Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר

doi: 10.3791/50489 Published: June 13, 2013

Summary

טריפסין עיכול הוא אחת מהשיטות הנפוצות ביותר לניתוח כלי הדם ברשתית. כתב יד זה מתאר את השיטה בפירוט, כולל שינויים מרכזיים כדי לייעל את הטכניקה ולהסיר את הרקמה ללא כלי הדם תוך השמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם.

Abstract

טריפסין עיכול הוא שיטת תקן זהב לניתוח בכלי הדם ברשתית 1-5. זה מאפשר הדמיה של כל הרשת מורכב של כלי תלת ממדים ברשתית ונימי דם על ידי יצירת שטוח הר דו ממדי של כלי הדם המחוברים בין הערוצים לאחר עיכול של המרכיבים שאינם בכלי הדם של הרשתית. זה מאפשר לאדם ללמוד שינויים פתולוגיים בכלי הדם שונים, כגון microaneurysms, ניוון נימים, והאנדותל נורמלי ליחסי pericyte. עם זאת, השיטה היא מאתגרת מבחינה טכנית, במיוחד בעכברים, שהפך למודל של בעלי החיים באופן נרחב ביותר שקיימים כדי ללמוד את הרשתית בגלל הקלות של מניפולציות גנטיות 6,7. בעיני העכבר, זה קשה במיוחד להסרה מלא של רכיבים שאינם כלי הדם, תוך שמירה על הארכיטקטורה הכוללת של כלי הדם ברשתית. נכון להיום, קיים מחסור בספרות המתארת ​​את הטכניקה לעכל טריפסין בפירוט אניn העכבר. כתב יד זה מספק מתודולוגיה צעד אחר צעד מפורט של לעכל טריפסין ברשתית עכבר, תוך מתן גם טיפים על שלבים לפתרון בעיה קשים.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לדמיין את כלי הדם של הרשתית היא גישה מאוד חשוב לנתח את המנגנונים של מחלות עיניים שונות, כגון רטינופתיה סוכרתית. זה מאפשר לאדם להעריך את ליקויים בכלי הדם המוקדמים, כולל microaneurysms, ניוון נימים, ואובדן pericyte 8,9. עד כה, היו מספר טכניקות שפותחו לניתוח בכלי הדם ברשתית. טפטוף של צבעים שונים נעשה שימוש כדי לסמן את הכלים, אבל כולם חלקו מגבלות דומות. לעתים רחוקות הזרקה מדגישה את כלי הדם ברשתית כולה, אלא אם כן ניתנו בלחץ גבוה, המסכן את פקיעת ופגיעה בכולים 1. Immunostaining של האנדותל של כלי דם שבכותרת fluorophore G isolectin B4 (אלקסה פלואוריד 594 מצומדות; I21413; Invitrogen; 1:100 דילול) וmounts שטוח רשתית יכול להדגיש את הארכיטקטורה הכוללת של כלי, אבל בלי הדמיה מפורטת של נימי דם, קרומי מרתף וpericytes . צוין על ידיפרידנוואלד שיכול להיות מודגש על ידי צביעת כלי שטוח mounts של רשתית עם תקופתי חומצה שיף (PAS) או hematoxylin ו eosin (H & E) מכתים 10. עם זאת, הצביעה הייתה לא ספציפית לכלי, והדגישה את הרקמה ללא כלי הדם, כמו גם, ולכן קשה להבדיל בין הכלים. בשנתי ה -1960, קוגן וKuwabara פיתחה את הטכניקה לעכל טריפסין שעשה את זה קל יותר לדמיין את כלי הדם ברשתית על ידי לעכל את מרכיבי nonvascular של הרשתית 1. מאז אותו הזמן, לעכל טריפסין הפכה את שיטת תקן זהב בניתוח בכלי הדם של רשתית 2-5. עם זאת, חשוב לציין כי טכניקות חלופיות אחרות כדי לבודד את כלי הדם כבר תאר. השימוש בתמוגה האוסמוטי נעשתה שימוש כדי לבודד את כלי הדם ומאפשר מחקרים ביוכימיים של רקמת 11,12, אך ההליך לא נעשה שימוש כדרך עיקרי ללימוד אנטומי. שיטת הדפסת הרקמות כברמשמש לבודד חלקים גדולים של microvasculature ומאפשר את היכולת ללמוד ארכיטקטורת electrotonic של כלי הדם 13. בתאוריה, טכניקה זו יכולה לשמש גם כדי ללמוד את השינויים אנטומיים, כמו האיכות של כלי היא גבוהה. עם זאת, הוא רק הצליח לבודד מקטעים של רשת כלי הדם כולו. למרות ששיטות אלה לא יכולים להחליף טריפסין לעכל, חשוב לציין שיש להם יתרונות וחסרונות שונים ומשלימים בעניין זה.

