Summary
De driedimensionale locaties van zwak-verstrooiende objecten kan uniek worden geïdentificeerd middels inline digitale holografische microscopie (Dihm), die een geringe wijziging betreft een standaard microscoop. De software gebruikt een eenvoudige weergave heuristische combinatie met Rayleigh-Sommerfeld back-overdracht naar de driedimensionale positie en geometrie van een microscopische fase-object verkregen.
Abstract
Zwak-verstrooiing voorwerpen, zoals kleine colloïdale deeltjes en de meeste biologische cellen, vaak aangetroffen in microscopie. Inderdaad zijn een aantal technieken ontwikkeld om deze fase objecten beter visualiseren, fase contrast en DIC behoren tot de meest populaire methoden voor het verbeteren van contrast. Echter, het opnemen van positie en de vorm in de richting out-of-imaging-plane blijft uitdagend. Dit rapport introduceert een eenvoudige experimentele methode om nauwkeurig te bepalen van de locatie en de geometrie van objecten in drie dimensies, met behulp van digitale inline holografische microscopie (Dihm). In grote lijnen is de toegankelijke monstervolume bepaald door de grootte camerasensor in zijdelingse richting en de verlichting samenhang in de axiale richting. Typische monstervolumes variëren van 200 urn x 200 urn x 200 urn met LED-verlichting te5 mm x 5 mm x 5 mm of groter met laserbelichting. Deze verlichting licht is zodanig geconfigureerd dat vlakke golven zijn incident op het monster. Objecten in het monster volume dan licht verstrooien, die interfereert met de verstrooide licht om interferentie patronen vormen loodrecht op de verlichting richting. Dit beeld (het hologram) bevat de diepte informatie die voor driedimensionale reconstructie en kan worden vastgelegd op een standaard beeldvormingsinrichting zoals een CMOS of CCD-camera. De Rayleigh-Sommerfeld back vermeerderingsmethode toegepast om numeriek heroriënteren microscoop afbeeldingen en een eenvoudige weergave heuristische basis van de Gouy fase anomalie wordt gebruikt voor het identificeren verstrooiing objecten in het gereconstrueerde volume. Deze eenvoudige maar robuuste methode resulteert in een eenduidige, model-free meten van de locatie en vorm van objecten in microscopische monsters.
Introduction
Digitale inline holografische microscopie (Dihm) maakt een snelle driedimensionale beeldvorming van microscopische monsters, zoals zwemmen micro-organismen 1,2 en zachte materie systemen 3,4, met een minimale wijziging van een standaard microscoop setup. In deze paper wordt een pedagogische demonstratie van Dihm wordt verstrekt, gecentreerd rond software ontwikkeld in ons lab. Dit document bevat een beschrijving van het instellen van de microscoop, het optimaliseren van data-acquisitie, en de opgenomen beelden tot drie-dimensionale data reconstrueren verwerken. De software (gedeeltelijk gebaseerd op software die is ontwikkeld door DG Grier en anderen 5) en bijvoorbeeld beelden zijn vrij beschikbaar op onze website. Een beschrijving wordt gegeven van de stappen die nodig zijn om de microscoop te configureren, te reconstrueren drie-dimensionale volumes van hologrammen en maken de resulterende volumes van belang gebruik van een gratis ray-tracing software pakket. Het document besluit met een bespreking van factoren die de kwaliteit van de wederopbouwEn een vergelijking van Dihm met concurrerende methoden.
Hoewel Dihm werd enige tijd geleden beschreven (voor een algemene herziening van haar principes en ontwikkeling, zie Kim 6), heeft de benodigde rekenkracht en beeldverwerking deskundigheid tot nu toe grotendeels beperkt het gebruik ervan tot gespecialiseerde onderzoeksgroepen met een focus op de ontwikkeling instrument. Deze situatie is aan het veranderen in het licht van recente ontwikkelingen in de computer-en cameratechnologie. Moderne desktop computers kan gemakkelijk omgaan met de verwerking en opslag van gegevens eisen, CCD-of CMOS-camera's aanwezig in de meeste microscopie labs zijn, en de benodigde software wordt gratis beschikbaar gesteld op het internet door groepen die tijd hebben geïnvesteerd in de ontwikkeling van de techniek.
