרך מישור המוקד; יש תמונה לא ממוקדת מרכז אור אם האובייקט הוא בצד אחד של מטוס המוקד ומרכז כהה, אם זה בצד השני. יש לא מעט ניגוד אובייקטי שלב טהורים כאשר הם שוכבים בדיוק במישור המוקד. תופעה זו של היפוך לעומת זאת נדונה על ידי מחברים אחרים 16,17 וסופו של דבר בשל שלב Gouy האנומליה 18. זה כבר הכניס על בסיס קפדני יותר בהקשר של הולוגרפיה במקום אחר, שבו הגבולות של הטכניקה מוערכים; חוסר הוודאות האופיינית בעמדה היא בסדר גודל של 150 ננומטר (כפיקסל) בEACכיוון שעות 19. שיטת האנומליה שלב Gouy היא אחת תוכניות DIHM המוגדרות היטב כמה לקביעת המבנה של אובייקטים מורחבים בשלושה ממדים, אבל בכל זאת כמה אובייקטים הם בעייתיים לשחזר. אובייקטים הנמצאים באופן ישיר לאורך הציר האופטי (מצביע על המצלמה) הם קשה לשחזר במדויק; אי ודאויות באורך והמיקום של האובייקט להיות גדולות. מגבלה זו היא בין שאר בשל העומק הסיביות המוגבל של פיקסלים הקלטת הולוגרמה (מספר הרמות האפורות שונות שהמצלמה יכולה להקליט). עוד תצורה בעייתית מתרחשת כאשר מושא העניין הוא קרוב מאוד למישור המוקד. במקרה זה, תמונות אמיתיות ווירטואליות של האובייקט משוחזרים בסמיכות, והוליד שדות אופטיים מסובכים שקשה לפרש. חשש שני, מעט פחות חשוב כאן הוא ששולי עקיפה וכתוצאה מתופסים פחות של חיישן התמונה, וinf גרנולות גס זהormation מוביל לשיקום עני באיכות.
בפועל, מסנן שיפוע פשוט מוחל כרכים משוחזרים תלת ממדים כדי לזהות היפוכי עוצמה חזקים לאורך כיוון התאורה. אזורים שבם בעוצמה משתנה במהירות מהאור לחושך, או להיפך, אז הם קשורים באזורי פיזור. אובייקטים בחולשה-פיזור מתוארים גם כאוסף noninteracting של אלמנטים כגון 20; סכום תרומות הבודד האלה לתת את השדה המפוזר בסך הכל שהוא הפוך בקלות באמצעות גב שיטת ריבוי ריילי-זומרפלד. במאמר זה, טכניקת שיפוע עוצמת צירית מוחלת על שרשרת של תאי סטרפטוקוקוס. גופי התא הם אובייקטי שלב (יש החיידק מיני מקדם שבירה נמדדה 21 להיות 1.384 בλ = 589 ננומטר אורך גל; מתח סטרפטוקוקוס צפוי להיות דומה) ותופיע כשרשרת בעוצמה גבוהה של כתמים מחוברים ב הלאחר סינון שיפוע דואר נפח דגימה יושם. שיטות מיצוי סטנדרטיות סף והתכונה להחיל נפח מסונן זה מאפשרים המיצוי של פיקסלים נפח (voxels) המתאימים לאזור בתוך התאים. יתרון מסוים של שיטה זו הוא שהיא מאפשרת שחזור חד משמעי של העמדה של אובייקט בכיוון הצירי. שיטות דומות (לפחות, שהולוגרמות אלה השיא קרובים לאובייקט, צילמו באמצעות מיקרוסקופ מטרה) סובלות מחוסר יכולת לקבוע את הסימן של עקירה זו. למרות ששיטת שחזור ריילי-זומרפלד גם לחתום עצמאי במובן זה, הפעולה הדרגתית מאפשרת לנו להבחין בין עצמים שלב החלשים מעל ומתחת למישור המוקד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. התקנה ורכישת נתונים
- לגדול תרבות של סטרפטוקוקוס מתח V4051-197 תאים (שחיה חלקה) במדיום KTY ממניות קפוא 22. דגירה שבייקרה סיבובי לילה בשעה 35 מעלות צלזיוס ו150 סל"ד, לרוויה.