שיטת עיכול טריפסין היא מאתגרת מבחינה טכנית וקשה לביצוע באופן עקבי 6,7. יתר על כן, כבר ציין כי טריפסין לעכל קשה במיוחד במודל של עכברים, במיוחד אם אחד רצונות כדי לשמר את הארכיטקטורה הכללית של כלי הדם ברשתית 6,7. אתגרים כוללים (1) יתר מערכת העיכול של הרשתית שגורמת לאובדן של שניהם בכלי הדם, כמו גם רקמה ללא כלי דם, (2) מתחת לעיכול, הדורשיםנתיחה מכאנית נרחבת אשר עלולה להוביל לנזק של כלי המיטה, (3) הפרדה לקויה של הרקמות שאינן כלי דם מכלי הדם שמוביל לכתמים שאינם ספציפיים. כמה כתבי יד הדגישו האתגרים הללו, אבל אף סיפקו פרוטוקול מפורט ועקבי כדי להתגבר עליהם 14,15. כתב יד זה יציג מתודולוגיה צעד אחר צעד המפרטת את הטכניקה לביצוע לעכל טריפסין על רשתיות עכבר וחולדה עם עצות ספציפיות בטיפול בשלבים הקשים במיוחד. סקירה סכמטית מוצגת באיור 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת רשתית

  1. Enucleate עין העכבר. שימוש ביד אחת, לפתוח את עפעפי העין, כך שהעין גלויה. ביד השנייה, תוך שימוש במלקחיים מעוקלים כלפי מעלה (מול מעוגל), להפעיל לחץ על היבטים עליונים ונחותים של המסלול עד שבולט הגלובוס. בעדינות לסגור מלקחיים בחלק האחורי של העין ולהרים בתנועה רציפה לenucleate העין.
  2. תקן את העין עם 10% ניטראלי שנאגרו פורמלין במשך לפחות 24 שעות.
  3. עיניו את המקום בפתרון PBS בצלחת פטרי קטנה.
  4. לנתח את רשתית בזהירות מתחת למיקרוסקופ, מקפידים להימנע מגרימת דמעות גדולות. הפוך את חתך ראשוני בקרנית עם מספריים לנתיחה. ואז, תוך כדי לחיצה על אזור החתך עם מלקחיים ישרים, השתמש במספריים כדי לגזור לאורך הגבול של הקרנית ולובן עין הסרת הקרנית. באמצעות מלקחיים מעוקלים וישרים עדינים, בזהירות לקלף את לובן העין ורחוקה מהרשתית אל עצב הראייה דמית העין. צעד זה דורש סבלנות כמולשחרר את הרשתית במהירות יכול לגרום לדמעות. הסר את העדשה וכל קשתית עודפת ופסולת מהרשתית 16.

2. מים שוטפים

  1. רשתית מניחה בצלחת ומכסים במים (כ 500 μl, מסונן עם לפחות מסנן מיקרומטר 45) 24 גם.
  2. שינוי מים כל דקות-1 שעות 30, לפחות 4-5 פעמים.
  3. להשאיר למשך לילה במים עם טלטול עדין בטמפרטורת חדר.