Verschillende systemen zijn voorgesteld voor het afbeelden van de configuratie van microscopische objecten in een driedimensionale monstervolume. Veel van deze technieken scannen 7,8, waarbij een stapel van beelden opgenomen door mechanically vertalen van het beeldvlak door het monster. Scanning confocale fluorescentie microscopie is misschien wel het meest bekende voorbeeld. Meestal wordt een fluorescente kleurstof toegevoegd aan een fase-object om een aanvaardbaar monster contrast bereiken en confocale inrichting gebruikt om ruimtelijk lokaliseren fluorescente emissie. Deze werkwijze heeft tot significante vooruitgang, bijvoorbeeld colloïdale wetenschap waar zij de toegang tot de driedimensionale dynamica van druk systemen 9-11 is toegestaan. Het gebruik van etikettering is een belangrijk verschil tussen fluorescentie confocale microscopie en Dihm, maar andere kenmerken van de twee technieken zijn de moeite waard te vergelijken. Dihm een aanzienlijk snelheidsvoordeel dat de inrichting geen bewegende delen. De mechanische scanning spiegels confocale systemen plaats een bovengrens voor de data-acquisitie rate - meestal ongeveer 30 frames / sec beeld een 512 x 512 pixels. Een stapel van dergelijke beelden van verschillende beeldvlakken worden verkregen door fysisch translAting de monstertafel of objectieflens tussen frames, waardoor een uiteindelijke opnamesnelheid van ongeveer een volume per seconde voor een 30 lijst stapel. Ter vergelijking, kan een holografisch systeem gebaseerd op een moderne CMOS-camera 2000 beelden / sec vast te leggen op hetzelfde beeldformaat en de resolutie, elk frame is verwerkt `offline 'aan een onafhankelijke momentopname van het monster volume te geven. Nogmaals: fluorescerende monsters niet vereist voor Dihm, hoewel een systeem ontwikkeld dat holografische reconstructie van een fluorescerende onderwerp 12 uitvoert. Naast driedimensionaal volume informatie Dihm kan ook worden gebruikt om kwantitatief fasecontrast beelden 13 verschaffen, maar die buiten het bereik van de hier besproken.
Ruwe Dihm gegevens beelden zijn twee-dimensionaal, en in sommige opzichten er als standaard microscoop beelden, zij het onscherp. Het belangrijkste verschil tussen Dihm en standaard helderveld microscopie ligt in het afbuigende ringen die voorwerpen omringen in het gezichtsveld, dit zijn vanwege de aard van de verlichting. Dihm vereist een meer coherente bron dan helder veld - meestal een LED of laser. De diffractie ringen in het hologram bevatten de informatie die nodig is om een driedimensionaal beeld te reconstrueren. Er zijn twee belangrijke benaderingen van het interpreteren Dihm gegevens; directe montage en numerieke heroriëntatie. De eerste benadering is wanneer het wiskundige vorm van het diffractiepatroon vooraf 3,4 bekend toepassing; deze voorwaarde wordt voldaan door een klein aantal eenvoudige objecten zoals bollen, cilinders en halfvlak obstakels. Directe montage is ook in gevallen waarin axiale positie van het object bekend is van toepassing, en het beeld kan worden gemonteerd met behulp van een opzoektabel van beeldsjablonen 14.
De tweede benadering (numeriek heroriëntatie) is eerder algemeen en gebaseerd op het gebruik van de diffractie ringen beeld tweedimensionale hologram numeriek reconstrueren optische veldeen aantal (willekeurig verdeelde) brandvlakken door het monster volume. Verschillende verwante methoden bestaan om dit te doen 6; dit werk gebruikt de Rayleigh-Sommerfeld terug voortplanting techniek zoals beschreven door Lee en Grier 5. De uitkomst van deze procedure is een stack van beelden die het effect van de microscoop focal plane (vandaar de naam `numerieke heroriëntatie ') handmatig veranderen repliceren. Zodra een stapel van beelden is gegenereerd, moet de positie van het subject in het brandpunt volume verkregen. Een aantal beeldanalyse heuristiek, zoals lokale intensiteit variantie of ruimtelijke frequentie-inhoud, zijn voorgelegd aan de scherpte van de focus te kwantificeren op verschillende punten in de steekproef 15. Telkens wanneer een bepaald beeld gegeven wordt gemaximaliseerd (of geminimaliseerd), wordt het object beschouwd in focus.
In tegenstelling tot andere programma's die streven naar een bepaalde focal plane waar een object 'in focus' te identificeren, de methode in dit werk eruit pikt points dat in het object van belang liggen, die kan zich uitstrekken over een breed scala van focale vliegtuigen. Deze benadering is toepasbaar op een breed scala van onderwerpen en is bijzonder geschikt voor verlengd zwak verstrooiende monsters (fase voorwerpen), zoals staafvormige colloïden, ketens van bacteriën of eukaryote flagella. In deze monsters wijzigt het contrast wanneer het object door de focal plane passeert, een onscherpe beeld heeft een licht centrum als het object is aan de ene kant van de focal plane en een donker centrum als het op de andere. Zuivere fase objecten hebben weinig tot geen contrast wanneer ze liggen precies in het brandvlak. Dit fenomeen van contrast inversie is besproken door andere auteurs 16,17 en uiteindelijk door de Gouy fase anomalie 18. Dit is een meer rigoureuze voet in de context van holografie zetten elders waar de grenzen van de techniek worden geëvalueerd, de typische onzekerheid in positie is in de orde van 150 nm (ongeveer een pixel) in each richting 19. De Gouy fase anomalie methode is een van de weinige welomschreven Dihm's voor bepalen van de structuur van uitgebreide objecten in drie dimensies, maar toch sommige objecten problematisch te reconstrueren. Objecten die direct langs de optische as (wijzend naar de camera) liggen zijn moeilijk nauwkeurig te reconstrueren, onzekerheden in de lengte en de positie van het object worden groot. Deze beperking is voor een deel te wijten aan de beperkte bitdiepte van de pixels opnemen van het hologram (het aantal verschillende grijstinten die de camera kan opnemen). Een ander problematisch configuratie treedt op wanneer het object van belang is zeer dicht bij het brandvlak. In dit geval worden de reële en virtuele beelden van het object gereconstrueerd in de nabijheid, die tot ingewikkelde optische velden die moeilijk te interpreteren zijn. Een tweede, iets minder belangrijk zorg is hier dat de resulterende diffractie franjes nemen minder van de beeldsensor, en dit-grovere korrel informatie leidt tot een slechtere kwaliteit van de wederopbouw.