- לחסן 10 מיליליטר של מדיום KTY הטרי עם 500 μl של התרבות הרווי. דגירה במשך שעה 3.5 נוספת ב35 מעלות צלזיוס ו150 סל"ד עד שהתאים מגיעים לצפיפות אופטית של כ 1.0 בλ = 600 ננומטר (מיליליטר / כ 5 x 10 8 תאים).
- לדלל 1:400 בתקשורת טרי כדי להשיג הריכוז הסופי של תאי ניעתי.
- בשקופית מיקרוסקופ, להפוך את טבעת של שומן (לדוגמא ממזרק מלא בוזלין) בסביבות 1 מ"מ גובה ובמקום ירידה של הפתרון לדוגמא במרכז. מניחים מכסה זכוכית באורח קל בראש ולחץ בקצוות כדי לאטום, הבטחת הנוזל שנמצאה בקשר עם שני שקופיות וכיסוי זכוכית. מדגם החדר וכתוצאה מכך צריך להיות around 100-200 מיקרומטר לעומק.
- מניחים את החדר לדוגמא במיקרוסקופ עם מכסה הזכוכית פונה כלפי מטה, ובזהירות, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר בשמן בין הזכוכית ועדשות.
- פוקוס מיקרוסקופ על פני השטח התחתון של חדר המדגם, ולהביא את הקבל להתמקד.
- כבה את התאורה סטנדרטית ולמקם את ראש LED מאחורי צמצם הקבל של המיקרוסקופ. הגדר את אספקת חשמל LED לתפוקה מקסימלית.
- סגור את צמצם הקבל מידה במלואם, ואם יש צורך, דחיפה LED בהר ועד התאורה מתמקדת בצמצם העדשה האובייקטיבי.
- הפעל את המחשב והמצלמה, ולהפנות את כל האור ליציאת המצלמה של המיקרוסקופ. התאם את קצב מסגרת ואת גודל התמונה בתוכנת רכישת תמונה.
- הפוך את זמן חשיפת מסגרת קצר ככל האפשר, תוך שמירה על ניגודיות טובה. בדוק היסטוגרמה עוצמת תמונה, כדי להבטיח שהתמונה היא לא saturaטד או חשוף תחת.
- במידת צורך, ולמקד את המיקרוסקופ כך שמושא העניין הוא מעט מזוגג (בדרך כלל על ידי 10-30 מיקרומטר). האובייקט ומישור המוקד צריך להיות באותו המדיום (כלומר מישור המוקד צריך לשכב בתוך החדר לדוגמא).
2. שחזור
הצעד הראשון של עיבוד נתונים הוא למקד מחדש מבחינה מספרית מסגרת וידאו בסדרה של עומקים שונים, לייצר ערימה של תמונות. תוכנה ידידותית למשתמש עושה את זה ניתן למצוא כאן: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html יחד עם תמונות דוגמא (שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ הפוכה, ועדשה אובייקטיבית 60x טבילת שמן) וזירת קובץ לקרן לייחס טיוח.
- קלט למסגרת של עניין והרקע שלה בהתאמה כקבצי תמונה נפרדות, בתיבות הרלוונטיות בממשק. תמונת רקע היא מסגרת שfairly מייצג את הרקע של הווידאו, בהיעדר הולוגרמה, וישמש לדיכוי כל רעש קבוע דפוס שיכול להפריע ללוקליזציה הולוגרמה וניתוח.
