Summary
Trypsin Digest ist eines der am häufigsten verwendeten Methoden, um retinale Gefäßsystem zu analysieren. Dieses Manuskript beschreibt das Verfahren im Detail, einschließlich der wichtigsten Änderungen, die Technik zu optimieren und entfernen Sie die nicht-vaskulären Gewebe und gleichzeitig die gesamte Architektur der Schiffe.
Abstract
Trypsin verdauen ist der Goldstandard Methode, um die retinale Gefäßsystem 1-5 zu analysieren. Es ermöglicht die Visualisierung des gesamten Netzwerks von komplexen dreidimensionalen retinalen Blutgefäßen und Kapillaren, indem eine zweidimensionale Flachbild-Halterung der miteinander verbundenen Gefäßkanäle nach Aufschluss der nicht-vaskulären Komponenten der Netzhaut. Dies erlaubt es, verschiedene pathologische Gefäßveränderungen, wie Mikroaneurysmen Kapillare Degeneration und abnorme Endothelzellen zu pericyte Verhältnisse zu studieren. Allerdings ist das Verfahren technisch anspruchsvoll, vor allem bei Mäusen, die haben sich die am weitesten verbreitete Tiermodell, um die Netzhaut wegen der Leichtigkeit der genetischen Manipulationen 6,7 studieren. In der Maus Auge, ist es besonders schwierig, vollständig zu entfernen, die nicht-vaskulären Komponenten, während die allgemeine Struktur der Blutgefäße der Netzhaut. Bis heute gibt es einen Mangel an Literatur, die Trypsin verdauen Technik beschreibt im Detail, in die Maus. Dieses Manuskript enthält eine detaillierte Schritt-für-Schritt-Methodik des Trypsin Digest in Maus Netzhaut, sondern schafft auch Tipps zur Fehlerbehebung schwierige Schritte.
Introduction
Visualisierung des Gefäßsystems der Netzhaut ist ein äußerst wichtiger Ansatz, um die Mechanismen der verschiedenen Augenkrankheiten wie diabetischer Retinopathie sezieren. Er erlaubt es, die frühesten Gefäßveränderungen, einschließlich Mikroaneurysmen, Kapillar-Degeneration und Verlust pericyte 8,9 bewerten. Bis heute gab es mehrere Techniken entwickelt, um die retinale Gefäßsystem zu analysieren. Perfusion verschiedener Farbstoffe verwendet worden ist, um die Gefäße zu markieren, sondern alle ähnliche Grenzen geteilt. Injection selten hebt die gesamte Netzhaut Gefäßsystem, es sei denn bei einem hohen Druck, das Aufbrechen und schädigen die Gefäße 1 Risiken gegeben. Immunfärbung von vaskulären Endothel mit fluorophormarkierten G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugierten; I21413; Invitrogen; Verdünnung 1:100) und retinale flachen Halterungen können markieren Sie die gesamte Architektur der Schiffe, aber ohne detaillierte Visualisierung der Kapillaren, Basalmembranen und Perizyten . Es wurde von dem bekanntenFriedenwald, dass die Schiffe durch Färbung Flachbild-Halterungen der Netzhaut mit periodischen acid-Schiff (PAS) oder Hämatoxylin und Eosin (H & E)-Färbung 10 können hervorgehoben werden. Allerdings war Färbung nicht spezifisch für die Gefäße und markiert die nicht-vaskulären Gewebe sowie, was es schwierig macht, die Gefäße zu unterscheiden. In den 1960er Jahren entwickelt und Cogan Kuwabara das Trypsin zu verdauen Technik, die es einfacher, die retinalen Gefäße durch Verdauen des vaskulären Komponenten der Netzhaut 1 sichtbar gemacht. Seit dieser Zeit hat sich das Trypsin Digest zum Goldstandard-Methode bei der Analyse der Gefäße der Netzhaut 2-5. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass andere alternative Techniken, um das Gefäß zu isolieren beschrieben wurden. Die Verwendung von osmotischen Lyse wurde verwendet, um die Gefäße zu isolieren und damit biochemische Untersuchungen des Gewebes 11,12, aber das Verfahren ist nicht als primäre Methode anatomischen Studie verwendet. Das Gewebe Druckmethode wurdeverwendet werden, um große Teile der Mikrovaskulatur zu isolieren und ermöglicht die Fähigkeit, die elektrotonischen Architektur des Gefäßsystems 13 zu studieren. Theoretisch könnte diese Technik auch verwendet werden, um anatomische Veränderungen zu untersuchen, wie die Qualität der Gefäße hoch ist. Es ist jedoch nur in der Lage, um Segmente des gesamten Gefäßsystem Netzwerk zu isolieren. Obwohl diese Methoden nicht ersetzen kann Trypsin verdauen, ist es wichtig zu beachten, dass sie unterschiedliche Vor-und Nachteile haben und sind in dieser Hinsicht ergänzen.
