Summary
Les emplacements en trois dimensions des objets faiblement diffusion peuvent être identifiés de manière unique à l'aide en ligne numérique microscopie holographique (SMIH), ce qui implique une modification mineure à un microscope standard. Notre logiciel utilise une heuristique d'imagerie simple, couplé avec Rayleigh-Sommerfeld rétro-propagation pour obtenir la position en trois dimensions et la géométrie d'un objet de phase microscopique.
Abstract
Objets faiblement diffusantes, telles que de petites particules colloïdales et la plupart des cellules biologiques, se rencontrent fréquemment dans la microscopie. En effet, une série de techniques ont été développées afin de mieux visualiser ces objets de phase; contraste de phase et DIC sont parmi les méthodes les plus populaires pour améliorer le contraste. Toutefois, l'enregistrement position et la forme dans la direction hors-imagerie-plan reste difficile. Ce rapport présente une méthode expérimentale simple pour déterminer avec précision l'emplacement et la géométrie des objets en trois dimensions, en utilisant la microscopie holographique numérique en ligne (SMIH). D'une manière générale, le volume de l'échantillon accessible est définie par la taille du capteur de la caméra dans la direction latérale, et la cohérence de l'éclairage dans la direction axiale. Volumes d'échantillons typiques vont de 200 um x 200 um x 200 um en utilisant un éclairage à LED, pour5 mm x 5 mm x 5 mm ou plus en utilisant un éclairage laser. Cette lumière d'éclairage est configuré de telle sorte que les ondes planes sont incidents sur l'échantillon. Les objets dans le volume de l'échantillon puis diffusent la lumière, ce qui interfère avec la lumière non diffusée pour former des motifs d'interférence perpendiculaire à la direction d'illumination. Cette image (l'hologramme) contient les informations de profondeur requise pour la reconstruction en trois dimensions, et peut être capturé sur un dispositif de formation d'image standard comme une caméra CMOS ou CCD. La méthode de retour propagation de Rayleigh-Sommerfeld est utilisé pour recentrer numériquement des images de microscope, et une heuristique simple imagerie basée sur la phase de Gouy anomalie est utilisé pour identifier la diffusion des objets dans le volume reconstruit. Cette méthode simple mais robuste en résulte une mesure sans équivoque, sans modèle de l'emplacement et la forme des objets dans des échantillons microscopiques.
Introduction
Inline microscopie holographique numérique (SMIH) permet l'imagerie rapide tridimensionnel d'échantillons microscopiques, telles que les micro-organismes de natation 1,2 et systèmes de la matière molle de 3,4, avec un minimum de modifications à une configuration de microscope standard. Dans cet article, une démonstration pédagogique de SMIH est fourni, centrée autour des logiciels développés dans notre laboratoire. Ce document comprend une description de la façon de mettre en place le microscope, d'optimiser l'acquisition de données, et de traiter les images enregistrées pour reconstruire les données en trois dimensions. Le logiciel (basé en partie sur des logiciels développés par la DG Grier et autres 5) et des exemples d'images sont disponibles gratuitement sur notre site. Une description est disponible sur les étapes nécessaires pour configurer le microscope, reconstruire les volumes en trois dimensions à partir d'hologrammes et de rendre les volumes résultant d'intérêt en utilisant un rayon libre traçage logiciel. Le document se termine par une discussion des facteurs qui affectent la qualité de la reconstruction, Et une comparaison avec les méthodes de SMIH concurrentes.
Bien SMIH a été décrit il ya quelque temps (pour une revue générale de ses principes et de développement, voir Kim 6), la puissance de calcul nécessaire et l'image expertise de traitement a jusqu'ici largement restreint son utilisation à des groupes de recherche spécialisés en mettant l'accent sur le développement de l'instrument. Cette situation est en train de changer à la lumière des récents progrès de l'informatique et de la technologie de l'appareil photo. Ordinateurs de bureau modernes peuvent facilement faire face à la transformation et les exigences de stockage de données; CCD ou CMOS caméras sont présentes dans la plupart des laboratoires de microscopie, et le logiciel nécessaire est en cours mis à disposition gratuitement sur Internet par des groupes qui ont investi du temps dans le développement de la technique.