- הזן ערכים בתיבות ההגדרות הגלובליות בצד שמאל של המסך לפני הפעלת התכנית. השלושה הראשונים פרמטרים מחסנית פלט הם: מיקום ציר הסיבוב של המסגרת הראשונה ('התחל מוקד'), מספר פרוסות בערימה המשוחזרת ("מספר הצעדים"); מרחק צירי בין כל פרוסה במחסנית ("גודל צעד") .
- כדי לשחזר את האובייקטים עם הפרופורציות הנכונות, גודל הצעד צריך להיות באותו הגודל כמו את מרווח פיקסל לרוחב. הזן את התדר של המצלמה לרוחב דגימה (מרווח 1/pixel) בתיבת 'Pixel / מיקרון', אורך גל התאורה ומקדם שבירה בינונית בשתי התיבות האחרונות. ערכי ברירת המחדל של התכנית מתאימים לשחזור נתונים ירושלים.
- לחץ על הכפתור 'Z-שיפוע פליפ "אם מרכז objeCT הוא כהה בהולוגרמה (ראה דוגמא מסגרת 2005 וסעיף הדיון לפרטים נוספים).
- בדקו את מסנן bandpass / כיבוי מדינה (ברירת מחדל הוא על). מסנן זה אופציונלי bandpass, הממוקם בתיבה שמתחת למתג שיפוע-Flip, הוא אחראי לדיכוי התרומה מפיקסלים רועשים. מסנן bandpass מוחל על כל פרוסה תמונה באופן מיידי אחרי הדור.
- בדוק את מתג תוצרת ביניים במדינות / כיבוי (ברירת מחדל היא על). צעדי ניתוח ביניים שנכתבו בשני קטעי וידאו פלט, כדחוס קבצי avi:. הראשון הוא הערימה מקדה מחדש (שם קובץ מסתיים ב '_stack.avi'), השני היא הערימה לאחר ניתוח השיפוע הצירי (שם קובץ מסתיים ב ' _gradient.avi '). באופן אידיאלי, ערימה שנייה תכיל את מושא העניין מודגש כאובייקט בהיר על רקע כהה.
- לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על 'הפעל' בחלון הראשי. המסגרת שנבחרה תופיע בתיבה הראשית של התוכנה.
- השתמשכלי זכוכית מגדלת שנמצא בסרגל הכלים בצד השמאל של התמונה כדי להגדיל ב( קליק שמאלי) ולהקטין את התצוגה (shift + קליק שמאלי). השתמש בכלי המלבן בסרגל הכלים כדי לבחור אזור של העניין (ROI). ללכוד כמה שיותר מהשולים של הולוגרמה ככל האפשר בתוך המלבן, כמו זה יהיה לייעל את השיקום.
- לחץ על הכפתור 'התהליך' כדי ליצור שתי ערימות תמונה. בדוק את הערימות וכתוצאה מכך באמצעות ImageJ (שניתן להשיג בחינם בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/). אם האובייקט של עניין ניתן לראות בתמונת מחסנית הצבע באופן ברור, המשך לשלב הבא כדי לחלץ את קואורדינטות האובייקט.
3. טיוח
- חוץ ממיקוד מחודש מסגרת, תכנית זו יכולה לאתר את x, y, z קואורדינטות עבור כל voxel באובייקט של עניין. לחץ על הכפתור 'הפקת תכונה' כדי לאפשר פונקציה זו.
- הזן את נתיב, כולל סיומת (לדוגמא: c: output.inc הבית), עבורפלט קובץ קואורדינטות. בחר 'סגנון POV-Ray' בתיבה 'פלט לתאם סגנון'. זה גורם לתכנית לכתוב קובץ אובייקט שניתן דמיינו באמצעות החבילה חינם POV-Ray תוכנת raytracing (אשר ניתן להשיג מhttp://www.povray.org/).
- לעבד מחדש את התמונות כאמורות בסעיף 2 לעיל. התכנית תספק סדרה של (x, y, z) קואורדינטות בהחזר על ההשקעה שנבחרה, שנכתבה לשם הקובץ ב'הפלט לתאם 'התיבה. חילוץ של קואורדינטות אובייקט לוקח משמעותי יותר מאשר דור ערימה.