הערה: שלבי הכביסה הם מאוד חשובים כפי שהוא לסייע להפריד בין שכבות רשתית עצביות מכלי הדם.

3. טריפסין דייג'סט

  1. הסר את המים ואת רשתית דגירה בתמיסה של 3% טריפסין (Difco 1:250) ב0.1 מ 'טריס חיץ (pH 7.8) בשעה 37 ° C עם רעד עדין לא. טריפסין עיכול יושלם כאשר הרקמה מתחילה להראות סימני ההתפוררות (כ 1.5 שעות).
    שים לב: יש להימנע מטלטול מהירכמו זה יכול לגרום נזק לכלי הדם.
  2. זהירות, פיפטה טריפסין אל נפרד גם באמצעות מיקרוסקופ כדי להימנע מלגעת ברשתית. טריפסין עודף זה יכול לשמש מאוחר יותר, כאשר מניפולציה של כלי מתחת למיקרוסקופ, בשלב 4.3.

4. הפרדת כלי הדם

  1. הוסף מים מסוננים לרשתית. לאחר מכן, אנסה לקלף את קרום הגבלה הפנימי עם מלקחיים, תוך שימוש במספריים במידת צורך. Shake עם תסיסה עדינה במשך 5 דקות. זהירות, פיפטה את המים מתחת למיקרוסקופ, כדי למנוע פגיעה ברשתית.
  2. חזור על שוטף למים (5 דקות כל אחד) כדי לסייע בחינם ברשת של כלי מרקמת הרשתית חסיד. שוטף מים הושלם כאשר יש לא מעט פסולת שנותרה במים לאחר שטיפה.
  3. מניפולציות זהירות תחת מיקרוסקופ לנתיחה כעת זקוקה לחופשיים יותר את הרשת של כלי דם. להלן כמה טכניקות שימושיות, אשר עשוי לשמש ברצף או individually כדי להשיג את התוצאה הרצויה על בסיס העדפה טכנית:
    1. בעזרת פיפטה μl 200, פיפטה בזהירות מים למעלה ולמטה בסמוך לכלי שיט, שנושב בכלי מים, גורם לתסיסה עדינה.
    2. באמצעות פיפטה μl 200, פיפטה טריפסין למעלה ולמטה כדי לעזור קירות מעיל של פיפטה. ואז, בזהירות פיפטה רשת הכלי כולו למעלה ולמטה פעם אחת כדי לעזור לשבור את הרקמה ללא כלי דם.
      הערה: מרכוז קצה פיפטה בעצב הראייה ולא את הקצוות של רשת כלי הדם יכול גם למנוע מהם להידבק כלי דם ועד לקצה.
    3. רם בעדינות כלי דם עם מלקחיים עדינים מחוץ למים כדי לסלק רכיבים שאינם בכלי הדם.
    4. אם הצעדים הנ"ל אינם עובדים, להוסיף טריפסין לרשתית כדי לעזור לשבור את הרקמה, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך מספר דקות. לאחר מכן, להסיר טריפסין וחזור על שלבי 4.1-4.3.

<חזקה> הערה: הקפד מעיל כל המכשירים שבאים במגע עם הכלים בטריפסין (למשל פיפטה הקצה, מלקחיים). זה יעזור למנוע הדבקה של כלי דם לציוד.