In de praktijk wordt een eenvoudige verloop filter toegepast driedimensionaal volume sterke tot inversies detecteren langs de belichting richting. Regio's waar de intensiteit verandert snel van licht naar donker, of vice versa, worden vervolgens gekoppeld aan verstrooiing regio. Zwak-verstrooiing objecten zijn goed beschreven als een noninteracting verzameling van dergelijke elementen 20, deze individuele bijdragen som aan de totale verstrooide veld die gemakkelijk wordt omgekeerd met behulp van de Rayleigh-Sommerfeld terug voortplanting methode. In dit artikel wordt de axiale intensiteit gradiënt techniek toegepast op een keten van Streptococcus cellen. De cellichamen zijn fase objecten (de soort E. coli heeft een brekingsindex gemeten 21 om 1,384 bij een golflengte λ = 589 nm, de Streptococcus stam waarschijnlijk vergelijkbaar zijn) en worden als een hoge-intensiteit keten van verbonden blobs in the monster volume na verloop filter is toegepast. Standaard drempel en feature extractie toegepaste deze gefilterde volume kan de extractie van volumetrische pixels (voxels) overeenkomt met het gebied binnen de cellen. Een bijzonder voordeel van deze werkwijze is dat het eenduidige reconstructie van de positie van een object in axiale richting. Vergelijkbare methoden (tenminste, die dat record hologrammen dicht bij het object, in beeld gebracht door middel van een microscoop objectief) last van het niet kunnen het teken van deze verplaatsing te bepalen. Hoewel de Rayleigh-Sommerfeld reconstructie methode is ook aanmelden onafhankelijk in die zin is de gradiënt werking stelt ons in staat om onderscheid te maken tussen zwakke fase objecten boven en onder het brandvlak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Setup and Data Acquisition
- Grow een cultuur van Streptococcus stam V4051-197 (gladde zwemmen) cellen in KTY medium uit ingevroren voorraad 22. Incubeer in een rondschudapparaat nacht bij 35 ° C en 150 rpm, tot verzadiging.
- Inoculeren 10 ml vers KTY medium met 500 ul van de verzadigde cultuur. Incubeer nog eens 3,5 uur bij 35 ° C en 150 rpm totdat de cellen te bereiken een optische dichtheid van ongeveer 1,0 bij λ = 600 nm (ongeveer 5 x 10 8 cellen / ml).
- 1:400 verdund in vers medium tot de eindconcentratie van beweeglijke cellen te verkrijgen.
- Op een microscoopglaasje, maak een ring vet (bijvoorbeeld van een injectiespuit gevuld met vaseline) ongeveer 1 mm hoog en een druppel van de monsteroplossing in het centrum. Plaats een deksel glas aan de bovenkant en druk licht aan de randen te verzegelen, zodat vloeistof in contact met zowel glijbaan en dekglas. De resulterende monsterkamer moet arou zijnnd 100-200 urn in de diepte.
- Plaats de monsterkamer in de microscoop met de dekglas naar beneden en voorzichtig, om de vorming van luchtbellen in de olie tussen glas en de lens te voorkomen.
- Focus de microscoop op het bodemoppervlak van de monsterkamer en breng de condensor te concentreren.
- Schakel de standaard verlichting en de LED hoofd achter de condensor opening van de microscoop. Zet de LED voeding om een maximaal rendement.
- Sluit de condensor diafragma in zijn volle omvang, en indien nodig, nudge de LED in de berg tot aan de verlichting is gericht op de doelstelling lensopening.
- Schakel de computer en de camera, en omleiden al het licht van de camera-poort van de microscoop. Stel de framesnelheid en de beeldgrootte in het beeld acquisitie software.
- Maak het frame belichtingstijd zo kort mogelijk behoud goed contrast. Controleer een beeld histogram om ervoor te zorgen dat het beeld niet verzadigingted of onderbelicht.
- Indien nodig, te heroriënteren de microscoop zodat interessant object enigszins onscherp (meestal met 10-30 micrometer). Het object en de focal plane moet in hetzelfde medium (dwz de focal plane moet binnen de monsterkamer liggen).
2. Reconstructie
De eerste stap van de verwerking gegevens numeriek heroriënteren een videoframe in een reeks van verschillende dieptes, waardoor een stapel afbeeldingen. Gebruiksvriendelijke software om dit te doen kan hier worden gevonden: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html samen met bijvoorbeeld foto's (verkregen met behulp van een omgekeerde microscoop en een 60X olie-immersie objectief) en een scène bestand voor ray getraceerd rendering.
