Summary
トリプシン消化は、網膜血管系を分析するために最も一般的に使用される方法の1つである。本稿では、技術を最適化し、船舶の全体的なアーキテクチャを維持しながら、非血管組織を除去するための重要な変化を含めて詳細に方法を説明します。
Abstract
トリプシン消化は、網膜血管系1-5を分析するための金標準的な方法です。これは、網膜の非血管成分の消化後に相互接続された脈管の二次元の平らなマウントを作成することによって複雑な三次元網膜血管および毛細血管のネットワーク全体の可視化を可能にする。これは、1つは、このような瘤などの様々な病的血管の変化、キャピラリー変性、および周皮細胞の比率に異常な内皮を勉強することができます。しかし、この方法は、原因遺伝子操作の容易6,7の網膜を研究するために最も広く利用できる動物モデルとなってきた、特にマウスでは、技術的に困難である。マウスの眼では、網膜血管の全体的なアーキテクチャを維持しながら、完全に非血管性成分を除去することが特に困難である。現在までに、詳細にトリプシンダイジェスト技術が記載文学の不足があるInのマウス。また困難な手順のトラブルシューティングに関するヒントを提供しながら、本稿では、マウス網膜におけるトリプシン消化物の詳細なステップバイステップの方法論を提供します。
Introduction
網膜の血管系を可視化することは、糖尿病性網膜症などの様々な眼疾患のメカニズムを分析するための極めて重要なアプローチである。それは1つが瘤、毛細血管変性、および周皮細胞損失8,9含めて早い血管の異常を、評価することができます。現在までに、網膜血管構造を分析するために開発されたいくつかの手法がありました。種々の染料の灌流は、血管を強調するために使用されてきたが、すべてが同様の制限を共有している。船舶1を破裂し、損傷リスクが高い圧力で与えられない限り、注射はめったに全体網膜血管構造を強調していません。蛍光色素で標識されたGのB4イソレクチン（; I21413、インビトロジェン、共役アレクサフルーア594 1:100希釈）と血管内皮の免疫染色と網膜のフラットマウントすると、血管の全体的なアーキテクチャを強調するが、毛細血管の詳細な可視化、基底膜と周皮なしですることができます。それはによって指摘されたFriedenwaldその容器はヨウ素酸シッフ（PAS）またはヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色10と網膜のフラットマウントを染色することによって強調することができます。しかし、染色は血管に非特異的であったと同様に、非血管組織を強調し、それが困難な血管を区別すること。 1960年代に、コーガンと桑原は、簡単に網膜1の非血管の成分を消化することによって網膜の血管系を可視化するために作られたトリプシン消化法を開発しました。その時以来、トリプシン消化は、網膜2-5の血管系を分析する中で、金の標準的な方法となっています。しかしながら、脈管構造を分離する他の代替技術が記載されていることに留意することが重要である。浸透圧溶解の使用は脈管構造を分離し、組織11,12の生化学的研究を可能にするために使用されてきたが、手順は、解剖学的研究のための主要な方法として使用されていない。組織プリント方法がされている微小血管系の大きなセグメントを分離するために使用され、血管系13の電気緊張アーキテクチャを研究する能力を可能にします。理論的に、この技術はまた、容器の品質が高いほど、解剖学的変化を研究するために使用することができる。しかし、それだけで血管系ネットワーク全体のセグメントを単離することができる。これらの方法はトリプシン消化を置き換えることはできないが、それは、異なる利点および欠点を持っており、この点で相補的であることに注意することが重要である。
トリプシン消化方法は技術的に困難であり、常に6,7を行うことが困難である。さらに、それは、一欲望網膜6,7の全体的な血管のアーキテクチャを維持する場合は特に、トリプシン消化は、マウスモデルでは特に困難であることが指摘されている。課題は必要とする（1）脈管構造ならびに非血管組織の両方の損失を引き起こす網膜の過剰消化、（2）下の消化を含むにおける血管床の損傷にリードを回すことができる大規模な機械的な解剖、非特異的染色につながる血管系から非血管組織（3）貧しい分離。いくつかの原稿では、これらの課題を強調しているが、どれも彼らに14,15を克服するための詳細かつ一貫性のあるプロトコルを提供していない。本稿では、特に難しい手順の取り扱い上の特定のヒントを、マウスとラットの網膜にトリプシン消化を実行するための手法を詳述し、ステップバイステップの方法論を紹介します。概略図を図1に示されている。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。網膜準備