Das Trypsin Digest-Methode ist technisch anspruchsvoll und schwierig ist, konsequent 6,7 durchzuführen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass Trypsin Digest besonders schwierig ist auf einem Maus-Modell, insbesondere, wenn man wünscht, die gesamte Gefäßarchitektur der Netzhaut 6,7 bewahren. Herausforderungen umfassen (1) über-Verdauung der Netzhaut, Verlust sowohl das Gefäßsystem sowie nicht-vaskulären Gewebe verursacht, (2) unter-Verdauung, erfordernumfangreiche mechanische Präparation wodurch wiederum führen zu Schäden des Schiffes Bett, (3) einer schlechten Trennung des nicht-vaskulären Gewebes aus dem Gefäßsystem zu nicht-spezifischen Färbung. Mehrere Manuskripte haben diese Herausforderungen hervorgehoben, aber keine haben eine detaillierte und konsistente Protokoll vorgesehen, um sie zu überwinden 14,15. Dieses Manuskript wird es eine Schritt-für-Schritt-Methodik detailliert die Technik, um das Trypsin zu verdauen auf Maus und Ratte Netzhaut führen mit speziellen Tipps für den Umgang mit den besonders schwierigen Schritte. Eine schematische Übersicht ist in Fig. 1 gezeigt.
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Protocol
1. Retinal Vorbereitung
- Enucleate die Maus Auge. Mit einer Hand, öffnen Sie die Augenlider so dass das Auge sichtbar ist. Mit der anderen Hand, mit einer gebogenen Pinzette (gebogen nach oben), Druck auf superior und inferior Aspekte der Umlaufbahn, bis die Kugel ragt. Schließen Sie vorsichtig Zange am hinteren Teil des Auges und heben in einer kontinuierlichen Bewegung, um das Auge entkernen.
- Fix Auge mit 10% neutral gepuffertem Formalin für mindestens 24 Stunden.
- Augenmarker in PBS-Lösung in eine kleine Petrischale.
- Sezieren Netzhaut sorgfältig unter dem Mikroskop, wobei darauf zu achten induzieren große Tränen. Machen Sie eine erste Schnitt in der Hornhaut mit Dissektion Schere. Dann während die Schnittfläche mit geraden Pinzette, mit einer Schere entlang der Grenze der Hornhaut und Lederhaut Entfernen der Hornhaut geschnitten. Mit feinen gebogenen und geraden Pinzette vorsichtig schälen die Lederhaut und Aderhaut weg von der Netzhaut zum Sehnerven. Dieser Schritt erfordert Geduldschnell die Befreiung der Netzhaut kann zu Tränen führen. Nehmen Sie den Objektivdeckel und überschüssige Iris und Schmutz von der Netzhaut 16.
2. Wasser wäscht
- Platz Netzhaut in eine 24-Well-Platte und Deckel mit Wasser (etwa 500 ul, mit mindestens einem 45 um-Filter gefiltert).