- Voer het kader van belang en zijn respectievelijke achtergrond als afzonderlijke afbeeldingsbestanden, in de relevante vakken op de interface. Een achtergrond is een frame dat fairly vertegenwoordigt de achtergrond van de video, in afwezigheid van het hologram en wordt gebruikt om vaste patroon ruis die kan interfereren met het hologram lokalisatie en analyse onderdrukken.
- Voer waarden in de algemene instellingen dozen op de linkerkant van het scherm voordat u het programma. De eerste drie zijn uitgang stack parameters: axiale positie van het eerste frame ('Start focus'), het aantal schijfjes in de gereconstrueerde stapel ('Aantal stappen'); axiale afstand tussen elk segment in de stapel ('Step size') .
- Om objecten met de juiste verhoudingen te reconstrueren moeten de stapgrootte even groot als de laterale spatiëring dat beeldpunt. Voer laterale bemonsteringsfrequentie van de camera (1/pixel afstand) bij de 'Pixel / micron' doos, de verlichting golflengte en middelgrote brekingsindex in de laatste twee vakjes. De standaardwaarden van het programma zijn geschikt voor de reconstructie van de voorbeeld data.
- Druk op de knop 'Flip Z-gradiënt' als het centrum van het object is donker in het hologram (zie voorbeeld kader 2005 en de discussie sectie voor meer details).
- Controleer het bandfilter aan / uit stand (standaard is ingeschakeld). Deze optionele bandfilter, gelegen in een vak onder de gradiënt-flip switch, is verantwoordelijk voor het onderdrukken van de bijdrage van luidruchtige pixels. Het banddoorlaatfilter wordt toegepast op elk beeld segment onmiddellijk na generatie.
- Controleer de tussenliggende uitgang schakelaar aan / uit staten (standaard is ingeschakeld). Stappen Intermediate analyse zijn geschreven in twee output video, niet-gecomprimeerde AVI-bestanden:. De eerste is de heroriëntatie van stapel (bestandsnaam eindigt op '_stack.avi'), de tweede is de stack na de axiale helling operatie (bestandsnaam eindigt op ' _gradient.avi). Idealiter zal deze tweede stapel het voorwerp van belang benadrukt als een helder voorwerp tegen een donkere achtergrond bevatten.
- Na het instellen van alle parameters, druk op 'Uitvoeren' in het hoofdvenster. Het geselecteerde kader verschijnt in de grote doos van de software.
- Gebruik devergrootglas gereedschap gevonden in de werkbalk aan de linkerkant van de afbeelding om in te zoomen (klik links) en uitzoomen (shift + linker muisknop). Gebruik de rechthoek op de werkbalk om een regio van belang (ROI) te selecteren. Leg zo veel van franjes het hologram als mogelijk binnen de rechthoek, omdat dit de reconstructie zal optimaliseren.
- Druk op de 'Proces' knop om de twee beeld stapels genereren. Inspecteer de resulterende stapels met behulp van ImageJ (die kan worden verkregen bij http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Als het object van belang duidelijk te zien in het verloop afbeeldingsstapel verder met de volgende stap het object coördinaten extraheren.
3. Weergave
- Naast kader heroriëntatie kan dit programma vinden de x, y, z-coördinaten van elke voxel in het object van belang. Druk op de 'Feature Extraction' knop om deze functie in te schakelen.
- Geef een pad, inclusief de verlenging (bijvoorbeeld: c: home output.inc), voor deuitgang coördineert bestand. Selecteer 'POV-Ray-style' in het vak 'output coördineren stijl'. Dit zorgt ervoor dat het programma op een object bestand dat kan worden gevisualiseerd met behulp van de gratis POV-Ray raytracing softwarepakket (dat kan worden verkregen bij schrijven http://www.povray.org/ ).
- Opnieuw verwerken van de beelden als in sectie 2 hierboven. Het programma zal een aantal (x, y, z) coördinaten in de geselecteerde ROI, geschreven naar de bestandsnaam in de 'Output coördinaat "box verschaffen. Extractie van object coördinaten duurt aanzienlijk langer dan stack generatie.