- マウスの目を摘出。片手を使用して、目が見えるようにまぶたを開く。もう一方の手で、湾曲した鉗子（湾曲した上向き）を使用して、軌道の優れたと劣る面に圧力を適用する地球儀突出まで。ゆっくり目の後部側面に鉗子を閉じ、目を摘出するための連続動作で持ち上げます。
- 中性の10％は、少なくとも24時間緩衝ホルマリンで目を修正。
- 小さなペトリ皿にPBS溶液に置き目。
- 大きな涙を誘発しないように注意しながら、慎重に顕微鏡下で網膜を解剖する。解剖ハサミで角膜の初期カットを作成します。その後、ストレートピンセットでカットエリアを保持しながら、角膜を除去し、角膜と強膜の境界線に沿ってカットするはさみを使用しています。離れて視神経に向かって網膜から強膜と脈絡膜はがし慎重に、細かい曲線状とストレート鉗子を使用。このステップは次のように忍耐を必要とするすぐに網膜を解放すると、涙につながることができます。レンズと網膜16から余分なアイリスやゴミを取り除きます。
2。水洗
- 水で24ウェルディッシュ、カバーに置き網膜（約500μlの、少なくとも45μmのフィルターで濾過）。
- 30分ごとに1時間、少なくとも4〜5回水を変える。
- 室温で穏やかに振盪しながら水に一晩にしておきます。
注： 彼らは血管から神経網膜層を分離手助けとしての洗浄工程が非常に重要です。
3。トリプシン消化
- 水を除去し、37℃で0.1 Mトリス緩衝液（pH 7.8）で3％トリプシン（Difco社製1:250）°ない揺れに優しいとCの溶液中に網膜をインキュベート。組織が崩壊の兆し（約1.5時間）を示す開始したときにトリプシン消化が完了します。
注意： 急激な揺れを避けるこのような血管系を損傷する可能性があります。 - 慎重に、網膜に触れないように顕微鏡を用いて十分に個別にトリプシンをピペット。ステップ4.3で、顕微鏡下で血管を操作するときにこの過剰トリプシンは、後で使用することができます。
4。血管系を分離
- 網膜にろ過された水を追加します。その後、必要に応じて、ハサミを使用して、ピンセットで内境界膜剥離を試みる。 5分間穏やかな攪拌しながら振る。慎重に、網膜の損傷を防ぐために、顕微鏡下で水をピペット。
- 付着網膜組織から血管のフリーネットワークを支援するため、水洗浄します（5分間ずつ）を繰り返します。洗浄した後に水中に残存しないデブリはほとんどがある場合に、水洗浄が完了する。
- 解剖顕微鏡下で慎重な操作は今血管網を解放促進するために必要とされている。以下の配列又はインドールで使用することができるいくつかの有用な技術があるividually技術的な好みに基づいて、所望の結果を達成するために：
- 200μlのピペットを用いて、丁寧に穏やかに撹拌を引き起こし、船で水を吹いて、血管に隣接する水をピペットで上下。
- 200μlのピペットを用いて、ピペットのコートの壁を助けるため上下トリプシンをピペット。その後、よく非血管組織を打破するための一回ダウン血管ネットワーク全体をピペット。
注： 視神経ではなく血管網の端にピペットチップをセンタリングすることも先端に付着血管系を防ぐことができます。 - 優しく非血管コンポーネントを取り除くために水のうち細かい鉗子で血管系を持ち上げます。
- 上記の手順が機能しない場合は、組織を打破し、数分間37℃でインキュベートし網膜にトリプシンを追加します。その後、トリプシンを削除し、手順4.1から4.3を繰り返します。
<強い>注意： トリプシン（例えばピペットチップ、鉗子）で血管と接触するすべての楽器をコーティングすることを確認してください。これは、機器に血管系の付着を防ぐことができます。
5。血管系の可視化
- きれいなスライド上に一滴の水を置きます。 200μlのピペットまたは鉗子を使用して、水の中に消化された血管を転送します。確認し血管フラットマウントが展開されています。 水の表面張力が今透けて見える血管網を展開するのに役立ちます。組織が 展開されない場合は、追加の水を追加して、優しく展開容易にするスライドを横に振る。
- ペーパータオルをピペッティングまたは使用することにより非常にゆっくりと余分な水分を取り除きます。
- スライドが完全に乾燥することができます。
- PAS /ヘマトキシリンまたはH＆E染色のいずれかと、適切なプロトコルを介してスライドを染色する。