Divers systèmes ont été proposés pour l'imagerie de la configuration des objets microscopiques dans un volume d'échantillon en trois dimensions. Beaucoup d'entre eux sont à balayage techniques 7,8, dans lequel une pile d'images est enregistré par mtraduire echanically le plan image à travers l'échantillon. confocale à balayage microscopie à fluorescence est peut-être l'exemple le plus connu. Typiquement, un colorant fluorescent est ajouté à un objet de phase afin d'obtenir un niveau acceptable de contraste de l'échantillon, et l'agencement confocal utilisé pour localiser spatialement l'émission fluorescente. Cette méthode a permis des avancées significatives, par exemple dans la science des colloïdes où il a permis l'accès à la dynamique en trois dimensions des systèmes bondés 9-11. L'utilisation de l'étiquetage est une différence importante entre la microscopie confocale de fluorescence et SMIH, mais d'autres caractéristiques des deux techniques sont la peine de comparer. SMIH a un avantage considérable de la vitesse en ce que le dispositif comporte pas de pièces mobiles. Les miroirs de balayage mécanique dans les systèmes confocaux placer une limite supérieure du taux d'acquisition de données - généralement autour de 30 images / sec pour une image de 512 x 512 pixels. Une pile de ces images provenant de différents plans focaux peut être obtenue par physiquement translAting l'étage d'échantillon ou de lentille d'objectif entre les images, ce qui conduit à un taux de capture finale d'environ un volume par seconde pour une trame pile 30. En comparaison, un système holographique basé sur une caméra CMOS moderne peut capturer 2000 images / s à la même taille et résolution d'image, chaque image est traitée `offline 'pour donner un aperçu indépendant du volume de l'échantillon. Pour réitérer: échantillons fluorescents sont pas nécessaires pour SMIH, même si un système a été mis au point qui effectue la reconstruction holographique d'un objet fluorescent 12. Ainsi que des informations de volume tridimensionnel, SMIH peut également être utilisé pour fournir quantitatives des images à contraste de phase 13, mais qui est au-delà de la portée de la discussion ici.
Images de données brutes SMIH sont en deux dimensions, et à certains égards, ressemblent à des images de microscope standard, mais pas au point. La principale différence entre SMIH et la microscopie en champ clair norme réside dans les anneaux de diffraction qui entourent les objets in le champ de vision; ceux-ci sont dues à la nature de l'illumination. SMIH nécessite une source plus cohérent que le champ lumineux - généralement une LED ou laser. Les anneaux de diffraction de l'hologramme contiennent les informations nécessaires pour reconstruire une image en trois dimensions. Il existe deux approches principales pour l'interprétation des données; SMIH recentrage montage et numérique directe. La première approche est applicable dans les cas où la forme mathématique de la figure de diffraction est connue à l'avance 3,4; cette condition est remplie par une petite poignée d'objets simples comme des sphères, des cylindres, et les obstacles demi-plan. Montage direct est également applicable dans les cas où la position axiale de l'objet est connue, et l'image peut être fixé à l'aide d'une table de modèles d'image 14 consultation.
La deuxième approche (de refocalisation numérique) est un peu plus grand et repose sur l'utilisation d'anneaux de diffraction de l'image holographique à deux dimensions de reconstruire numériquement le champ optique àun certain nombre de (arbitrairement) espacées plans focaux dans tout le volume de l'échantillon. Plusieurs méthodes existent connexes pour ce faire 6; ce travail utilise le Rayleigh-Sommerfeld dos technique de propagation comme décrit par Lee et Grier 5. Le résultat de cette procédure est une pile d'images qui reproduisent l'effet de modifier manuellement le plan focal du microscope (d'où le nom de `recentrage numérique»). Une fois qu'une pile d'images a été généré, la position de l'objet dans le volume focal doit être obtenue. Un certain nombre de procédés heuristiques de l'analyse de l'image, telles que la variance de l'intensité locale ou le contenu de fréquence spatiale, ont été présentés afin de quantifier la finesse de focalisation en des points différents dans l'échantillon 15. Dans chaque cas, quand une image métrique particulière est maximisée (ou réduit), l'objet est considéré comme la mise au point.