- ודא כי מדגם קובץ POV-Ray (מסופק עם קוד השיקום) הוא באותה התיקייה כקואורדינטות להגיש רק נוצרו. ערוך את קובץ POV מדגם. ולהחליף את שם הקובץ במרכאות כפולות על הקו
# Include "MYFILE.inc"
עם השם של קובץ נתונים שנוצר על ידי קוד השחזור. - לחץ על לחצן 'הפעלת' בPOV-Ray כדי להבהיר תמונת מפת סיביות. Tהוא מיקום המצלמה, תאורה ואפשרויות מרקם הם רק כמה מההתאמות אפשריות בPOV-Ray, ראה את התיעוד באינטרנט לקבלת פרטים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את היכולות של DIHM, ניסויים בוצעו על שרשרת של חיידקי סטרפטוקוקוס. השרשרת עצמה נמדדה 10.5 מ"מ ארוכה, והייתה מורכבת מ6-7 תאי sphero-גלילי (שניים מהתאים בשרשרת קרובים לחלוקת) בקטרים בטווח 0.6-1 מיקרומטר. איורים 1A ו-1B להראות את הממשק הראשי של השיקום ותוכנת עיבוד תמונה. דוגמאות להליך המיקוד המחודש המספרי ניתן לראות באיור 2, שבו מסנן bandpass מרחבית הוחל. איור 3 מציג את ההשפעה של מסנן הצבע על התמונות באיור 2. הנתונים הגולמיים המשמשים לבניית שתי תמונות אלה יחד עם הורדת הקוד כמו בדוגמה של מסגרת 108. לבסוף, איור 4 מראה את ההשפעה של נתונים באיכות טובות וגרועים בגיאומטריה המשוחזרת. שני המסגרות בדמות האחרונה נלקחו מסרטון של סםשרשרת דואר של תאים (שרשרת שונה לאחד בשתי הדמויות הראשונות). שיקום טוב הוא אפשרי ברוב המקרים, אבל כאשר השרשרת מכוונת בסופו ב-השחזור נכשל, נותן חפץ עגול גדול במישור המוקד. מצב כשל זה אופייני לאובייקטים בכיוון לאורך הציר האופטי. לקנה מידה, בתמונות במחשב שניתנו, הבדיקות על הרצפה הן 1 מיקרומטר בצד. לדיון מפורט יותר של הדיוק והדיוק של שיטה זו, קוראים צריכים להתייעץ וילסון וג'אנג 19.
איור 1. ממשקי תוכנה. הממשק הראשי של תוכנת השחזור מוצג בפנל (א), שבו תיבות קלט קובץ, פרמטרים הגדרות הגלובליות ותכונות חשובות נוספותהמכונה בטקסט כבר מסומן. לוח (ב) מציג את קובץ דוגמא הסצנה לPOV-Ray, בעורכת סצנת ברירת מחדל של התכנית. שם הקובץ בין מרכאות כפולות בקו שצוין צריך להיות מוגדר לקובץ הפלט מתוכנת השחזור. ייתכן שיהיה צורך לשנות את מיקום המצלמה וכיוון (סעיף רלוונטי מצויינים) כדי להמחיש את השיקום כמו שצריך. עיין בתיעוד של POV-Ray באינטרנט לקבלת הוראות נוספות. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. דוגמאות לתמונות מקדו מחדש מבחינה מספרית. לוחות הדמות בהצגת העמודה השמאלית מקדו מחדש מבחינה מספרית(X, y) מטוסים במגוון רחב של גבהים בנפח המשוחזר (כפי שצוין). שמאלי התמונה התחתונה מראה את נתוני הולוגרמה המקוריים, מחולקים דרך על ידי נתוני רקע. הפנל הגדול בצד הימין מראה פרוס (x, z) דרך אותה הערימה. נקודת היפוך ניגוד לאורך ציר z ניתן לראות בבירור כבשליש מהדרך מהחלק העליון של התמונה. הקווים האדומים בתכנית התמונה הגדולה יותר שבו המטוס הזה (x, z) מצטלב מטוסים (x, y) משמאל. בדומה לכך, הקווים הכחולים בלוחות הקטנים יותר להראות את הצומת של הפרוסה (x, z). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. דוגמאות לתמונות מסוננות שיפוע.0; תמונה זו מראה את ההשפעה של החלת המסנן ההדרגתי לנתונים באיור 2. שים לב שמושא העניין מסומן כנקודת אור סימטרית. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. דוגמאות לנתונים שיובילו לתמונות שניתנו טובות וגרועות. שתי תמונות בפנלים (א) ו (ג) נלקחו מאותו הסרטון של שרשרת מתגלגלת של תאים. הנתונים בפנל (א) הם נציג של רוב המסגרות בסדרה זו, שבה השרשרת לא מונחה ישירות לאורך הציר האופטי. הצורה והמיקום של האובייקט הן לשכפל בנאמנות בטיוח בפנל (ב). במקרה של פנל (ג), השרשרת הייתה לרגע בכיוון קצה למישור המוקד; אובייקטים בתצורה זו הם קשה לשחזר, ובדרך כלל תשואה 'בועה' קרובה למישור המוקד, כפי שניתן לראות בפנל (ד ). לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעד החשוב ביותר בפרוטוקול ניסוי זה הוא הלכידה מדויקת של תמונות מהתקנה ניסיונית יציבה. עם נתוני רקע עניים, שיקום באיכות גבוהה הוא כמעט בלתי אפשרי. כמו כן, חשוב להימנע מעדשות אובייקטיביות עם אלמנט פנימי שלב ניגוד (נראה כמו annulus כהה כאשר מסתכל דרך החלק האחורי של אובייקטיבי), כמו זה יכול לבזות את התמונה המשוחזרת. האובייקט של עניין צריך להיות רחוק מספיק ממטוס המוקד כי כמה זוגות של שוליים עקיפה נראים בתמונה שלה (היוריסטי מתאים הוא שהדפוס חסר המיקוד אמור להופיע לי 10 פעמים הממד הליניארי של האובייקט הממוקד - לראות את נתוני דוגמא ). אובייקטים קרובים מדי למישור המוקד סובלים מחפצי תאום תמונה ודגימה, כפי שתוארו לעיל. כמו כן, חשוב שיהיו לי אפיון טוב של ריווח פיקסל של המצלמה, כמו זה הוא גורם קריטי בצורה נכונה קביעת מרחקי refocus. לעתים קרובות, documentat מצלמהיון יפרט 'גודל פיקסל' במפרט, זה יכול להיות קצת מעורפל, כי סוגים מסוימים של מצלמה (מצלמות CMOS בפרט) יכולים להיות אזורים משמעותיים של הרווח בין פיקסלים שאינם רגישים לאור. הדרך אמינה ביותר כדי להשיג מידע זה היא להשתמש ביעד כיול סטנדרטי, כגון תרשים רזולוציה USAF 1951, ולמדוד את תדר הדגימה (מספר פיקסלים למיקרומטר) ישירות מתמונה.