5. לדמיין את כלי הדם

  1. מניחים ירידה של מים לשקופית נקי. בעזרת פיפטה μl 200 או מלקחיים, להעביר את כלי מתעכלים אל תוך המים. ודא שטוח כלי דם ההר הוא פרש. מתח הפנים של המים מסייע לנפרש רשת כלי דם החברה שקופה. אם הרקמה לא להתפתח, להוסיף מים נוספים ובעדינות לנער את השקופית כדי להקל על התגלגלות.
  2. להסיר את עודפי מים באיטיות רבה על ידי pipetting או בעזרת מגבת נייר.
  3. לאפשר שקופיות להתייבש לחלוטין.
  4. כתם שקופיות באמצעות פרוטוקול מתאים גם עם PAS / hematoxylin או H & E כתם.
    הערה: PAS / hematoxylin שימושי לזיהוי קיר כלי וגרעיני הסלולר; H & E היא שימושית עבור דemonstration של RBC גם כן.
  5. מייבשים ולעלות (Permount הרכבה בינונית).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

התוצר הסופי של הליך מוצלח הוא בעלת הר בכל הרשת של כלי הדם ברשתית העכבר, עם שמרה על האדריכלות, מוכתם גם PAS / hematoxylin או H & E, כפי שמוצג באיורים 2-4. הבחנה ברורה של תאי האנדותל וpericytes ניתן לראות, כפי שמוצגת באיור 3. ברשתית, הגרעינים של תאי האנדותל הם סגלגלים או מוארכים ולשכב לחלוטין בתוך דפנות כלי הדם. גרעיני Pericyte הם קטנים, כדוריים, כתם בצפיפות ובאופן כללי יש לי עמדת תפוח של הנימים לאורך הקיר.

טריפסין עיכול הוא הליך נפוץ לנתח כלי דם הפתולוגיה במודלים של בעלי חיים סוכרתיים. נגעים פתולוגיים דם, כגון microaneurysms, רוחות רפאים pericyte (עדות לאובדן pericyte), נימי acellular וניוון נימים כבר תאר. איור 4 מראה דוגמה של ניוון נימים ראו בעכבר db / db, מודל לסוג השני סוכרת. למרות שההליך היה מותאם לרשתית עכבר, תוצאות דומות גם התקבלו ברשתית חולדה, כפי שמוצגת באיור 5. חשוב לציין כי רשתיות חולדה הן הרבה יותר גדולים, וצלחת 12 גם שימש במקום 24 גם צלחת. רשת כלי הדם של רשתית העכברוש היא גם שבירה פחות עמיתו העכבר.

זה מאוד חיוני כדי להסיר כמה שיותר רקמת כלי הדם שאינו אפשרי. כל שאריות יובילו לצביעה שאינה ספציפית ולהוביל להדמיה ירודה של כלי הדם. איור 6 מייצג דוגמה להסרת לא מוצלחת של הרקמה ללא כלי הדם כולו בשלב 4. כמו כן, חשוב גם שיהיו לי הרשתית להיות פרש כאשר גובר על מנת לשפר את ההדמיה של כלי הדם. איור 7 מייצג כושלת התגלגלות של ההר שטוח וכלי הדם בשלב 5.1.

יור 1 "עבור: תוכן-width =" 5.75in "עבור: src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg "/>
איור 1. . סכמטי של טריפסין תקציר פרוטוקול (1) הכנת רשתית: לבודד את הרשתית מהעין; (2) מים שוטפים: לשטוף במים מסוננים לילה; (3) טריפסין תקציר: דגירה בטריפסין 3% על 37 מעלות צלזיוס למשך 1-1.5 שעות; (4) הפרדת כלי הדם: לבודד את כלי דם דרך סדרה של שטיפות מים ונתיחה תחת מיקרוסקופ; (5) להעביר כלי דם להחליק ולתת יבשים; (6) לדמיין את כלי הדם:. שקופית כתם עם PAS או H & E, ליבש ולהרכיב לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2
איור 2. השליטה dB / מ 'עכבר טריפסין לעכל (H & E, 20x).נתון זה הוא סקירה של רשת כלי הדם ברשתית המציגה ארכיטקטורת כלי דם נורמלית.

איור 3
איור 3. שליטת dB / מ 'עכבר טריפסין לעכל (H & E, 600x). זוהי תצוגה מוגדלת של הרשתית באיור 2 מראה ארכיטקטורת כלי דם נורמלית. תא האנדותל (חץ לבן) וpericyte (חץ שחור) מודגשים.