Contrairement à d'autres régimes qui cherchent à identifier un plan focal particulier où un objet est «mise au point», la méthode dans ce travail choisit points qui se trouvent à l'intérieur de l'objet d'intérêt, qui peuvent s'étendre sur un large éventail de plans focaux. Cette approche est applicable à un large éventail de sujets et est particulièrement adapté pour étendues, des échantillons faiblement diffusion (objets de phase), tels que des colloïdes en forme de tige, les chaînes de bactéries ou de flagelles eucaryotes. Dans ces échantillons, le contraste de l'image change lorsque l'objet passe à travers le plan focal, une image défocalisée possède un centre de lumière si l'objet est sur un côté du plan focal et un centre sombre si elle est à l'autre. Objets de phases pures ont peu à pas de contraste quand ils se trouvent exactement dans le plan focal. Ce phénomène de contraste inversion a été discutée par d'autres auteurs 16,17 et est finalement due à la phase de Gouy anomalie 18. Cela a été mis sur un pied plus rigoureuse dans le cadre de l'holographie ailleurs, là où les limites de la technique sont évalués; l'incertitude typique de position est de l'ordre de 150 nm (environ un pixel) dans each direction 19. La méthode phase de Gouy anomalie est l'un des rares régimes de SMIH bien définis pour déterminer la structure des objets étendus dans les trois dimensions, mais néanmoins certains objets sont problématiques à reconstruire. Les objets qui se trouvent directement le long de l'axe optique (pointage à la caméra) sont difficiles à reconstituer avec précision, les incertitudes dans la longueur et la position de l'objet deviennent grandes. Cette limitation est due en partie à la profondeur de bits limité de pixels d'enregistrement de l'hologramme (le nombre de niveaux de gris distinctes que l'appareil peut enregistrer). Un autre problème survient lorsque la configuration de l'objet d'intérêt est très proche du plan focal. Dans ce cas, les images réelles et virtuelles de l'objet sont reconstruits à proximité, donnant lieu à des champs optiques complexes qui sont difficiles à interpréter. Une autre préoccupation, un peu moins important ici est que les franges de diffraction résultant occupent moins du capteur d'image, et ce inf gros grainsormation conduit à une reconstruction de moins bonne qualité.
En pratique, un filtre à gradient simple est appliqué à des volumes reconstruits en trois dimensions pour détecter les inversions d'intensité de solides le long de la direction d'illumination. Régions où l'intensité change rapidement de la lumière à l'obscurité, ou vice versa, sont ensuite associées à des régions de diffusion. Objets faiblement diffusion sont bien décrits comme une collection sans interaction de ces éléments 20; ces contributions individuelles somme à donner le champ diffusé totale qui est facilement inversé avec le dos méthode de propagation de Rayleigh-Sommerfeld. Dans ce document, la technique du gradient d'intensité axiale est appliquée à une chaîne de cellules de Streptococcus. Les corps cellulaires sont des objets de phase (l'espèce E. coli a un indice de réfraction mesuré 21 pour être 1,384 à une longueur d'onde λ = 589 nm; la souche de Streptococcus est susceptible d'être similaire) et apparaissent comme une chaîne à haute intensité de gouttes connectés à ee volume d'échantillon en aval du filtre à gradient a été appliqué. Seuil et longs méthodes classiques d'extraction appliqués à ce volume filtré permettent l'extraction des pixels volumétriques (voxels) correspondant à la région à l'intérieur des cellules. Un avantage particulier de ce procédé est qu'il permet la reconstruction sans équivoque de la position d'un objet dans la direction axiale. Des méthodes similaires (au moins, ces hologrammes qui enregistrent près de l'objet, imagées par un objectif de microscope) souffrent d'être incapable de déterminer le signe de ce déplacement. Bien que la méthode de Rayleigh-Sommerfeld reconstruction est également signer indépendant en ce sens, l'opération de gradient permet de discriminer entre les objets de phase faibles ci-dessus et en dessous du plan focal.
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Protocol
Une. Configuration et acquisition de données
- Cultiver une culture de Streptococcus souche V4051-197 (natation lisse) cellules dans un milieu KTY de stock congelé 22. Incuber dans un agitateur rotatif pendant une nuit à 35 ° C et 150 tours par minute, à la saturation.
- Inoculer 10 ml de milieu KTY frais avec 500 pi de la culture saturée. Incuber pendant encore 3,5 h à 35 ° C et 150 tours par minute jusqu'à ce que les cellules atteignent une densité optique d'environ 1,0 à λ = 600 nm (environ 5 x 10 8 cellules / ml).
- Diluer 1:400 dans du milieu frais pour obtenir la concentration finale de cellules mobiles.
- Sur une lame de microscope, faire un anneau de graisse (par exemple à partir d'une seringue remplie avec de la vaseline) autour de 1 mm de hauteur et de placer une goutte de la solution d'échantillon dans le centre. Placez un couvercle en verre sur le dessus et appuyez légèrement sur les bords pour sceller, en veillant à ce que le liquide est en contact avec les deux diapositives et couvercle en verre. La chambre d'échantillon qui en résulte doit être aroue 100-200 um en profondeur.