במגבלה של תאורת מונוכרומטי, הרזולוציה של מערכת DIHM מוגדרת סופו של דבר על ידי הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית (NA) ואת אורך הגל של תאורה (λ) 23,24. נקודות הפרידו רוחבי צריכים לשכב לפחות מרחק Δ lat = 'λ' / 2nA לגזרים אם הם להיפתר בנפרד. כמו כן, מגבלת הרזולוציה צירית במקרה האידיאלי ניתנת על ידי הגרזן 'Δ' = λ / 2 (NA) 2. בעת השימוש בLED בDIHM, יש גבול לעומק שלהנפח שעשוי להיות צילם; זה נקבע סופו של דבר על ידי המערכת האופטית והלכידות של התאורה. עומק טיפוסי של "נפח רגיש 'זה הוא סביב 100-200 מיקרומטר לנורית, אם כי ניתן למצוא תיאור מפורט של סוג זה של השפעה במקומות אחרים 25. הנפח רגיש מוגבל בשני כיוונים האחרים על ידי הגודל של התמונה. למרות שהתוכנה היא חזקה למדי, פעולות מסוימות ולא זיכרון רעב. שחזור ערימת תמונה וקבלת שיפוע עוצמת שניהם שמרניים למדי, אבל חילוץ הקואורדינטות של תכונה של עניין מתוך ערימת שיפוע יכול לצרוך הרבה זיכרון (כמה מאה מגה בייט לכמה ג'יגה). לשם כך, רצוי להגביל את עוצמת הקול המשוחזרת של עניין ל100-150 פיקסלים בכל ממד. הגבלה זו אפשר להקל במידה מה אם הקוד לרוץ על מערכת הפעלה של 64 קצת עם יותר מ 4 GB של זיכרון RAM (התוכנה נכתבה על מכונה עם 12 GB),למרות שזמן חישוב יכול להיות גבוה מדי.
כדי לבחון מערכת גדולה יותר, ניתן להחליף את מקור אור LED על ידי לייזר, המאפשר שחזור של אובייקטים שוכבים בעומק הרבה יותר גדול ממישור המוקד - בקלות עד מילימטרים - ובהגדלה נמוכה. ניסויים ראשוניים בהתקנה כזו, באמצעות דיודות לייזר מצמידים את סיבים אופטיים במצב יחיד, אפשרו מעמקים משוחזרים עד 10 מ"מ באמצעות מיקרוסקופ מטרת 10X. עומק המוגבר של שדה מגיע במחיר, לעומת זאת, אורך קוהרנטיות הגדול של הלייזר גורם לרעש בתמונה, השתקפויות במיוחד ממשטחים שונים ברכבת האופטית השפעות אלו קוזזו במידה מה (קירות של חדר המדגם, משטחי עדשה, וכו '.) כאשר המכשיר הוא יציב מספיק כדי לקבל תמונת רקע טובה. עם זאת, יש השתקפויות זרות הפצה לא ידועה של שלבים, כך שאם הגודל שלהם דומה לזו של גל התייחסות (אור unscattered), reconstruction יכול להפוך לבלתי אפשרי. מחברים אחרים שינו את הקוהרנטיות של מקור אור הלייזר, למשל, על ידי ויסות לייזר נהיגה 26 הנוכחיים או באמצעות מסך זכוכית גרוס מסתובב להפחית קוהרנטיות 27.