- Wechseln Sie das Wasser alle 30 min-1 h, mindestens 4-5 mal.
- Lassen Sie über Nacht in Wasser unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur.
Hinweis: Die Waschschritte sind sehr wichtig, da sie zu trennen, die neuralen retinalen Schichten aus den Blutgefäßen zu helfen.
3. Trypsin Digest
- Entfernen Sie das Wasser und Inkubation Netzhaut in einer Lösung von 3% Trypsin (Difco 1:250) in 0,1 M Tris-Puffer (pH 7,8) bei 37 ° C unter leichtem Schütteln keiner. Trypsin verdauen ist abgeschlossen, wenn das Gewebe beginnt Anzeichen des Zerfalls (ca. 1,5 h).
Hinweis: Vermeiden Sie schnelles Schüttelnda dies zu Schäden am Gefäßsystem. - Vorsichtig aus Trypsin Pipette in einem separaten und mit Hilfe eines Mikroskops zu vermeiden, berühren die Netzhaut. Dieses überschüssige Trypsin kann später verwendet werden, wenn die Manipulation der Gefäße unter dem Mikroskop, in Schritt 4.3.
4. Die Trennung des Gefäßsystems
- In gefiltertes Wasser an der Netzhaut. Dann schälen versuchen aus dem inneren Grenzmembran mit einer Pinzette, mit der Schere, wenn nötig. Schütteln Sie unter leichtem Rühren für 5 min. Vorsichtig Pipette das Wasser unter dem Mikroskop, um eine Beschädigung der Netzhaut.
- Wiederholen Wasserwaschungen (jeweils 5 min), um kostenlos das Netzwerk von Schiffen aus der anhaftenden Netzhautgewebe helfen. Wasser wäscht abgeschlossen sind, wenn es wenig bis gar keine Trümmer im Wasser nach dem Waschen.
- Sorgfältige Manipulationen unter einem Dissektionsmikroskop nun weiter frei bis das Netzwerk von Schiffen benötigt. Nachfolgend finden Sie einige nützliche Techniken, die in Sequenz oder ind verwendet werden kannividually zur Erreichung des gewünschten Ergebnisses zu technischen Präferenz:
- Mit einer 200 ul Pipette vorsichtig pipettieren Wasser nach oben und unten neben Schiffen, bläst Wasser bei Schiffen, was leichtem Rühren.
- Mit 200 ul Pipette pipettieren das Trypsin nach oben und unten zu beschichten Wände der Pipette helfen. Anschließend vorsichtig mit Pipette das gesamte Gefäß-Netzwerk einmal auf und ab zu helfen, brechen nicht-vaskulären Gewebe.
Hinweis: Zentrieren der Pipettenspitze an der Sehnerven nicht die Kanten des vaskulären Netz kann auch verhindern, dass das Gefäßsystem Kleben an der Spitze. - Heben Gefäßsystem mit feinen Pinzette aus dem Wasser, um nicht-vaskulären Komponenten zu entfernen.
- Wenn die oben genannten Schritte nicht funktionieren, fügen Trypsin auf die Netzhaut zu helfen, brechen das Gewebe, und Inkubation bei 37 ° C für mehrere Minuten. Dann entfernen Trypsin und wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.3.
<strong> Hinweis: Achten Sie darauf, zu beschichten alle Instrumente, die in Kontakt mit den Gefäßen in Trypsin (zB Pipette, Pinzette) wird kommen. Dies wird Ihnen helfen zu vermeiden Haftung Gefäßsystem an die Ausrüstung.