- Zorg ervoor dat het monster POV-Ray-bestand (met de wederopbouw code meegeleverd) is in dezelfde map als de coördinaten bestand gewoon gegenereerd. Bewerk het pov bestand monster. En vervang de bestandsnaam tussen aanhalingstekens op de lijn
# Include "MYFILE.inc"
met de naam van het bestand gegenereerd door de reconstructie code. - Klik op 'Uitvoeren' knop in POV-Ray naar een bitmap-afbeelding te maken. Thij camerapositie, verlichting en textuur opties zijn slechts enkele van de aanpassingen mogelijk in POV-Ray, zie de online documentatie voor meer informatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om de mogelijkheden van Dihm tonen, werden experimenten uitgevoerd op een keten van Streptococcus bacteriën. De ketting zelf gemeten 10,5 mm lang en bestond uit 6-7 sfero-cilindrische cellen (twee van de cellen in de keten nabij delen) met een diameter in het traject 0,6-1 urn. Figuren 1a en 1b tonen de hoofdinterface van de wederopbouw en rendering software. Voorbeelden van numerieke heroriëntatie procedure worden gezien in figuur 2, waarbij een ruimtelijk banddoorlaatfilter is toegepast. Figuur 3 toont het effect van de gradiëntfilter op de afbeeldingen in figuur 2. De ruwe data gebruikt om zowel van deze beelden te construeren zijn gebundeld met de code downloaden als voorbeeld kader 108. Tenslotte Figuur 4 toont het effect van goede en slechte kwaliteit gegevens over de gereconstrueerde geometrie. Beide frames in dit laatste cijfer zijn afkomstig uit een video van de same keten van cellen (een andere keten die in de eerste twee cijfers). Een goede reconstructie kan in de meeste gevallen, maar wanneer de keten is georiënteerd einde de wederopbouw mislukt, waardoor een grote ronde voorwerp in het brandvlak. Deze fout komt kenmerkend objecten georiënteerd langs de optische as. Voor schaal, in de computer gerenderde beelden, de controles op de verdieping zijn 1 pm aan een kant. Voor een meer gedetailleerde bespreking van de precisie en nauwkeurigheid van deze methode, moeten lezers Wilson en Zhang 19 raadplegen.
Figuur 1. Software interfaces. Het belangrijkste interface van de reconstructiesoftware wordt getoond in paneel (a), waar het bestand invoervelden, algemene instellingen parameters en andere belangrijke functiesDe in de tekst wordt verwezen zijn gemarkeerd. Panel (b) toont het voorbeeld scène bestand voor POV-Ray, in verzuim scène editor van het programma. De bestandsnaam tussen aanhalingstekens op de lijn aangegeven moet worden ingesteld op de output file van de reconstructie software. Het kan nodig zijn om locatie en richting van de camera (relevant gedeelte aangegeven) om goed visualiseren reconstructie veranderen. Zie de online POV-Ray-documentatie voor verdere instructies. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Voorbeelden van numeriek geheroriënteerd beelden. De figuur panelen in de linkerkolom toont numeriek geheroriënteerd(X, y) vlakken op verschillende hoogtes in het gereconstrueerde volume (zoals aangegeven). De afbeelding linksonder toont het oorspronkelijke hologram van gegevens, via gedeeld door de achtergrondgegevens. Het grote paneel aan de rechterkant toont een (x, z) slice door dezelfde stapel. De bijzondere contrast inversie langs de z-as is duidelijk te zien bij ongeveer een derde van de weg van de bovenkant van de afbeelding. De rode lijnen op de grotere afbeelding show waarin dit vlak (x, z) snijdt de (x, y) vliegtuigen naar links. Ook de blauwe lijnen in de kleinere panelen tonen de kruising van de (x, z) slice. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. Voorbeelden van-gradiënt gefilterde beelden.0; Dit beeld toont het effect van de toepassing de gradiëntfilter de gegevens in Figuur 2. Merk op dat het object van belang is gemarkeerd als een symmetrische lichtpuntje. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 4. Voorbeelden van gegevens die tot goede en slechte teruggegeven beelden. Beide afbeeldingen in panelen (a) en (c) werden uit dezelfde video van een tuimelende keten van cellen. De gegevens in paneel (a) zijn representatief voor de meeste frames in deze serie, waarbij de ketting niet georiënteerd rechtstreeks langs de optische as. De vorm en positie van het object worden getrouw weergegeven in deteruggeven in paneel (b). Bij paneel (c), werd de ketting tijdelijk gerichte eind op het brandpuntsvlak, objecten in deze configuratie moeilijk te reconstrueren, en levert doorgaans een 'vlek' nabij het brandvlak, zoals in paneel (d ). Klik hier voor grotere afbeelding .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De belangrijkste stap in deze experimentele protocol is het nauwkeurig vastleggen van beelden van een stabiele experimentele opstelling. Met een slechte achtergrond data, high fidelity reconstructie is bijna onmogelijk. Het is ook belangrijk om objectieven vermijden intern fasecontrast element (zichtbaar als een donkere ring bij het kijken door de achterkant van het doel), omdat deze het gereconstrueerde beeld kunnen afbreken. Het doel van belang moeten ver genoeg van de focal plane dat een paar paren van diffractie franjes zijn zichtbaar in het imago (een geschikte heuristiek is dat de onscherpe patroon moeten verschijnen tot 10 maal de lineaire afmeting van het object met focus hebben - zie voorbeeld ). Objecten te dicht bij het brandvlak last van twin-imago en sampling artefacten, zoals eerder beschreven. Het is ook belangrijk om een goede karakterisering van pixelafstand de camera hebben, aangezien dit een kritieke factor kunnen bepalen heroriënteren afstanden. Vaak camera documentation zal de lijst 'pixelgrootte' in het bestek, dit kan een beetje dubbelzinnig zijn, omdat bepaalde soorten camera (CMOS-camera's in het bijzonder) kunnen belangrijke gebieden van de ruimte tussen de pixels die niet gevoelig zijn voor licht hebben. De meest betrouwbare manier om deze informatie te verkrijgen is om een standaard kalibratie doel te gebruiken, zoals een USAF 1951 resolutie grafiek, en meet de bemonsteringsfrequentie (aantal pixels per micrometer) rechtstreeks uit een afbeelding.