איור 4
איור 4. סוכרתי db / db עכבר טריפסין לעכל (H & E, 500x). ב -52 שבועות, עכברי db / db מתחילים להתפתח פתולוגיה של כלי דם כגון ניוון נימים (חץ לבן).

איור 5
איור 5. חולדה רגילהרשתית טריפסין לעכל, (PAS, 20x [], 100x [b]). סקירה ותמונה מוגדלת של רשת כלי דם עכברים נורמלית.

איור 6
איור 6. שליטת C57/Bl6 עכבר טריפסין לעכל, רקמות וכלי דם שאינם שלמות (H & E, 20x [], 100x [b]). עם ההסרה ירודה של הרקמות שאינן כלי הדם, יש להדמיה תיפגע ב הלא ספציפית של כלי צביעה.

איור 7
איור 7. השליטה dB / מ 'עכבר טריפסין לעכל, עניי הרכבה (H & E, 20x). אם הרשתית אינה מספקת פרש, יש להדמיה לקויה של רשת כלי הדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

טריפסין עיכול הוא שיטה סטנדרטית על מנת להעריך בכלי הדם של הרשתית. למרבה הצער, זה מאתגר מבחינה טכנית ויכול לגרום לשיעור גבוה של אובדן דגימה אם לא מבוצע כהלכה. יתר על כן, ההליך הוא קשה במיוחד בעכברים, מה שיכול להגביל את היישום של טכניקה זו במודלים של בעלי החיים הגנטיים הנפוצים של מחלות עיניים. מאמר זה מספק הדרכה כיצד לבצע את ההליך בצורה יעילה ועקבי בעיני עכבר.

ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול. ראשית, חשוב כי הרשתית להיות גזור בקפידה, כדי למנוע דמעות גדולות, כדי להבטיח שרשת כלי הדם נשארת שלמה. שנית, שטיפה במים מסוננים רשתית הלילה היא חשובה כמו זה עוזר לשכבות נפרדות neuroretinal מכלי הדם, המאפשר הפרדה קלה יותר לאחר טריפסין לעכל. שינוי אחד שיכול לזרז את התהליך יהיה למקם ברשתית 1% בשלושהטון X-100 מעורב במים מסוננים ל1-2 שעות. לאחר מכן, ניתן לבצע טריפסין לעכל באותו היום, לאחר סדרה של מים שוטף להסיר X. טריטון

חשוב שרקמות הרשתית להיות במעקב כל הזמן במהלך עיכול טריפסין על מנת להימנע מפירוק מכוון של רקמת כלי דם. בהתבסס על הניסיון שלנו, סביב 1-1.5 שעות מספיקות כדי להשיג את העיכול של הרקמה העצבית, תוך שמירה על כלי הדם בשלמותה. פחות זמן נחוץ לעכברים צעירים. טלטול עדין ניתן לבצע במהלך עיכול טריפסין כדי לעזור להקל על הפרדת כלי הדם מהרקמה שנותרה, אבל לא הכרחי. זה חשוב כדי למנוע תסיסה חזקה כמו זה יכול להוביל לקריעה של כלי הדם.

השלבים הקריטיים הדורשים את מרב תשומת הלב כרוך בהפרדת כלי הדם לאחר עיכול טריפסין. בעת ביצוע שטיפות המים, חשוב להימנע מpipetting כלי הדם. Pipetting שלכלי הדם צריך להיות בשימוש רק כשיטת של הפרדת כלי הדם לאחר הקירות היו מצופים בטריפסין. כל המניפולציות צריכים להיעשות בזהירות מתחת למיקרוסקופ לנתיחה כיכולה להינזק הרשת של כלי בקלות. את הטכניקות השונות שתוארו בשלב 4 יכולות לשמש בהצלחה במגוון רחב של שילובים. סופו של דבר, זה יהיה עד לניסוי הבודד כדי למצוא את הגישה שהכי מתאימה להם. חשוב שכל הכלים שבאים במגע עם כלי הדם להיות מצופים עם טריפסין. טבילת הכלים לסירוגין, ולעתים קרובות לטריפסין במהלך ההליך יכולה למנוע הידבקות של הפרעה כלי דם והפוטנציאלית.