- Placer la chambre d'échantillon dans le microscope avec le verre de protection tournée vers le bas, et avec précaution, afin d'éviter la formation de bulles d'air dans l'huile entre le verre et la lentille.
- Focaliser le microscope sur la surface inférieure de la chambre d'échantillon, et pour apporter le condenseur à se concentrer.
- Eteindre l'éclairage standard et placer la tête LED derrière l'ouverture du condenseur du microscope. Régler l'alimentation LED de puissance maximale.
- Fermer l'ouverture du condenseur dans toute son étendue, et le cas échéant, décaler la LED dans son support jusqu'à ce que l'éclairement est centrée sur l'ouverture de la lentille objectif.
- Allumez l'ordinateur et l'appareil photo, et de réorienter toute la lumière sur le port de la caméra du microscope. Ajuster la fréquence de trame et la taille de l'image dans le logiciel d'acquisition d'image.
- Rendre le temps d'exposition de trame le plus court possible, tout en conservant un bon contraste. Vérifier un histogramme d'intensité de l'image de sorte que l'image n'est pas saturated ou sous-exposée.
- Si nécessaire, recentrer le microscope afin objet d'intérêt est légèrement défocalisé (typiquement de 10-30 um). L'objet et le plan focal doivent être dans le même milieu (c'est à dire le plan focal devrait se situer à l'intérieur de la chambre de l'échantillon).
2. Reconstruction
La première étape de traitement de données est de recentrer numériquement une image vidéo dans une série de profondeurs différentes, en produisant une pile d'images. logiciel convivial pour ce faire peut être trouvé ici: http://www.rowland.harvard.edu/rjf/wilson/Downloads.html avec des exemples d'images (acquises à l'aide d'un microscope inversé, et un 60X à immersion d'huile objectif) et un fichier de scène pour rayons tracé rendu.
- Saisissez le cadre de l'intérêt et de son contexte respectif sous forme de fichiers image distincts, dans les cases correspondantes sur l'interface. Une image de fond est un cadre que fairly représente l'arrière-plan de la vidéo, en l'absence de l'hologramme, et sera utilisé pour supprimer le bruit de configuration fixe qui pourrait interférer avec la localisation et l'analyse hologramme.
- Entrez les valeurs dans les zones mondiales de paramètres sur le côté gauche de l'écran avant d'exécuter le programme. Les trois premiers sont des paramètres de la pile de sortie: la position axiale de la première image («Lancer focus '), le nombre de tranches de la pile reconstruit (« Nombre d'étapes »), la distance axiale entre chaque tranche dans la pile (« de la taille de l'étape') .
- Afin de reconstruire les objets avec les proportions correctes, la taille du pas doit être de la même dimension que l'espacement de pixel latéral. Entrez latérale fréquence d'échantillonnage de l'appareil photo (espacement 1/pixel) dans la case «Pixel / micron», la longueur d'onde d'éclairage et l'indice de réfraction moyen dans les deux dernières cases. Les valeurs par défaut du programme sont appropriés pour reconstruire les données d'exemple.
- Appuyez sur le bouton 'Flip Z-gradient »si le centre de la object est sombre dans l'hologramme (voir exemple châssis 2005 et la section de discussion pour plus de détails).
- Vérifiez le filtre passe-bande sur l'état marche / arrêt (par défaut). Ce filtre passe-bande en option, situé dans une zone en dessous du commutateur gradient-flip, est responsable de la suppression de la contribution de pixels bruyants. Le filtre passe-bande est appliqué à chaque tranche d'image immédiatement après la génération.
- Vérifiez le commutateur de sortie intermédiaire états ON / OFF (par défaut). Étapes de l'analyse intermédiaire sont écrits dans deux vidéos de sortie, non compressé avi:. La première est la pile recentré (nom de fichier se terminant par "_stack.avi '), la seconde est la pile après l'opération de gradient axial (nom de fichier se terminant par' _gradient.avi '). Idéalement, cette seconde pile contiendra l'objet d'intérêt mis en évidence comme un objet lumineux sur un fond sombre.
- Après avoir défini tous les paramètres, appuyez sur "Exécuter" dans la fenêtre principale. L'image sélectionnée apparaît dans la zone principale du logiciel.