In de limiet van monochromatische belichting, wordt de resolutie van een Dihm systeem uiteindelijk door de numerieke apertuur van de objectieflens (NA) en de golflengte van verlichting (λ) 23,24 stellen. Lateraal gescheiden moeten ten minste een afstand Δ lat = 'λ' / 2NA uit elkaar als ze afzonderlijk worden opgelost liggen. Ook de grens axiale resolutie het ideale geval van de 'Δ' ax = λ / 2 (NA) 2. Bij gebruik van een LED in Dihm, is er een grens aan de diepte vanhet volume dat kan worden afgebeeld, deze wordt uiteindelijk bepaald door het optisch systeem en de samenhang van de verlichting. Een typische diepte van deze 'gevoelige volume bedraagt ongeveer 100-200 micrometer voor een LED, hoewel een gedetailleerd verslag van dit type effect elders 25 kan worden gevonden. De volumeregeling is in de andere twee richtingen beperkt door de grootte van het beeld. Hoewel de software is vrij robuust, bepaalde handelingen zijn vrij geheugen-honger. Reconstrueren van een afbeelding stapel en het verkrijgen van de intensiteit gradatie zijn beide vrij conservatief, maar het extraheren van de coördinaten van een kenmerk van belangstelling van een gradiënt stapel kan veel geheugen verbruiken (enkele honderden megabytes tot enkele gigabytes). Daartoe is het raadzaam om het gereconstrueerde volume plaats beperken tot 100-150 pixels in elke dimensie. Deze beperking kan enigszins worden verlicht als de code wordt uitgevoerd op een 64-bits besturingssysteem met meer dan 4 GB RAM (de software is op een machine met 12 GB geschreven),hoewel rekentijd kan onbetaalbaar worden.
Om een groter systeem te onderzoeken, kan de LED-lichtbron worden vervangen door een laser, die de wederopbouw van de objecten liggen op een veel grotere diepte van de focal plane laat - gemakkelijk tot millimeter - en bij lagere vergroting. Voorlopige experimenten met zo'n opstelling, met een laser diode gekoppeld met een single-mode optische vezel, toegestaan gereconstrueerde diepte van 10 mm met een 10X microscoopobjectief. Deze verhoogde scherptediepte komt op een kostprijs, echter, de laser grote coherentielengte tot beeldruis, vooral reflecties van verschillende oppervlakken in de optische trein Deze effecten zijn enigszins gecompenseerd (de wanden van de monsterkamer, lensoppervlakken, enz..) wanneer het apparaat is stabiel genoeg om goed een achtergrondafbeelding te krijgen. Echter, vreemde reflecties onbekende verdeling van fasen, dus als hun omvang vergelijkbaar is met die van de referentiegolf (verstrooide licht), reconstructie kan onmogelijk worden. Andere auteurs zijn de samenhang van een laser lichtbron gewijzigd, bijvoorbeeld door het moduleren van de laser stuurstroom 26 of met behulp van een roterende glazen scherm grond om de samenhang 27 verlagen.
Vanuit een oogpunt van het oplossen van problemen, de meeste problemen ondervindt bij het gebruik van de holografische reconstructie software zijn het best opgelost door het inspecteren van de tussentijdse stadia van data-analyse. In het geval van het gereconstrueerde beeld stapel, de objecten moet 'Deblur' symmetrisch als ze komen in beeld. Als de diffractie franjes kijken sterk asymmetrisch, een slecht of offset achtergrond vaak de schuld. Als het beeld voor de wederopbouw is overgenomen uit een stapel van soortgelijke foto's, bijvoorbeeld een beeld uit een video-opname van een bewegend object, een achtergrondafbeelding kan soms worden verkregen door het gemiddelde (door gemeen of mediaan) pixelwaarden in alle van de video frames. Als het onderwerp hoofdzaak beweegt in het videobeeld, debijdrage aan een een pixel waarde is klein en de dominante bijdrage zal komen van de ongewijzigde achtergrond frames waarin het onderwerp was afwezig. In het geval waarin de coördinaten van een object niet goed geretourneerd, kan het verloop afbeeldingsstapel een nuttig diagnostisch. Als het object wordt beschouwd als een holte omgeven door een heldere ring in het verloop afbeeldingsstapel dient de gradiëntfilter worden omgedraaid en het beeld verwerkt. Zoals vermeld in de inleiding, de Rayleigh-Sommerfeld reconstructie methode ongevoelig is voor het teken van afstand tussen het brandvlak van een object. Als twee zwak verstrooiende objecten dezelfde afstand van het brandpuntsvlak maar aan weerszijden, zouden ze komen in beeld op dezelfde positie in het gereconstrueerde beeld stapel. Toch zou hun axiale intensiteit patronen worden teruggedraaid. Het midden van het object oorspronkelijk tooit het brandvlak (ten opzichte van de geïnverteerde microscoop geometrie) verandert van licht naar donker op door het in-focus poling, terwijl het object onder de focal plane verandert van donker naar licht. De optie gradiënt-flip onttrekt dus ofwel objecten boven het brandvlak (standaard) of onder de focal plane (met gradiënt-flip op 'aan'), het geven van een eenduidige axiale coördineren. Merk op dat dit uitsluitend geldt alleen voor zwak-verstrooiing objecten, de methode werkt zeer goed voor polystyreen microsferen tot 1 micrometer in doorsnede, maar minder goed voor grotere polystyreen deeltjes. Biologische monsters vertonen meestal veel zwakker verstrooiing, zoals de brekingsindex dichter bij die van het omringende medium (polystyreen heeft een brekingsindex van ongeveer 1,5), zodat grotere objecten kunnen worden onderzocht.