מנקודת מבט של פתרון בעיות, רוב הבעיות נתקלו בעת השימוש בתוכנת השחזור הולוגרפי נפתרים הטוב ביותר על ידי בדיקת שלבי ביניים של ניתוח נתונים. במקרה של ערימת התמונה המשוחזרת, האובייקטים צריכים 'deblur' סימטרי כפי שהם באים אל מוקד. אם השוליים העקיפה נראים מאוד לא סימטריים, תמונת רקע עני או קיזוז היא לעתים קרובות להאשים. אם התמונה לשיקום נלקחה מערימה של תמונות דומות, למשל מסגרת מוידאו רצף של אובייקט נע, לפעמים יכולה להיות מושגת תמונת רקע על ידי חישוב ממוצע (לפי ממוצע או חציון) ערכי פיקסל על פני כל הווידאו מסגרות. אם הנושא נע באופן משמעותי במהלך רצף וידאו,תרומה לכל ערך פיקסל אחד היא קטנה והתרומה הדומיננטית תגיע ממסגרות הרקע ללא שינוי שבנושא היה נעדר. במקרה שבו לא יוחזרו הקואורדינטות של אובייקט כמו שצריך, שערימת תמונת השיפוע יכולה להיות שימושי לאבחון. אם האובייקט נתפס כחלל מוקף טבעת בהירה בערימת תמונת השיפוע, מסנן השיפוע צריך להיות התהפך והתמונה לעיבוד חוזרת. כפי שהוזכר במבוא, שיטת שיקום ריילי-זומרפלד אינה רגישה לסימן למרחק של עצם ממישור המוקד. אם שני אובייקטים בחולשה-פיזור הם באותו מרחק ממישור המוקד, אבל משני צדים מתרס, הם היו באים אל מוקד על אותה העמדה בערימת התמונה המשוחזרת. עם זאת, דפוסי העצמה הצירי שלהם יהיו הפוכים. מרכז האובייקט שנמצא במקור מעל למישור המוקד (ביחס לגיאומטרית מיקרוסקופ ההפוכה) משתנה מאור לחושך שבעבר פו בפוקוסsition, ואילו האובייקט מתחת למוקד שינויי המטוס מחושך לאור. אפשרות השיפוע להעיף לכן תמציות או חפצים מעל למישור המוקד (ברירת מחדל) או מתחת למישור המוקד (עם השיפוע להעיף מוגדרים 'על'), נותנת צירי חד משמעי לתאם. שים לב שזה מחזיק אך ורק רק לאובייקטים בחולשה-פיזור; השיטה עובדת טוב מאוד עבור זעירים מקלקר עד 1 מיקרומטר בקוטר, אך פחות טוב לחלקיקי פוליסטירן גדולים יותר. דגימות ביולוגיות בדרך כלל מפגינות פיזור חלש בהרבה, כמדדי השבירה שלהם הם קרובים יותר לזה של המדיום שמסביב (יש קלקר מקדמת שבירה קרובה ל1.5), ניתן ללמוד אובייקטים כל כך גדולים.
במונחים של כיוונים עתידיים, תוכנה זו ניתן תהיה להאריכו לעבד מסגרות מרובות בוידאו, כדי לאפשר מעקב אחר מיקרואורגניזמים שחייה או חלקיקי colloidal בשלושה ממדים. קצב הפריימים הגבוה שהטכניקה מאפשרת הוא גם מתאים לעוקב אפילו לשחות בקצב המהיר ביותרמרס, כגון alginolyticus Vibrio שוכני הים, ששוחה במהירויות של עד 150 מיקרומטר / 28 שניות. מסלולי השחייה המיקרוסקופיים של תאים בודדים היו במעקב הראשון לפני כמה זמן 29, אבל זה בדרך כלל דורש מנגנון מיוחד. שלב Gouy האנומליה להתקרב לא רק משאיל את עצמו למעקב פשוט של תאים בודדים על פני מרחקים ארוכים, אבל מעניקה ההזדמנות לבחון את הקשר בין שחייה ההתנהגות של אנשים שונים. זה תלוי באופן ספציפי על גיאומטריה תלת ממדי, נתונים שהייתה בלתי נגיש עד כה מסיבות טכניות.