注：PAS /ヘマトキシリン、血管壁や細胞核を同定するために有用であり、H＆Eは、Dのために便利ですRBCのemonstration同様。 - 脱水とマウント（パーマウントはメディアをマウント）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
成功した手順の最終製品は、 図2-4に示すようなアーキテクチャは、PAS /ヘマトキシリンまたはH＆Eのどちらかで染色し、維持したまま、マウスの網膜血管系のネットワーク全体のフラットマウントです。 図3に示すように、内皮細胞および周皮細胞の明確な区別が分かる。網膜では、内皮細胞の核は楕円形または細長いあり、血管壁内に完全にうそをつく。周皮細胞核が小さく、球状、密集染色、一般毛細血管壁に沿って盛り上がった位置を持っている。
トリプシン消化は、糖尿病動物モデルで血管病変を分析するための一般的な手順である。このような瘤、周皮細胞幽霊（周皮細胞損失の証拠）、無細胞毛細血管と毛細血管変性などの病的血管病変が記載されている。 図4は、DB / DBマウスで見られるキャピラリー変性、種類のモデルの例を示しています II型糖尿病。手順は、マウスの網膜のために最適化されていたが、図5に示すように、同様の結果はまた、ラットの網膜で得られた。これは、ラットの網膜がはるかに大きく、12ウェルプレート、24ウェルプレートの代わりに使用したことに注意することが重要である。ラット網膜の血管系ネットワークはまた、マウスの対応未満脆いです。
可能な限り、非血管組織のできるだけ多くを除去することは極めて重要である。任意の残党は、非特異的染色および血管系の貧しい人々の視覚化につながるつながる。 図6は、ステップ4の全体の非血管組織の失敗の除去の例を表している。同様に、脈管構造の視覚化を向上させるために実装する際に網膜を展開させる有することも重要である。 図7は、ステップ5.1において血管フラットマウントの展開失敗を表す。
URE 1 "のfo：コンテンツ幅=" 5.75in "FO：srcは=" / "SRC =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg "をfiles/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg />
図1。トリプシン消化プロトコルの概略 （1） 網膜準備：眼から網膜を分離する、（2） 水洗浄を ：一晩ろ過された水で洗って、（3） トリプシンダイジェスト：37で3％トリプシンでインキュベート°〜1.5時間、C; （4） 血管系を分離する：顕微鏡下での水洗浄と解剖の一連を介して血管系を分離する、（5）にスライドさせ、乾燥させるために血管系に移動し、（6） 血管系可視化：PASまたはH＆Eで染色スライドを、脱水し、マウント、ここをクリックしてください大きい数字を表示する 。
図2。制御デシベル/ mのマウストリプシン消化（H＆E、20倍）。この図は、正常な血管のアーキテクチャを示す網膜血管網の概要です。
図3。制御デシベル/ mのマウストリプシン消化（H＆E、600X）。これは正常な血管の構成を示す図2の網膜の拡大図である。内皮細胞（白矢印）と周皮細胞（黒い矢印）が強調表示されます。
図4。糖尿病DB / DBマウストリプシン消化（H＆E、500倍）が52週までに、DB / dbマウスは、このようなキャピラリー変性（白矢印）などの血管病変の開発を始める。
図5。正常ラット網膜トリプシン消化、（PAS、20X [A]、100×[B]）。正常ラット血管網の概要と、拡大画像。
図6。制御C57/BL6マウストリプシン消化、非血管組織無傷（H＆E、20倍[A]、100×[B]）、非血管組織の貧しい除去し、血管の非特異的染色損なう可視化があります。
図7。網膜が適切に展開されていない場合は、血管網の不十分な可視化、 コントロールデシベル/ mのマウストリプシン消化、貧しいマウント（H＆E、20倍）はあります 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
トリプシン消化は、網膜の血管系を評価するための標準的な方法です。残念ながら、それは技術的に困難であると正しく実行されていない場合、試料の損失率の高さになることがあります。また、手順は眼疾患の一般的に使用される遺伝子動物モデルにおいて、この技術の適用を制限することができる、マウスでは特に困難である。本稿では、マウスの目に効果的かつ一貫して手順を実行する方法についてのガイダンスを提供しています。
プロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。まず、網膜は血管網がそのまま残ることを保証するために、任意の大規模な涙を避けるために慎重に切開することが重要です。それはトリプシン消化後に容易に分離を容易に血管からneuroretinal層を別のに役立ちますように第二に、ろ過された水で網膜を洗浄して一晩重要です。プロセスを促進することができる一つの変更は、トライ1％に網膜を配置することであろうトンX-100は、1〜2時間のためにろ過された水に混入。その後、トリプシン消化物を水の一連の後の同じ日にトリトンXを除去するために洗浄を行うことができます
これは、網膜組織が脈管組織の不慮の溶解を回避するために、トリプシン消化の間に常時監視することが重要である。血管系をそのまま維持しながら、我々の経験に基づいて、1〜1.5時間のまわり、神経組織の消化を達成するのに十分である。少ない時間は若いマウスのために必要とされる。穏やかに振盪し、残りの組織から血管の分離を容易にするために、トリプシン消化の間に行われるが、必要ではないことができる。これは血管の断裂につながることができるように、それは強力な撹拌を避けることが重要です。
最も注意が必要な重要なステップは、トリプシン消化した後、血管系を分離することを含む。水洗浄を行う場合には、血管系をピペット回避することが重要である。ピペッティングの脈管構造は、壁はトリプシンで被覆された後に血管系を分離する方法として使用されるべきである。血管網が容易に破損することができるように全ての操作は、解剖顕微鏡下で注意深く行う必要がある。ステップ4で説明した種々の技術は、さまざまな組み合わせで正常に使用することができる。最終的に、それは彼らのために最も適したアプローチを見つけるまで、個々の実験になります。それは、血管と接触するすべてのツールをトリプシンで被覆されることが重要である。手順中にトリプシンに断続的に、しばしばツールを浸漬すると、血管系および潜在的な混乱の付着を防ぐことができます。
手順の有効性はまた、背景のマウスモデルに依存する。いくつかのマウスの背景には、全体の血管系のネットワークを維持するように助長されていませんです。例えば、FVB背景再ためにそれらを起こしやすいことホスホジエステラーゼ-6変異のホモ接合体であるtinal変性17。我々の経験から、我々は彼らの網膜血管構造が本質的に脆弱であることを発見した、と我々は全体の血管系のネットワークを維持することができませんでした。したがって、背景はこの技術を試みる前に考慮されることが重要である。
最終的には、この手順の主な制限は、個々の解剖のスキルです。彼らは一貫した結果を達成するために開始する前に、個々のウェルの技法を知っている場合でも、それはいくつかの試みがかかる可能性があることに注意することが重要である。従って、我々は興味を持って研究室の担当者は自信を得て、彼らの実験的な組織上の手順を実行する前に、最高の、最も一貫性のあるアプローチに到達するために、いくつかの練習の解剖を実行することをお勧めします。一度習得ことに注意することが重要である、トリプシン消化は、血管病変（ 図4）を評価するために使用することができる有益な技術である。トリプシン消化も成功行うことができますcessfully数年間1に対して固定されてきた保存網膜上。
結論としては、トリプシン消化は1960年代にコーガンと桑原によるその説明以来、網膜血管構造を解析するため、非常に有用な方法であり続けている。これは、免疫蛍光/ H＆E / PAS染色切片、フラットマウントおよび色素注射に比べて、全体の血管網の詳細な可視化を可能にします。それは技術的に困難であるが、それが正常に実行できるように、この原稿を詳細に手順を説明します。その結果、我々は、メソッドへの初心者調査官は彼らの実験モデルにおける網膜血管系の成功と一貫性のある分析を可能にするのに十分な指針を持っていることを願っています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、部分的にNIH RO1-EY019951（AAF）、失明予防のためのイリノイ学会（JCC、AAF）、盲目（RPB）を防止するための研究から眼科への無制限の資金、NYとRPB医学生フェローシップグラントによってサポートされていました（JCC）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. , 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- The Jackson Laboratory [Internet]. , Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).