Qua toekomstige richtingen, kan deze software worden uitgebreid tot meerdere frames te verwerken in een video te volgen zwemmen micro-organismen of colloïdale deeltjes mogelijk in drie dimensies. De hoge framerate die de techniek biedt is zeer geschikt voor het bijhouden van zelfs de snelste zwemmenmers, zoals de oceaan woning Vibrio alginolyticus, die zwemt met snelheden tot 150 micrometer / sec 28. De microscopische zwemmen trajecten van enkele cellen werden voor het eerst gevolgd enige tijd geleden 29, maar dit meestal vereist gespecialiseerde apparatuur. De Gouy fase anomalie benaderen leent zich niet alleen tot het volgen van eenvoudige enkelvoudige cellen over lange afstanden, maar biedt de mogelijkheid om correlaties tussen de zwemgedrag van verschillende individuen te onderzoeken. Dit hangt met name af driedimensionale geometrie, gegevens die tot nu toe niet toegankelijk is om technische redenen.
Zoals vermeld in de inleiding, vergeleken met fluorescentie confocale microscopie is niet ideaal, maar de alomtegenwoordigheid van confocale systemen maakt een vergelijking van de driedimensionale beeldvorming aspect waard. In feite, Dihm vult confocale microscopie, er zijn comparatieve voordelen en nadelen van beide. Dihm laat veel sneller data ACQUISITIEn tarieven: een paar duizend volumes per seconde is routine, krijgt een snel genoeg camera. Dit maakt het volgen van (bijvoorbeeld) verschillende zwemmen bacteriën, die buiten het vermogen van tragere confocale systemen. Zelfs met een snelle camera, Dihm een orde van grootte goedkoper dan confocale microscopie en de gegevens voor een driedimensionaal volume kan worden opgeslagen in een tweedimensionale beeld, waardoor eisen aan gegevensopslag en backup. Dihm is eenvoudig schaalbaar, in die zin dat het werken met lagere vergrotingen, grotere steekproeven en langere werkafstanden is triviaal. Confocale microscopie heeft nog steeds de overhand in dichte of complexe monsters, echter. Bijvoorbeeld, in een dichte colloïdale suspensie, meervoudige verstrooiing maakt holografische reconstructie praktisch onmogelijk, een confocale systeem of fluorescente emissie of reflectiemodus beter bij het bestuderen van dergelijke systemen 9 zijn. Bovendien, confocale microscopie is een meer natuurlijke keuze voor experimentele systemen waarbij fluorescent etikettering is van cruciaal belang. Hoewel fluorescentie holografie is aangetoond met verschillende proefpersonen 30 het verzamelingsrendement is nog ver onder dat van een goede confocale systeem. Bovendien is een dergelijke experimentele systemen vereisen momenteel specialist optische toestellen en ervaring om te werken, hopelijk zullen zij op grotere schaal beschikbaar met verdere ontwikkeling.
Samengevat, Dihm is ongeëvenaard in zijn vermogen om hoge-resolutie driedimensionale beelden van microscopische voorwerpen bij hoge snelheden verkrijgen. Wij bieden gebruiksvriendelijke software die deze techniek toegankelijk voor de niet-specialist met minimale wijzigingen van een bestaande microscoop maakt. Bovendien is de reconstructie software integreert eenvoudig met vrij beschikbare computer rendering software. Dit maakt intuïtieve visualisatie van microscopische onderwerpen, zichtbaar vanuit elke hoek. Gegeven de driedimensionale aard van veel snelle microscopische processen involving zwak-verstrooiing voorwerpen (bijv. kloppen eukaryote flagella of trilharen, zwemmen bacteriën, of het verspreiden van colloïden), moet deze techniek van belang zijn in een breed scala van terreinen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs danken Linda Turner voor hulp aan de microbiologische voorbereiding. RZ en LGW werden gefinancierd door het Instituut Rowland aan Harvard en CGB werd gefinancierd als geleerde een CAPES Foundation, Science without Borders Program, Brazilië (Process # 7340-11-7)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm |
| LED power supply | Thorlabs | LEDD1B | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
References
- Xu, W., Jericho, M. H., Meinertzhagen, I. A., Kreuzer, H. J. Digital in-line holography for biological applications. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (20), 11301-11305 (2001).