- Utilisez l'loupe outil de verre trouvé sur la barre d'outils à gauche de l'image pour zoomer (clic gauche) et zoom arrière (Maj + clic gauche). Utilisez l'outil de rectangle sur la barre d'outils pour sélectionner une région d'intérêt (ROI). Capturer le plus grand nombre des franges de l'hologramme que possible à l'intérieur du rectangle, comme ce sera d'optimiser la reconstruction.
- Appuyez sur le bouton «Process» pour générer les deux piles d'images. Inspecter les magasins résultant en utilisant ImageJ (qui peut être obtenu gratuitement sur http://rsb.info.nih.gov/ij/ ). Si l'objet d'intérêt est clairement visible dans la pile de l'image de gradient, passer à l'étape suivante pour extraire les coordonnées de l'objet.
3. Rendu
- Outre cadre recentrage, ce programme permet de localiser les coordonnées x, y, z pour chaque voxel de l'objet d'intérêt. Appuyez sur le bouton «Feature Extraction» pour activer cette fonction.
- Entrez un chemin, y compris l'extension (par exemple: c: home output.inc), pour lacoordonnées de sortie de fichier. Sélectionnez «style POV-Ray» dans la case «sortie coordonnée style '. Cela provoque le programme d'écrire un fichier objet qui peut être visualisée à l'aide du logiciel de raytracing libre POV-Ray (qui peut être obtenu à partir de http://www.povray.org/ ).
- Retraiter les images que l'article 2 ci-dessus. Le programme fournira une série de (x, y, z) les coordonnées dans la ROI sélectionnée, écrit au nom de fichier dans la 'sortie coordonner "boîte. Extraction des coordonnées de l'objet prend plus de temps que la génération pile.
- Assurez-vous que l'exemple de fichier POV-Ray (fourni avec le code de reconstruction) est dans le même dossier que le fichier de coordonnées seulement générés. Editez le fichier pov échantillon. Et remplacer le nom de fichier entre guillemets sur la ligne
# Include "MYFILE.inc"
avec le nom du fichier de données généré par le code de reconstruction. - Cliquez sur le bouton "Exécuter" dans POV-Ray pour rendre une image bitmap. Til position de la caméra, l'éclairage et les options de texture ne sont que quelques-uns des personnalisations possibles dans POV-Ray, voir la documentation en ligne pour plus de détails.
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Representative Results
Pour démontrer les capacités de SMIH, des expériences ont été réalisées sur une chaîne de bactéries Streptococcus. La chaîne se mesure 10,5 mm de long, et était composé de 6-7 cellules sphéro-cylindrique (deux des cellules de la chaîne sont proches de la division) avec des diamètres dans la gamme 0,6-1 um. Figures 1a et 1b montrent l'interface principale de la reconstruction et des logiciels de rendu. Des exemples de la procédure de recentrage numérique sont vus sur la Figure 2, où un filtre passe-bande spatial a été appliquée. Figure 3 montre l'effet du filtre de gradient sur les images de la figure 2. Les données brutes utilisées pour construire ces deux images sont livrés avec le téléchargement de code comme exemple châssis 108. Enfin, la figure 4 montre l'effet de données bonne ou mauvaise qualité de la géométrie reconstruite. Les deux cadres dans ce dernier chiffre ont été prises à partir d'une vidéo de la same chaîne de cellules (une chaîne différente de celle dans les deux premiers chiffres). Une bonne reconstruction est possible dans la plupart des cas, mais lorsque la chaîne est orientée de fin sur la reconstruction échoue, ce qui donne un grand objet rond au niveau du plan focal. Ce mode de rupture est caractéristique des objets orientés le long de l'axe optique. Pour l'échelle, dans les images de synthèse rendu, les contrôles sur le sol sont 1 pm sur un côté. Pour une discussion plus détaillée de la précision et de l'exactitude de cette méthode, le lecteur doit consulter Wilson et Zhang 19.