5. Visualisierung des Gefäßsystems
- Geben Sie einen Tropfen Wasser auf einen sauberen Objektträger. Mit einer 200 ul Pipette oder Pinzette, übertragen Sie die verdaut Schiffe ins Wasser. Stellen Sie sicher, dass das vaskuläre Flachbild-Halterung entfaltet. Die Oberflächenspannung des Wassers hilft, die jetzt durchsichtig Gefäßnetz entfalten. Wenn das Gewebe nicht zu entfalten ist, fügen Sie zusätzliche Wasser und schütteln Sie die Folie zu erleichtern Entfaltung.
- Überschüssiges Wasser sehr langsam durch Pipettieren oder mit einem Papiertuch.
- Lassen Sie die Objektträger vollständig trocknen.
- Stain Folien über entsprechende Protokoll entweder mit PAS / Hämatoxylin oder H & E-Färbung.
Hinweis: PAS / Hämatoxylin ist nützlich zur Identifizierung von Gefäßwand und Zellkerne, H & E ist nützlich für demonstration von RBC als gut. - Entwässern und montieren (Permount Eindeckmediums).
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Representative Results
Das Endprodukt eines erfolgreichen Verfahrens ist ein Flachbild-Halterung des gesamten Netzes der Maus retinalen Gefäßen, mit der Architektur gehalten, gefärbt entweder mit PAS / Hämatoxylin oder H & E, wie in den Figuren 2-4 gezeigt. Klare Differenzierung von Endothelzellen und Perizyten zu sehen, wie in Abbildung 3 gezeigt. In der Netzhaut sind die Kerne von Endothelzellen oval oder länglich und liegen vollständig innerhalb der Gefäßwand. Perizyten Kerne sind klein, kugelförmig, dicht färben und haben in der Regel einen hervorstehenden Position entlang der Kapillarwand.
Trypsin Digest ist ein übliches Verfahren, um Gefäßpathologie in diabetischen Tiermodellen zu analysieren. Pathologische Gefäßveränderungen wie Mikroaneurysmen pericyte Geister (Nachweis der pericyte Verlust), acellular Kapillaren und kapillare Degeneration beschrieben worden. Abbildung 4 zeigt ein Beispiel der Kapillare Degeneration in einem db / db-Maus gesehen, ein Modell für die Art II Diabetes. Obwohl das Verfahren für Maus Netzhaut optimiert wurde, wurden ähnliche Ergebnisse auch in Ratten Netzhaut wurden erhalten, wie in 5 gezeigt. Es ist wichtig zu beachten, dass Ratte Netzhaut viel größer sind, und eine 12-Well-Platte wurde anstelle einer 24-Well-Platte verwendet. Das Gefäßsystem Netzwerk der Ratte Netzhaut ist auch weniger zerbrechlich als der Maus-Pendant.
Es ist äußerst wichtig, so viel von der nicht-vaskulären Gewebe wie möglich zu entfernen. Etwaige Reste wird, um unspezifische Färbung führen und führen zu schlechten Visualisierung des Gefäßsystems. Abbildung 6 zeigt ein Beispiel der erfolglosen Entfernung der gesamten nicht-vaskulären Gewebes in Schritt 4. Ebenso ist es auch wichtig, dass die Netzhaut entfaltet werden bei der Montage so Visualisierung des Gefäßsystems zu verbessern. 7 stellt erfolglos Entfaltung des vaskulären Flachbild-Halterung in Schritt 5.1.
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Abbildung 1. . Schematische Darstellung der Trypsin Digest Protocol (1) Retinal Zubereitung: isolieren Netzhaut vor Augen; (2) Wasser wäscht: Waschen in gefiltertem Wasser über Nacht, (3) Trypsin Digest: Inkubation in 3% Trypsin bei 37 ° C für 1-1,5 h; (4) Die Trennung des Gefäßsystems: isolieren Gefäßsystem über Reihe von Wasser wäscht und Präparation unter dem Mikroskop; (5) Bewegen Gefäßsystem zu rutschen und trocknen lassen, (6) Visualisierung des Gefäßsystems:. Fleck Schlitten mit PAS oder H & E, dehydrieren und montieren Klicken Sie hier um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. Steuerung db / m Maus Trypsin Digest (H & E, 20x).Diese Zahl ist ein Überblick über die Netzhaut Gefäßnetz zeigt normale vaskuläre Architektur.