- Sheng, J., Malkiel, E., Katz, J., Adolf, J., Belas, R., Place, A. R. Digital holographic microscopy reveals prey-induced changes in swimming behavior of predatory dinoflagellates. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 17512-17517 (2007).
- Lee, S. H., Roichman, Y., et al. Characterizing and tracking single colloidal particles with video holographic microscopy. Opt. Express. 15 (26), 18275-18282 (2007).
- Fung, J., Martin, K. E., Perry, R. W., Katz, D. M., McGorty, R., Manoharan, V. N. Measuring translational, rotational, and vibrational dynamics in colloids with digital holographic microscopy. Opt. Express. 19 (9), 8051-8065 (2011).
- Lee, S. H., Grier, D. G. Holographic microscopy of holographically trapped three-dimensional structures. Opt. Express. 15 (4), 1505-1512 (2007).
- Kim, M. Principles and techniques of digital holographic microscopy. SPIE Rev. 1, 018005 (2010).
- Corkidi, G., Taboada, B., Wood, C. D., Guerrero, A., Darszon, A.
- Santi, P. Light Sheet Fluorescence Microscopy : A Review. J. Histochem. Cytochem. 59, 129-138 (2011).
- van Blaaderen, A., Wiltzius, P. Real-Space Structure of Colloidal Hard-Sphere Glasses. Science. 270, 1177-1179 (1990).
- Besseling, R., Weeks, E. R., Schofield, A. B., Poon, W. C. K. Three-Dimensional Imaging of Colloidal Glasses under Steady Shear. Phys. Rev. Lett. 99, 028301 (2007).
- Schall, P., Weitz, D., Spaepen, F. Structural Rearrangements That Govern Flow in Colloidal Glasses. Science. 318, 1895-1899 (2007).
- Rosen, J., Brooker, G.
- Jericho, M. H., Kreuzer, H. J., Kanka, M., Riesenberg, R. Quantitative phase and refractive index measurements with point-source digital in-line holographic microscopy. Appl. Opt. 51 (10), 1503-1515 (2012).
- Mudanyali, O., Erlinger, A., Seo, S., Su, T., Ozcan, D. T. A. Lensless On-chip Imaging of Cells Provides a New Tool for High-throughput Cell-Biology and Medical. J. Vis. Exp. 34, (2009).
- Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl. Opt. 47 (19), (2008).
- Elliot, M. S., Poon, W. C. K. Conventional optical microscopy of colloidal suspensions. Adv. Coll. Interf. Sci. 92, 133-194 (2001).
- Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Phys. Rev. E. 67, 051904 (2003).
- Born, M., Wolf, E. Principles of Optics, 6th Ed. , Cambridge University Press. (1998).
- Wilson, L., Zhang, R. 3D Localization of weak scatterers in digital holographic microscopy using Rayleigh-Sommerfeld back-propagation. Opt. Express. 20, 16735-16744 (2012).
- Bohren, C., Huffman, D. Absorption and Scattering of Light by Small Particles. , John Wiley & Sons. (1983).
- Balaev, A. E., Dvoretski, K. N., Doubrovski, V. A. Refractive index of escherichia coli cells. Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III. 4707 (1), 253-260 (2002).
- Berg, H. C., Manson, M. D., Conley, M. P. Dynamics and Energetics of Flagellar Rotation in Bacteria. Symp. Soc. Exp. Biol. 35, 1-31 (1982).
- Garcia-Sucerquia, J., Xu, W., Jericho, S. K., Klages, P., Jericho, M. H., Kreuzer, H. J.
- Restrepo, J. F., Garcia-Sucerquia, J. Magnified reconstruction of digitally recorded holograms by Fresnel-Bluestein transform. Appl. Optics. 49 (33), 6430-6435 (2010).
- Dubois, F., Joannes, L., Legros, J. C. Improved three-dimensional imaging with a digital holography microscope with a source of partial spatial coherence. Appl. Optics. 38 (34), 7085-7094 (1999).
- Kanka, M., Riesenberg, R., Petruck, P., Graulig, C. High resolution (NA=0.8) in lensless in-line holographic microscopy with glass sample carriers. Opt. Lett. 36 (18), 3651-3653 (2011).
- Dubois, F., Requena, M. L., Minetti, C., Monnom, O., Istasse, E. Partial spatial coherence effects in digital holographic microscopy with a laser source. Appl. Optics. 43 (5), 1131-1139 (2004).
- Magariyama, Y., Sugiyama, S., Muramoto, K., Kawagishi, I., Imae, Y., Kudo, S. Simultaneous measurement of bacterial flagellar rotation rate and swimming speed. Biophysical Journal. 69 (5), 2154-2162 (1995).
- Berg, H. C., Brown, D. A. Chemotaxis in Escherichia coli analysed by three-dimensional tracking. Nature. 239 (5374), 500-504 (1972).
- Brooker, G., Siegel, N., Wang, V., Rosen, J. Optimal resolution in Fresnel incoherent correlation holographic fluorescence microscopy. Opt. Express. 19 (6), 5047-5062 (2011).