Figure 1. Les interfaces logicielles. L'interface principale du logiciel de reconstruction est indiqué dans la colonne (a), où les champs de saisie de fichiers, paramètres globaux paramètres et d'autres caractéristiques importantesvisé dans le texte ont été mis en évidence. Panneau (b) montre l'exemple de fichier scène pour POV-Ray, dans l'éditeur de scène par défaut du programme. Le nom du fichier entre guillemets sur la ligne indiquée doit être réglé sur le fichier de sortie du logiciel de reconstruction. Il peut être nécessaire de modifier l'emplacement et l'orientation de la caméra (section correspondante indiquée) afin de visualiser correctement la reconstruction. Consultez la documentation en ligne de POV-Ray pour plus d'instructions. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 2. Exemples d'images numérique recentrées. Les panneaux figure dans le spectacle de la colonne de gauche numériquement recentrées(X, y) des plans à différentes hauteurs à l'intérieur du volume reconstruit (comme indiqué). L'image en bas à gauche montre les données holographiques originaux, répartis à travers les données de base. Le grand panneau de droite montre un (x, z) tranche par la même pile. Le point d'inversion de contraste le long de l'axe z peut être clairement vu à environ un tiers de la distance entre le haut de l'image. Les lignes rouges sur la plus grande exposition d'image où ce plan (x, z) coupe les plans (x, y) sur la gauche. De même, des lignes bleues dans les petits panneaux montrent l'intersection de la tranche (x, z). Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 3. Exemples d'images de gradient filtré.0; Cette image montre l'effet de l'application du filtre à gradient pour les données de la figure 2. Notez que l'objet d'intérêt est souligné comme une tache lumineuse symétrique. Cliquez ici pour agrandir l'image .
Figure 4. Des exemples de données qui conduisent à des images de bonnes et mauvaises rendus. Les deux images dans des panneaux (a) et (c) ont été prises à partir de la même vidéo d'une chaîne de tumbling de cellules. Les données dans le graphique (a) sont représentatives de la plupart des cadres de cette série, dans laquelle la chaîne n'est pas orienté directement le long de l'axe optique. La forme et la position de l'objet sont fidèlement reproduits dans lerendu dans le panneau (b). Dans le cas de panneau (c), la chaîne a été momentanément orienté en bout au plan focal; objets dans cette configuration sont difficiles à reconstituer, et donné généralement un «blob» à proximité du plan focal, comme on le voit dans le panneau (d ). Cliquez ici pour agrandir l'image .
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Discussion
L'étape la plus importante dans ce protocole expérimental est la capture précise des images à partir d'un dispositif expérimental stable. Avec les données de base pauvres, la reconstruction haute fidélité est à peu près impossible. Il est également important d'éviter les lentilles de l'objectif avec un élément de contraste de phase interne (visible comme un anneau sombre en regardant à travers l'arrière de l'objectif), comme cela peut dégrader l'image reconstruite. L'objet d'intérêt devrait être assez loin du plan focal que quelques paires de franges de diffraction sont visibles dans son image (une heuristique appropriée est que le modèle vaporisé devrait apparaître d'avoir 10 fois la dimension linéaire de l'objet ciblé - voir des exemples de données ). Objets trop près du plan focal souffrent de double-image et d'échantillonnage des objets, comme décrit précédemment. Il est également important d'avoir une bonne caractérisation de l'espacement de pixels de l'appareil photo, car c'est un facteur crucial pour déterminer correctement les distances recentrer. Souvent, la caméra documentation aura la liste 'taille de pixel "du cahier des charges, ce qui peut être un peu ambigu, car certains types de caméra (caméras CMOS en particulier) peuvent avoir des domaines importants de l'espace entre les pixels qui ne sont pas sensible à la lumière. Le moyen le plus fiable pour obtenir cette information est d'utiliser une cible de calibrage standard, comme une résolution graphique USAF 1951, et de mesurer la fréquence d'échantillonnage (nombre de pixels par micromètre) directement à partir d'une image.
Dans la limite de l'illumination monochromatique, la résolution d'un système SMIH est finalement fixée par l'ouverture numérique de la lentille d'objectif (NA) et de la longueur d'onde d'illumination (λ) 23,24. Des points latéralement séparés devraient être au moins à une distance Δ lat = 'λ' / 2NA dehors s'ils doivent être réglés séparément. De même, la limite de résolution axiale dans le cas idéal est donné par 'Δ' ax = λ / 2 (NA) 2. Lors de l'utilisation d'une LED en SMIH, il ya une limite à la profondeur dele volume qui peut être imagé, ce qui est finalement déterminée par le système optique et la cohérence de l'éclairage. Une profondeur typique de ce «volume sensible» est d'environ 100-200 um pour une LED, mais un récit détaillé de ce type d'effet peut être trouvée ailleurs 25. Le volume utile est limitée dans les deux autres directions par la taille de l'image. Bien que le logiciel est assez robuste, certaines opérations sont plutôt gourmand en mémoire. Reconstruire une pile d'images et d'obtenir le gradient d'intensité sont à la fois assez conservatrice, mais extraire les coordonnées d'un dispositif d'intérêt à partir d'une pile gradient peut consommer beaucoup de mémoire (plusieurs centaines de méga-octets à plusieurs giga-octets). A cette fin, il est souhaitable de limiter le volume reconstruit d'intérêt à 100-150 pixels dans chaque dimension. Cette restriction peut être quelque peu assouplie si le code est exécuté sur un système d'exploitation 64 bits avec plus de 4 Go de RAM (le logiciel a été écrit sur une machine avec 12 Go),bien que le temps de calcul peut devenir prohibitif.
Pour examiner un système plus vaste, la source de lumière LED peut être remplacé par un laser, qui permet de reconstruire des objets se trouvant à une profondeur beaucoup plus grande du plan focal - facilement jusqu'à millimètres - et à faible grossissement. Des expériences préliminaires avec une telle configuration, en utilisant une diode laser couplée à une fibre optique monomode, autorisés profondeurs reconstruites jusqu'à 10 mm en utilisant un objectif de microscope 10X. Cette augmentation de la profondeur de champ a un coût, cependant, grande longueur de cohérence du laser conduit à un bruit d'image, en particulier les réflexions de divers surfaces dans le train optique Ces effets sont compensés en partie (les parois de la chambre de l'échantillon, des surfaces des lentilles, etc.) lorsque l'appareil est suffisamment stable pour obtenir une bonne image de fond. Cependant, les réflexions parasites ont une distribution inconnue des phases, si leur ampleur est comparable à celle de l'onde de référence (lumière non diffusée), reconstruction peut devenir impossible. D'autres auteurs ont modifié la cohérence d'une source de lumière laser, par exemple, en modulant le courant d'attaque laser 26 ou à l'aide d'un écran en verre dépoli tournant pour réduire la cohérence 27.
D'un point de vue de dépannage, la plupart des problèmes rencontrés lors de l'utilisation du logiciel de reconstruction holographique sont mieux résolus par l'inspection des stades intermédiaires de l'analyse des données. Dans le cas de la pile de l'image reconstruite, les objets doivent «Deblur 'symétriquement comme ils viennent dans le foyer. Si les franges de diffraction semblent fortement asymétrique, une image de fond pauvres ou décalage est souvent à blâmer. Si l'image pour la reconstruction a été attribué à partir d'une pile d'images similaires, par exemple une trame à partir d'une séquence vidéo d'un objet en mouvement, une image de fond peut parfois être obtenue en faisant la moyenne (en moyenne ou médiane) des valeurs de pixels sur l'ensemble de la vidéo cadres. Si le sujet se déplace sensiblement au cours de la séquence vidéo, l'contribution à une valeur de pixel est petit et la contribution dominante viendra des altérées cadres de fond où le sujet était absent. Dans le cas où les coordonnées d'un objet ne sont pas correctement restitués, la pile de l'image gradient peut être un diagnostic utile. Si l'objet est vu comme un vide entouré par un anneau lumineux de la pile de l'image gradient, le filtre de gradient doit être retournée et l'image retraité. Comme mentionné dans l'introduction, le procédé de reconstruction de Rayleigh-Sommerfeld est insensible au signe de la distance d'un objet par rapport au plan focal. Si deux objets faiblement diffusantes sont à la même distance du plan focal, mais sur des côtés opposés, ils viennent en mise au point à la même position dans la pile d'image reconstruite. Toutefois, les caractéristiques d'intensité axiaux seraient inversés. Le centre de l'objet à l'origine trouvé au-dessus du plan focal (par rapport à la géométrie de microscope inversé) change du clair au foncé en passant par le po de mise au pointtion, alors que l'objet ci-dessous le plan focal des changements de l'obscurité à la lumière. L'option gradient-flip extrait donc soit des objets au-dessus du plan focal (par défaut) ou en dessous du plan focal (avec gradient bascule fixés à 'on'), donnant coordonnée axiale sans ambiguïté. A noter que cela est strictement uniquement pour les objets faiblement diffusant, le procédé fonctionne très bien pour des microsphères de polystyrène à 1 um de diamètre, mais moins bien pour les plus grandes particules de polystyrène. Les échantillons biologiques présentent typiquement beaucoup plus faible dispersion, alors que leurs indices de réfraction est plus proche de celle du milieu environnant (polystyrène a un indice de réfraction proche de 1,5), de sorte que des objets plus grands peuvent être étudiés.
En ce qui concerne les futures orientations, ce logiciel pourrait être étendu pour traiter plusieurs images dans une vidéo, pour permettre le suivi des micro-organismes de natation ou de particules colloïdales en trois dimensions. Le taux de rafraîchissement élevé que la technique offre est bien adaptée au suivi de même la nage la plus rapidemers, comme le Vibrio alginolyticus de l'océan vivant, qui nage à des vitesses allant jusqu'à 150 um / sec 28. Les trajectoires de natation microscopiques de cellules uniques ont d'abord été suivi il ya quelque temps 29, mais cela nécessite souvent un appareillage spécialisé. La phase de Gouy approche anomalie non seulement se prête à un suivi simple des cellules individuelles sur de longues distances, mais offre la possibilité d'examiner les corrélations entre le comportement de nage des différents individus. Cela dépend en particulier de la géométrie en trois dimensions, les données qui ont été jusque-là inaccessibles pour des raisons techniques.
Comme mentionné dans l'introduction, une comparaison avec la microscopie confocale de fluorescence n'est pas l'idéal, mais l'omniprésence des systèmes confocaux fait une comparaison de l'aspect de l'imagerie tridimensionnelle utile. En fait, SMIH est complémentaire à la microscopie confocale, il ya des avantages et désavantages comparatifs des deux. SMIH permet beaucoup plus rapide ACQUISITION de donnéesn taux: plusieurs milliers de volumes par seconde est de routine, étant donné un appareil photo assez vite. Cela permet un suivi de (par exemple) de multiples bactéries de natation, ce qui est au-delà de la capacité des systèmes confocaux plus lents. Même avec une caméra rapide, SMIH est un ordre de grandeur moins cher que la microscopie confocale, et les données d'un volume tridimensionnel peut être stocké dans une seule image en deux dimensions, ce qui réduit les exigences de stockage de données et de sauvegarde. SMIH est plus facilement extensible dans le sens que le travail avec des grossissements plus faibles, de plus grands échantillons et les distances de travail plus long est trivial. La microscopie confocale a encore la haute main dans les échantillons denses ou complexes, toutefois. Par exemple, dans une suspension colloïdale dense, la diffusion multiple permet la reconstruction holographique pratiquement impossible, un système confocal en soit l'émission de fluorescence ou en mode de réflexion serait mieux adapté à l'étude de ces systèmes 9. En outre, la microscopie confocale est un choix plus naturel pour les systèmes expérimentaux dans lesquels fétiquetage luorescent est d'une importance centrale. Bien que la fluorescence holographie a été montré à travailler avec une gamme de sujets d'expérience 30 l'efficacité de collecte est actuellement bien inférieur à celui d'un bon système confocal. En outre, ces systèmes expérimentaux exigent actuellement appareil optique spécialiste et l'expérience pour faire fonctionner; nous espérons qu'ils seront plus largement disponibles avec la poursuite du développement.
En résumé, SMIH est inégalé dans sa capacité à acquérir des images haute résolution en trois dimensions des objets microscopiques, à des vitesses élevées. Nous fournissons un logiciel convivial qui rend cette technique accessible au non-spécialiste avec un minimum de modifications à un microscope existant. En outre, le logiciel de reconstruction s'intègre facilement à la libre disposition du logiciel de l'ordinateur de rendu. Cela permet la visualisation intuitive des sujets microscopiques, visible à partir de n'importe quel angle. Compte tenu de la nature tridimensionnelle de nombreux procédés microscopiques rapide impliquanttion des objets faiblement diffusion (par exemple battre flagelles eucaryotes ou cils, piscine bactéries, ou diffusant des colloïdes), cette technique devrait être d'intérêt dans un large éventail de domaines.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Linda Turner pour l'aide à la préparation microbiologique. RZ et CDG ont été financés par l'Institut Rowland à Harvard et CGB a été financé en tant que spécialiste d'un CAPES Fondation, Science sans frontières programme, Brésil (Processus n ° 7340-11-7)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nikon Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon Corp. | ||
| LED | Thorlabs | M660L3 | emission wavelength λ=660 nm, linewidth approximately 20 nm |
| LED power supply | Thorlabs | LEDD1B | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM2T2 | |
| Thread Adapter | Thorlabs | SM1A2 | |
| Frame Grabber board | EPIX | PIXCI E4 | |
| High-Speed CMOS camera | Mikrotron | MC-1362 |
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