Abbildung 3. Steuerung db / m Maus Trypsin Digest (H & E, 600x). Dies ist eine vergrößerte Ansicht der Netzhaut in Abbildung 2 zeigt normale Gefäßarchitektur. Endothelzellen (weißer Pfeil) und pericyte (schwarzer Pfeil) sind markiert.
Abbildung 4. Diabetic db / db Maus Trypsin Digest (H & E, 500x). Durch 52 Wochen, beginnen db / db Mäuse Gefäßpathologie wie Kapillar-Degeneration (weißer Pfeil) zu entwickeln.
Abbildung 5. Normale RattenNetzhaut Trypsin Digest (PAS, 20x [a], 100x [b]). Einen Überblick und vergrößerte Bild einer normalen Ratte Gefäßnetz.
Abbildung 6. Steuerung C57/Bl6 Maus Trypsin verdauen, nicht-vaskulären Gewebe intakt (H & E, 20x [a], 100x [b]). Bei schlechten Entfernung des nicht-vaskulären Gewebe, gibt es nicht-spezifische Färbung beeinträchtigen Darstellung von Gefäßen.
Abbildung 7. Steuerung db / m Maus Trypsin verdauen, schlechte Montage (H & E, 20x). Wenn die Netzhaut nicht ausreichend entfaltet, gibt es nur unzureichende Darstellung der vaskulären Netzwerk.
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Discussion
Trypsin Digest ist ein Standardverfahren, um die Vaskulatur des Retina zu bewerten. Leider ist es technisch anspruchsvoll und kann in hohen Rate von Probe verloren gehen, wenn sie nicht ordnungsgemäß durchgeführt. Darüber hinaus ist das Verfahren besonders schwierig in Mäusen, welche die Anwendung dieser Technik bei den üblicherweise verwendeten genetischen Tiermodellen für Erkrankungen des Auges zu begrenzen. Dieses Papier gibt Hinweise, wie das Verfahren effektiv und konsequent durchzuführen, Maus Augen.
Es gibt mehrere wichtige Schritte in dem Protokoll. Erstens ist es wichtig, dass die Netzhaut vorsichtig erfolgen, um keine großen Risse vermieden werden, um sicherzustellen, dass die Blutgefäße intakt bleibt seziert. Zweitens, das Waschen der Netzhaut in gefiltertem Wasser über Nacht ist wichtig, da sie trennen die neuroretinalen Schichten aus den Blutgefäßen, was eine leichtere Trennung nach Trypsin verdauen hilft erleichtert. Eine Modifikation, die den Prozess zu beschleunigen könnte, wäre die Netzhaut in 1% tri platzierenton X-100 in gefiltertes Wasser für 1-2 Stunden gemischt. Dann Trypsin verdauen können am selben Tag durchgeführt, nachdem eine Reihe von Wasser wäscht werden dem Triton X. entfernen
Es ist wichtig, dass die retinale Gewebe ständig während der Trypsin-Verdau überwacht werden, um ein unbeabsichtigtes Lösen des Gefäßsystems Gewebe zu vermeiden. Basierend auf unserer Erfahrung, ist etwa 1-1,5 Stunden ausreichend, um die Verdauung des neuronalen Gewebes zu erreichen, während die Erhaltung der intakten Gefäßsystems. Weniger Zeit für die kleinen Mäuse benötigt. Unter leichtem Schütteln während der Trypsin Digest durchgeführt werden, um zu ermöglichen die Trennung der Blutgefäße vom übrigen Gewebe, aber nicht notwendig. Es ist wichtig zu starkem Rühren zu vermeiden, da dies zum Reißen der Gefäße führen.