היעילות של ההליך תלויה גם במודל עכבר הרקע. רקע עכבר כמה הם לא תורמים לשימור ככולו רשת כלי הדם. לדוגמה, רקע FVB הוא הומוזיגוטים למוטצית phosphodiesterase-6 שהופך אותם נוטים מחדשניוון tinal 17. מניסיוננו, יש לנו מצאנו כי כלי הדם ברשתית שלהם הוא מטבעו יותר שביר, ולא הצליחו לשמור על רשת כלי הדם כולו. לפיכך, חשוב שהרקע להילקח בחשבון לפני שתנסה את הטכניקה הזו.

סופו של דבר, המגבלה העיקרית להליך זה היא כישורי הנתיחה של פרט. חשוב לציין כי גם אם אדם יודע את הטכניקות טובות, זה עלול לקחת כמה ניסיונות לפני שהם מתחילים להשיג תוצאות עקביות. לפיכך, אנו ממליצים כי אנשי המעבדה המעוניינים לבצע כמה ניתוחים בפועל לרכוש את האמון ולהגיע לגישה הטובה ביותר והעקבית ביותר קודם לביצוע ההליך על הרקמה הניסיונית שלהם. חשוב לציין כי, שולט פעם אחת, טריפסין עיכול הוא טכניקה רבת ערך שיכול לשמש כדי להעריך את כלי דם הפתולוגיה (איור 4). ניתן גם לבצע טריפסין עיכול successfully בהשתמר רשתיות שהיו במקבע במשך כמה שנים 1.

לסיכום, טריפסין לעכל ממשיך להיות שיטה מאוד שימושית לניתוח בכלי הדם ברשתית שכן התיאור שלה על ידי קוגן וKuwabara ב -1960. זה מאפשר הדמיה מפורטת של כל רשת כלי הדם, בהשוואה לimmunofluorescence / H & סעיפים מוכתמים E / PAS, שטוח mounts ולצבוע זריקות. למרות שזה קשה מבחינה טכנית, כתב היד הזה מתאר את התהליך בפירוט, כך שהוא יכול להתבצע בהצלחה. כתוצאה מכך, אנו מקווים חוקרי מתחילים לשיטה יהיו הכוונה מספיק כדי לאפשר ניתוח מוצלח ועקבי של כלי הדם ברשתית במודלי הניסויים שלהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי NIH RO1-EY019951 (AAF), חברת אילינוי למניעת עיוורון (מרכז קהילתי יהודי, משרת בחיל אוויר), קרנות בלתי מוגבלות למחלקת עיניים ממחקר למניעת עיוורון (RPB), ניו יורק וRPB הרפואי הסטודנטים המלגה גרנט (JCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin Fischer Scientific SF100-4
Trypsin (1:250) Amresco 0458-50G Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base Sigma T1503-1KG Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA Sigma T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle Millipore SCGPS05RE Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors Fine Science Tools 15024-10 Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox) Dumont #5 11252-20 Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar) Dumont #7 11297-10 Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator Precision Scientific BDG59442 Shaker optional
24-well dish Falcon 353047
Microscope Slides VWR 82027-132

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  2. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
  3. Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
  4. Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
  5. Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
  6. Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
  7. Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
  8. Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
  9. Chapter 30. Diabetic Retinopathy. Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
  10. Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
  11. Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
  12. Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156, (10), 1025-1032 (2000).
  13. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  14. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
  15. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
  16. Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
  17. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  18. The Jackson Laboratory [Internet]. Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).
טריפסין תקציר פרוטוקול לניתוח בכלי הדם של רשתית מודל עכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).More

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter