Summary
Tripsina digest è uno dei metodi più comunemente utilizzati per analizzare vascolarizzazione retinica. Questo manoscritto descrive il metodo in dettaglio, comprese le alterazioni fondamentali per ottimizzare la tecnica e rimuovere il tessuto non vascolare preservando l'architettura generale dei vasi.
Abstract
Tripsina digest è il metodo gold standard per analizzare la retina vascolare 1-5. Permette la visualizzazione di tutta la rete di vasi complessi tridimensionali sanguigni e capillari retinici creando una bidimensionale TV a monte dei canali vascolari interconnessi dopo digestione dei componenti non vascolari della retina. Questo permette di studiare le varie alterazioni patologiche vascolari, come microaneurismi, degenerazione capillare e abnorme endoteliali ai rapporti di periciti. Tuttavia, il metodo è tecnicamente impegnativo, soprattutto nei topi, che sono diventati il modello animale più ampiamente disponibile per studiare la retina a causa della facilità di manipolazioni genetiche 6,7. Nell'occhio topo, è particolarmente difficile da rimuovere completamente i componenti non vascolari mantenendo l'architettura complessiva dei vasi sanguigni della retina. Ad oggi, vi è una carenza di letteratura che descrive la tecnica tripsina digest in dettaglio in il mouse. Questo manoscritto fornisce una metodologia dettagliata passo-passo della tripsina digest nel topo retina, fornendo anche suggerimenti sulla risoluzione dei passaggi difficili.
Introduction
Visualizzare la vascolarizzazione della retina è un approccio estremamente importante per sezionare i meccanismi delle varie malattie oculari come la retinopatia diabetica. Essa permette di valutare le prime anomalie vascolari, tra cui microaneurismi, degenerazione dei capillari, e perdita pericyte 8,9. Ad oggi, sono state sviluppate diverse tecniche per analizzare la vascolarizzazione della retina. Perfusione di vari coloranti è stato utilizzato per evidenziare i vasi, ma tutti hanno condiviso limitazioni simili. Iniezione evidenzia raramente l'intero sistema vascolare della retina a meno dato ad alta pressione, che rischia di rompersi e danneggiare le navi 1. Immunostaining dell'endotelio vascolare con fluoroforo marcato G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 coniugato; I21413, Invitrogen; diluizione 1:100) e monta piatti della retina può evidenziare l'architettura complessiva dei vasi, ma senza la visualizzazione dettagliata di capillari, membrane basali e periciti . È stato osservato dallaFriedenwald che le navi possono essere evidenziate dalla colorazione piatta-monti della retina con acido periodico di Schiff (PAS) o ematossilina ed eosina (H & E) colorazione 10. Tuttavia, la colorazione era non-specifico ai vasi ed evidenziato il tessuto non vascolare pure, rendendo difficile distinguere i vasi. Nel 1960, Cogan e Kuwabara sviluppato la tecnica tripsina digest che ha reso più facile visualizzare la vascolarizzazione della retina da digerire componenti non vascolari della retina 1. Da quel momento, la tripsina digest è diventato il metodo gold standard nell'analisi della vascolarizzazione della retina 2-5. Tuttavia, è importante notare che altre tecniche alternative per isolare il sistema vascolare sono stati descritti. L'uso di lisi osmotica è stato usato per isolare il sistema vascolare e consentire studi biochimici del tessuto 11,12, ma la procedura non è stata utilizzata come metodo primario per studio anatomico. Il metodo di stampa dei tessuti è statautilizzato per isolare ampi segmenti microcircolo e permette la capacità di studiare l'architettura elettrotoniche del sistema vascolare 13. In teoria, questa tecnica potrebbe essere utilizzata anche per studiare i cambiamenti anatomici, come la qualità dei vasi è elevata. Tuttavia, è solo in grado di isolare segmenti della intera rete vascolare. Sebbene questi metodi non possono sostituire tripsina digest, è importante notare che essi hanno diversi vantaggi e le carenze e sono complementari a questo riguardo.
Il metodo digest tripsina è tecnicamente impegnativo e difficile da eseguire in modo coerente 6,7. Inoltre, è stato notato che la tripsina digest è particolarmente difficile in un modello di topo, in particolare quando la si vuole preservare l'architettura complessiva vascolare della retina 6,7. Sfide includono (1) sopra-digestione della retina che causa la perdita sia del sistema vascolare così come il tessuto non vascolare, (2) sotto-digestione, richiedendodissezione estesa meccanico che porterebbe al danneggiamento del letto recipiente, (3) scarsa separazione del tessuto non vascolare dalla vascolatura conseguente colorazione aspecifica. Diversi manoscritti hanno evidenziato queste sfide, ma nessuno ha fornito un protocollo dettagliato e coerente per superarli 14,15. Questo manoscritto introdurrà una metodologia step-by-step dettaglio la tecnica per eseguire la tripsina digest su topo e ratto retine con consigli specifici su come gestire i passaggi particolarmente difficili. Una panoramica schematica è mostrata in Figura 1.
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Protocol
1. Preparazione della retina
- Enucleare l'occhio mouse. Con una sola mano, aprire le palpebre in modo che l'occhio è visibile. Con l'altra mano, utilizzando una pinza curva (curva rivolta verso l'alto), applicare una pressione su aspetti superiore e inferiore dell'orbita fino sporge globo. Chiudere delicatamente forcipe nel lato posteriore dell'occhio e sollevare in un movimento continuo di enucleare l'occhio.
- Fissare gli occhi con il 10% formalina tamponata neutra per almeno 24 ore.
- Luogo occhio in soluzione PBS in una piccola scatola di Petri.
- Sezionare retina attentamente al microscopio, facendo attenzione a non indurre grandi lacrime. Fai un primo taglio nella cornea con le forbici dissezione. Poi, mentre si tiene l'area di taglio con pinze diritte, usare le forbici per tagliare lungo il bordo della cornea e la sclera rimozione della cornea. Utilizzando una pinza sottile curve e rette, togliere la sclera e coroide lontano dalla retina verso il nervo ottico. Questo passaggio richiede pazienza comeliberando rapidamente la retina può portare a rotture. Rimuovere la lente e di qualsiasi diaframma in eccesso e detriti dalla retina 16.
2. L'acqua lava
- Posto retina in un piatto da 24 pozzetti e coprire con acqua (circa 500 pl, filtrata con un filtro almeno 45 micron).
- Cambiare l'acqua ogni 30 minuti-1 ora, almeno 4-5 volte.
- Lasciare una notte in acqua con un leggero scuotimento a temperatura ambiente.
Nota: Le fasi di lavaggio sono molto importanti in quanto aiutano separare gli strati della retina neurale dai vasi sanguigni.
3. Tripsina Digest
- Rimuovere l'acqua ed retina incubare in una soluzione di 3% tripsina (Difco 1:250) in 0,1 M tampone Tris (pH 7,8) a 37 ° C con agitazione delicata per nessuna. Tripsina digest è completata quando il tessuto comincia a mostrare segni di disintegrazione (circa 1,5 ore).
Nota: evitare di rapido scuotimentocome questo può danneggiare il sistema vascolare. - Con attenzione, pipetta fuori tripsina in un separato ben utilizzando un microscopio per evitare di toccare la retina. Questo eccesso tripsina può essere utilizzato in seguito, quando si manipolano i vasi sotto il microscopio, al passo 4.3.
4. Separare il sistema vascolare
- Aggiungere acqua filtrata alla retina. Quindi, tentare di rimuovere la membrana limitante interna con una pinza, usando le forbici se necessario. Agitare con lieve agitazione per 5 minuti. Attentamente, Pipetta fuori l'acqua sotto il microscopio per evitare di danneggiare la retina.
- Ripetere lavaggi con acqua (per 5 minuti ciascuno) per aiutare a liberare la rete di vasi dal tessuto retinico aderente. Lavaggi con acqua vengono completati quando vi è poca o nessuna detriti rimanendo in acqua dopo il lavaggio.
- Manipolazioni attente al microscopio di dissezione sono ora necessari per liberare ulteriormente la rete di vasi. Qui di seguito sono diverse tecniche utili, che possono essere usati in sequenza o individually per ottenere il risultato desiderato in base alle preferenze tecnica:
- Usando una pipetta 200 ml, pipettare con cura l'acqua su e giù accanto alle navi, che soffia acqua a vasi, causando agitazione.
- Utilizzando 200 microlitri pipetta, Pipetta la tripsina su e giù per le pareti cappotto della pipetta. Poi, Pipettare attentamente l'intera rete nave su e giù una volta per aiutare a rompere il tessuto non vascolare.
Nota: centraggio della punta della pipetta al nervo ottico, piuttosto che i bordi della rete vascolare può impedire al sistema vascolare di attaccarsi alla punta. - Sollevare delicatamente vascolare con una pinza sottile di acqua per rimuovere i componenti non-vascolari.
- Se i passaggi precedenti non funzionano, aggiungere tripsina alla retina per aiutare abbattere il tessuto e incubare a 37 ° C per alcuni minuti. Quindi, rimuovere tripsina e ripetere i passaggi 4,1-4,3.
<strong> Nota: Assicurati di rivestire tutti gli strumenti che possono entrare in contatto con le navi in tripsina (ad esempio la punta di pipetta, pinze). Ciò contribuirà a evitare l'adesione del sistema vascolare per l'attrezzatura.