כפי שהוזכר במבוא, השוואה עם מיקרוסקופיה confocal הקרינה היא לא אידיאלית, אבל ההמצאות בכל המקום של מערכות confocal עושה השוואה של היבט ההדמיה תלת ממדי כדאי. למעשה, DIHM הוא משלים למיקרוסקופיה confocal, יש יתרונות וחסרונות יחסיים של שניהם. DIHM מאפשר acquisitio נתונים הרבה יותר מהרשיעורי n: כמה אלף כרכים לשנייה הוא שיגרתי, נתנו מספיק מהר מצלמה. זה מאפשר מעקב של (למשל) חיידקים מרובים שחייה, שהוא מעבר ליכולת של מערכות confocal איטיות יותר. אפילו עם מצלמה מהירה, DIHM הוא בסדר גודל יותר זול מאשר מיקרוסקופיה confocal, והנתונים עבור נפח תלת ממדי יכולים להיות מאוחסנים בתמונה דו ממדית בודדת, הפחתת דרישות אחסון נתונים וגיבוי. DIHM הוא יותר להרחבה בקלות במובן זה שעובד עם בהגדלה נמוכה, מדגמים גדולים יותר ומרחקים ארוכים יותר עובדים הוא טריוויאלי. מיקרוסקופיה confocal עדיין יש את היד העליונה בדגימות צפופות או מורכבות, עם זאת. לדוגמא, בcolloidal השעיה צפופה, פיזור מרובה עושה שחזור הולוגרפי כמעט בלתי אפשרי; מערכת confocal באו פליטת ניאון או מצב השתקפות תהיה מתאימה יותר ללימוד מערכות כאלה 9. יתר על כן, מיקרוסקופיה confocal היא בחירה טבעית יותר עבור מערכות ניסיוניות שבה fתיוג luorescent הוא בעל חשיבות מרכזית. למרות הולוגרפיה הקרינה הוכח לעבוד עם מגוון רחב של נושאי בדיקה 30 יעילות האוסף היא כיום נמוכה בהרבה מזה של מערכת confocal טובה. יתר על כן, מערכות ניסיוניות כאלה דורשים כיום מנגנון אופטי מומחה וניסיון לפעול; אני מקווה שהם יהיו יותר זמינים באופן נרחב בפיתוח נוסף.
לסיכום, DIHM הוא שאין כמותו ביכולתה לרכוש ברזולוציה גבוהה תמונות תלת ממדיות של עצמים מיקרוסקופיים, במהירויות גבוהות. אנו מספקים תוכנה ידידותית למשתמש שעושה את הטכניקה הזו נגישה לnonspecialist עם שינויים מינימאליים למיקרוסקופ קיים. יתר על כן, תוכנת השחזור משתלבת בקלות עם תוכנת מחשב עיבוד זמינה באופן חופשי. זה מאפשר הדמיה אינטואיטיבית של נושאים מיקרוסקופיים, צפייה מכל זווית. בהתחשב באופי תלת ממדי של תהליכים מיקרוסקופיים במהירות רבות involving אובייקטים בחולשה-פיזור (למשל להכות שוטונים או cilia אוקריוטים, ברכת שחיידקים, או לשדר קולואידים), טכניקה זו צריכה להיות של עניין על פני מגוון רחב של תחומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים מודים ללינדה טרנר לקבלת סיוע בהכנת המיקרוביולוגית. RZ וLGW מומנו על ידי מכון רולנד בהרווארד וCGB מומן כחוקר של קרן שכמיות, המדע ללא גבולות תכנית, ברזיל (# 7340-11-7 תהליך)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm |
| LED power supply | Thorlabs | LEDD1B | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
References
- Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).
- Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).
- Lee, S. H., Roichman, Y., et al. Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy. Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).
- Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy. Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).
- Lee, S. H., Grier, D. G. Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures. Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).
- Kim, M. Principles and techniques of digital holographic microscopy. SPIE Rev. 1, 018005 (2010).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A.
- Santi, P. Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review. J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- van Blaaderen, A., Wiltzius, P. Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).
- Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear. Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).
- Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses. Science. 318, 1895-1899 (2007).
- Rosen, J., Brooker, G.
- Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy. Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).
- Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical. J. Vis. Exp. 34, (2009).
- Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl. Opt. 47 (19), (2008).
- Elliot, M. S., Poon, W. C. K. Conventional optical microscopy of colloidal suspensions. Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).
- Born, M., Wolf, E. Principles of Optics, 6th Ed. , Cambridge University Press. (1998).
- Wilson, L., Zhang, R. 3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation. Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).
- Bohren, C., Huffman, D. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
- Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. Refractive index of escherichia coli cells. Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).
- Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria. Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).
- Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J.
- Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform. Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).
- Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence. Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).
- Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers. Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).
- Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source. Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).
- Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed. Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).
- Berg, H. C., Brown, D. A. Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking. Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).
- Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy. Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).