Die kritischen Schritte, die die meiste Aufmerksamkeit erfordern die Aufteilung in die Gefäße nach Trypsin Verdauung. Bei der Durchführung der Waschvorgänge mit Wasser ist es wichtig, zu vermeiden Pipettieren des Gefäßsystems. Pipettieren vondie Vaskulatur sollte nur als ein Verfahren zur Trennung des Gefäßsystems nach der die Wände mit Trypsin beschichtet wurden verwendet werden. Alle Arbeiten müssen sorgfältig unter dem Dissektionsmikroskop durchgeführt werden, da das Netz der Schiffe leicht beschädigt werden können. Die verschiedenen Techniken, die in Schritt 4 beschrieben erfolgreich in verschiedenen Kombinationen verwendet werden. Letztlich wird es bis zu den einzelnen Experimentator sein, den Ansatz, die am besten für sie zu finden. Es ist wichtig, dass alle Werkzeuge, die in Kontakt mit den Blutgefäßen kommen mit Trypsin beschichtet werden. Tauchen die Werkzeuge intermittierend und oft in Trypsin während des Verfahrens verhindern Haftung Gefäßsystem und potenziellen Störungen.
Die Wirksamkeit des Verfahrens ist auch abhängig von der Hintergrund-Mausmodell. Einige Maus Hintergründe sind nicht als förderlich für die Erhaltung der gesamten Gefäßsystem Netzwerk. Zum Beispiel ist die FVB Hintergrund homozygot für ein Phosphodiesterase-6 Mutation was sie anfällig für neuDarm-Degeneration 17. Aus unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass ihre Netzhaut Gefäßsystem inhärent instabil ist, und wir waren nicht in der Lage, das gesamte Gefäßsystem Netzwerk zu bewahren. Daher ist es wichtig, dass der Hintergrund berücksichtigt werden, bevor versucht diese Technik.
Letztlich ist die wichtigste Einschränkung dieses Verfahrens eine individuelle Dissektion Fähigkeiten. Es ist wichtig zu beachten, dass, selbst wenn eine Person kennt die Techniken, kann es mehrere Versuche, bevor sie auf konsistente Ergebnisse zu erzielen beginnen. Daher empfehlen wir, dass die interessierten Laborpersonal mehrere Sektionen Praxis durchführen, um Vertrauen zu gewinnen und kommen am besten und schlüssiges Konzept vor der Durchführung des Verfahrens auf ihre experimentellen Gewebe. Es ist wichtig zu beachten, dass, sobald sie beherrscht, Trypsin Digest eine wertvolle Technik, die bei vaskulären Pathologie (Abbildung 4) beurteilen kann. Trypsin verdauen können auch durchgeführt werden, erfolgreicherfolgreich auf die Netzhaut erhalten in Fixativ für mehrere Jahre 1 gewesen.
Abschließend setzt Trypsin verdauen als äußerst nützliche Methode, um die retinale Gefäßsystem seit seiner Beschreibung durch Cogan und Kuwabara in den 1960er Jahren zu analysieren. Es ermöglicht die detaillierte Darstellung des gesamten Gefäßsystems Netzbetrieb nach Immunfluoreszenz / H & E / PAS gefärbten Schnitten, Flachbild-Halterungen und Farbstoff-Injektionen im Vergleich. Obwohl es technisch schwierig ist, beschreibt diese Handschrift das Verfahren im Detail, so dass sie erfolgreich durchgeführt werden kann. Dadurch hoffen wir, dass die Ermittler Anfänger der Methode wird eine ausreichende Führung haben zu einer erfolgreichen und konsequenten Analyse der retinalen Gefäßsystem in ihre experimentellen Modellen ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch die NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Gesellschaft für Verhütung von Blindheit (JCC, AAF), uneingeschränkte Mittel an die Klinik für Augenheilkunde von der Forschung bis Blindness (RPB) Verhindere, NY und RPB Medical Student Fellowship Grants unterstützt (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
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