5. Visualizzare la vascolarizzazione
- Mettere una goccia d'acqua su un vetrino pulito. Usando una pipetta 200 microlitri o pinze, trasferire i vasi digeriti in acqua. Assicurarsi che il piano di montaggio vascolare viene spiegato. La tensione superficiale dell'acqua aiuta a spiegare la rete vascolare ora diafana. Se il tessuto non si dipana, aggiungere ulteriore acqua e scuotere delicatamente il vetrino per facilitare dispiegarsi.
- Rimuovere l'acqua in eccesso molto lentamente da pipettaggio o utilizzando un tovagliolo di carta.
- Lasciare vetrini si asciughino completamente.
- Colorare i vetrini tramite protocollo appropriato sia con PAS / ematossilina o H & E macchia.
Nota: PAS / ematossilina è utile per identificare parete del vaso e nuclei cellulari; H & E è utile per demonstration di RBC pure. - Disidratarsi e montare (Permount mezzo di montaggio).
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Representative Results
Il prodotto finale di una procedura di successo è una TV a monte di tutta la rete del mouse vascolarizzazione della retina, con l'architettura mantenuto, colorate sia con PAS / ematossilina o H & E, come mostrato nelle figure 2-4. Chiara differenziazione delle cellule endoteliali e periciti può essere visto come mostrato in Figura 3. Nella retina, i nuclei delle cellule endoteliali sono ovali o allungata e si trova interamente all'interno della parete del vaso. Nuclei periciti sono piccole, sferica, macchia densamente e generalmente hanno una posizione sporgente lungo la parete capillare.
La tripsina digest è una procedura comune per analizzare patologia vascolare in modelli animali diabetici. Lesioni vascolari patologiche quali microaneurismi, fantasmi periciti (evidenza di perdita pericyte), acellulare capillari e degenerazione capillare sono stati descritti. Figura 4 mostra un esempio di degenerazione capillare visto in un topo db / db, un modello di tipo Diabete II. Anche se la procedura è stata ottimizzata per retine topo, risultati simili sono stati ottenuti anche in retine di ratto come mostrato in figura 5. E 'importante notare che retine di ratto sono molto più grandi, e un 12-pozzetti è stato usato al posto di una piastra a 24 pozzetti. La rete di vascolarizzazione della retina di ratto è anche meno fragile rispetto alla controparte mouse.
E 'estremamente importante per rimuovere la maggior quantità di tessuto non vascolare possibile. Eventuali resti porteranno a colorazione aspecifica e portare a scarsa visualizzazione della vascolarizzazione. Figura 6 rappresenta un esempio di rimozione non riuscita di tutto il tessuto non vascolare nel passaggio 4. Analogamente, è anche importante avere la retina si spieghi durante il montaggio in modo da migliorare la visualizzazione della vascolarizzazione. Figura 7 rappresenta infruttuoso svolgersi del piatto monte vascolare nel passo 5.1.
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Figura 1. . Schema di tripsina Digest protocollo (1) Preparazione della retina: isolare retina dall'occhio; (2) L'acqua lava: Lavare in acqua filtrata durante la notte, (3) tripsina Digest: incubare nel 3% tripsina a 37 ° C per 1-1,5 ore; (4) Separazione del sistema vascolare: isolare vascolare attraverso una serie di lavaggi con acqua e la dissezione al microscopio; (5) Spostare vascolare a scivolare e lasciare asciugare; (6) Visualizzare la vascolarizzazione:. scivolo macchia con PAS o H & E, disidratano e montare Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Controllo db / m topo tripsina digest (H & E, 20x).Questa cifra è una panoramica della rete vascolare retinica che mostra normale architettura vascolare.
Figura 3. Controllo db / m topo tripsina digest (H & E, 600x). Questa è una vista ingrandita della retina nella figura 2 mostra l'architettura vascolare normale. Delle cellule endoteliali (freccia bianca) e periciti (freccia nera) sono evidenziati.
Figura 4. Diabetic db / db topo tripsina digest (H & E, 500x). By 52 settimane, db / db topi iniziano a sviluppare la patologia vascolare come la degenerazione capillare (freccia bianca).
Figura 5. Ratto normaleretina tripsina digest, (PAS, 20x [a], 100x [b]). Panoramica e immagine ingrandita di una normale rete vascolare ratto.
Figura 6. Controllo C57/BL6 topo tripsina digest, tessuto non vascolare intatto (H & E, 20x [a], 100x [b]). Con scarsa rimozione del tessuto non vascolare, vi è non-specifica colorazione compromettere visualizzazione dei vasi.
Figura 7. Controllo db / m topo tripsina digest, montaggio povero (H & E, 20x). Se la retina non è adeguatamente spiegato, non vi è inadeguata visualizzazione della rete vascolare.
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Discussion
Tripsina digest è un metodo standard per valutare la vascolarizzazione della retina. Purtroppo è tecnicamente impegnativo e può causare elevato tasso di perdita di campione, se non eseguite correttamente. Inoltre, la procedura è particolarmente difficile nei topi, che può limitare l'applicazione di questa tecnica nei comunemente utilizzati modelli animali genetici di malattie oculari. Questo documento fornisce una guida su come eseguire la procedura efficace e coerente con gli occhi del mouse.
Ci sono diversi passaggi critici nel protocollo. Prima, è fondamentale che la retina essere sezionato con attenzione per evitare qualsiasi grandi lacrime, per garantire che la rete vascolare rimane intatto. In secondo luogo, il lavaggio della retina in acqua filtrata durante la notte è importante in quanto aiuta a separare gli strati neuroretinico dai vasi sanguigni, il che facilita una separazione più facile dopo tripsina digest. Una modifica che potrebbe accelerare il processo sarebbe quello di mettere la retina in 1% triton X-100 mescolato in acqua filtrata per 1-2 ore. Poi, tripsina digest può essere eseguita il giorno stesso dopo una serie di acqua lava per rimuovere il triton X.
È importante che i tessuti retinici essere monitorati costantemente durante la tripsina digest per evitare scioglimento involontario del tessuto vascolare. Sulla base della nostra esperienza, circa 1-1,5 ore è sufficiente per compiere la digestione del tessuto neurale, preservando il sistema vascolare intatto. È necessario meno tempo per i topi più giovani. Leggero scuotimento può essere eseguita durante la tripsina digest per facilitare la separazione dei vasi sanguigni dal tessuto rimanente, ma non è necessario. È importante evitare forte agitazione come questo può portare alla lacerazione dei vasi.
I passaggi critici che richiedono maggiore attenzione riguardano la separazione del sistema vascolare dopo tripsina digestione. Quando si eseguono i lavaggi con acqua, è importante evitare pipettaggio la vascolarizzazione. Aggiunta della vascolarizzazione deve essere usato solo come un metodo per separare il sistema vascolare dopo le pareti sono state rivestite con tripsina. Tutte le manipolazioni devono essere fatte attentamente al microscopio dissezione, come la rete di vasi può essere facilmente danneggiato. Le diverse tecniche descritte nel punto 4 possono essere utilizzati con successo in una varietà di combinazioni. In ultima analisi, spetterà allo sperimentatore individuale di trovare l'approccio che funziona meglio per loro. È importante che tutti gli strumenti che entreranno in contatto con i vasi sanguigni essere rivestiti con tripsina. Immergendo gli strumenti intermittenza e spesso in tripsina durante la procedura può impedire l'adesione di perturbazione vascolarizzazione e potenziali.
L'efficacia della procedura è anche dipendente dal modello di sfondo del mouse. Alcuni sfondi del mouse non sono così favorevole a conservare tutta la rete vascolare. Ad esempio, lo sfondo FVB è omozigote per una mutazione fosfodiesterasi-6 rendendole inclini a ridegenerazione tinal 17. Dalla nostra esperienza, abbiamo scoperto che il loro sistema vascolare retinica è intrinsecamente più fragile, e non siamo riusciti a conservare tutta la rete vascolare. Quindi, è importante che lo sfondo da prendere in considerazione prima di tentare questa tecnica.
In definitiva, il limite principale di questa procedura è abilità di dissezione di un individuo. È importante notare che anche se un individuo conosce bene le tecniche, possono essere necessari diversi tentativi prima di iniziare a conseguire risultati coerenti. Pertanto, si consiglia che il personale di laboratorio interessate svolgono diverse dissezioni di pratica per ottenere la fiducia e arrivare a un approccio migliore e più coerente prima di eseguire la procedura a loro tessuto sperimentale. È importante notare che, una volta appreso, tripsina digest è una tecnica prezioso che può essere utilizzato per valutare la patologia vascolare (Figura 4). Tripsina digest può essere eseguita anche successo sul conservato retine che sono state in fissativo per diversi anni 1.
In conclusione, la tripsina digest continua ad essere un metodo estremamente utile per analizzare il sistema vascolare della retina dalla sua descrizione di Cogan e Kuwabara nel 1960. Esso permette la visualizzazione dettagliata di tutta la rete vascolare, rispetto a immunofluorescenza / H & E / PAS sezioni colorate, piatta-monti e dye-iniezioni. Anche se è tecnicamente difficile, questo manoscritto descrive la procedura in dettaglio in modo che possa essere eseguita con successo. Come risultato, speriamo ricercatori alle prime armi con il metodo avranno indicazioni sufficienti per consentire l'analisi di successo e coerente del sistema vascolare retinica nei loro modelli sperimentali.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Società per la Prevenzione della Cecità (JCC, AAF), i fondi non vincolati al Dipartimento di Oftalmologia di ricerca per prevenire la cecità (RPB), NY e RPB Medical Student Fellowship di Grant (CCM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
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