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Neuroscience

Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

doi: 10.3791/50489 Published: June 13, 2013

Summary

A tripsina é uma compilação dos métodos mais utilizados para analisar a vasculatura retiniana. Este manuscrito descreve o método em detalhes, incluindo alterações importantes para otimizar a técnica e remover o tecido não-vascular, preservando a arquitetura geral dos vasos.

Abstract

Tripsina digest é o método padrão de ouro para analisar a vasculatura retiniana 1-5. Ela permite a visualização de toda a rede de vasos complexas tridimensionais retina sanguíneos e capilares, criando um bidimensional plana de montagem dos canais vasculares interligados após digestão dos componentes não-vasculares da retina. Isto permite estudar várias alterações patológicas vasculares, tais como a degeneração capilar, microaneurismas, e anormal endoteliais rácios pericyte. No entanto, o método é tecnicamente difícil, especialmente em ratos, que se tenham tornado o modelo animal mais amplamente disponíveis para estudar a retina por causa da facilidade de manipulações genéticas 6,7. No olho do rato, é particularmente difícil de remover completamente os componentes não-vasculares, mantendo a arquitectura geral dos vasos sanguíneos da retina. Até o momento, há uma escassez de literatura que descreve a técnica de digestão de tripsina em detalhe in o mouse. Este manuscrito fornece uma metodologia detalhada passo-a-passo da tripsina digest no rato retina, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.

Introduction

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A visualização da vascularização da retina é uma abordagem extremamente importante para dissecar os mecanismos de várias doenças oculares, tais como retinopatia diabética. Ele permite avaliar as anomalias vasculares, incluindo primeiros microaneurismas, degeneração e perda capilar, pericyte 8,9. Até à data, tem havido várias técnicas desenvolvidas para analisar a vascularização da retina. Perfusão de vários corantes foi utilizada para realçar os vasos, mas todos têm partilhado limitações semelhantes. Injeção raramente destaca toda a vascularização da retina, a menos dado a uma pressão elevada, o que corre o risco de se romper e danificar os vasos 1. Imunocoloração do endotélio vascular com fluorophore marcado G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 conjugado; I21413; Invitrogen; 1:100) e monta plano de retina pode-se destacar a arquitetura geral dos vasos, mas sem visualização detalhada dos capilares, membranas basais e pericitos . Foi notada pelosFriedenwald que os navios podem ser destacados pela coloração plana montagens de retina com ácido periódico de Schiff (PAS) ou hematoxilina e eosina (H & E) coloração 10. No entanto, a coloração não foi específico para os vasos e destacada do tecido não-vascular, bem como, o que torna difícil a diferenciação dos vasos. Na década de 1960, Cogan e Kuwabara desenvolveu a técnica digest tripsina que tornou mais fácil a visualização da vascularização da retina através da digestão dos componentes não-vasculares da retina 1. Desde essa altura, a tripsina digest tornou-se o método padrão de ouro na análise da vasculatura da retina 2-5. No entanto, é importante notar que outras técnicas alternativas para isolar a vasculatura tenham sido descritas. A utilização de lise osmótica foi usado para isolar a vasculatura e permitir estudos bioquímicos do tecido 11,12, mas o procedimento não tem sido utilizada como um método primário para estudo anatómicos. O método de impressão de tecidos tem sidousado para isolar grandes segmentos da microvasculatura e permite a possibilidade de estudar a arquitectura electrotonic da vasculatura 13. Em teoria, esta técnica também pode ser usada para estudar alterações anatómicas, como a qualidade dos vasos é elevado. No entanto, só é capaz de isolar segmentos de toda a rede vascular. Embora estes métodos não podem substituir a tripsina digest, é importante notar que eles têm diferentes vantagens e desvantagens e são complementares a este respeito.

O método digest tripsina é tecnicamente desafiador e é difícil de executar de forma consistente 6,7. Além disso, tem sido observado que a tripsina digest é especialmente difícil num modelo de ratinho, especialmente se se deseja preservar a arquitectura global vascular da retina 6,7. Os desafios incluem (1) sobre-digestão da retina que provoca a perda de ambas a vasculatura, bem como do tecido não-vascular, (2) sub-digestão, requerendoextensa dissecção mecânica que poderia levar a danos do leito do navio, (3) separação deficiente do tecido não vascular a partir da vasculatura levando a coloração não específica. Vários manuscritos têm destacado estes desafios, mas nenhum deles forneceu um protocolo detalhado e consistente para superá-los 14,15. Este manuscrito irá introduzir uma metodologia passo a passo detalhando a técnica para realizar a digestão da tripsina no rato e rato retinas com dicas específicas sobre o tratamento das etapas particularmente difíceis. Um esquema geral é mostrado na Figura 1.

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Protocol

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1. Preparação da retina

  1. Enuclear o olho mouse. Usando um lado, abrir as pálpebras para que o olho é visível. Com a outra mão, usando uma pinça curva (curvas virada para cima), aplicar pressão sobre aspectos superior e inferior da órbita até que se projeta globo. Com cuidado, feche fórceps no aspecto posterior do olho e levante em um movimento contínuo para enuclear o olho.
  2. Corrigir olhos com 10% de formalina tamponada neutra por pelo menos 24 horas.
  3. Lugar olho em solução PBS em uma pequena placa de Petri.
  4. Dissecar retina cuidadosamente sob um microscópio, tendo o cuidado de evitar induzir grandes lágrimas. Faça um corte inicial na córnea com uma tesoura de dissecção. Em seguida, mantendo a área de corte com uma pinça reta, use uma tesoura para cortar ao longo da fronteira da córnea e esclera remoção da córnea. Usando pinça fina curvas e retas, cuidadosamente descascar a esclera e coróide longe da retina para o nervo óptico. Esta etapa exige paciência,libertando rapidamente a retina pode levar às lágrimas. Remover a lente e qualquer excesso de detritos da íris e a retina 16.

2. A água lava

  1. Ponto retina num prato de 24 cavidades e cobrir com água (aproximadamente 500 mL, filtrado com pelo menos um filtro de 45 mm).
  2. Troque a água a cada 30 min-1 hora, pelo menos 4-5 vezes.
  3. Deixe durante a noite em água com agitação suave à temperatura ambiente.

Nota: Os passos de lavagem são muito importantes, pois ajudam a separar as camadas da retina neural a partir dos vasos sanguíneos.

3. Tripsina Digest

  1. Remover a água e retina incubar numa solução de 3% de tripsina (Difco 1:250) em tampão Tris 0,1 M (pH 7,8) a 37 ° C com agitação suave para não. Tripsina digestão é completado quando o tecido começa a exibir sinais de desintegração (aproximadamente 1,5 horas).
    Nota: Evite agitação rápidapois isso pode danificar a vasculatura.
  2. Cuidadosamente, pipetar a tripsina em separado bem usando um microscópio para evitar tocar a retina. Este excesso de tripsina pode ser usado mais tarde, quando manipular os navios sob o microscópio, no passo 4.3.

4. Separar a vasculatura

  1. Adicionar água filtrada para a retina. Em seguida, tentar descolar a membrana limitante interna com uma pinça, usando uma tesoura, se necessário. Agite com agitação suave durante 5 min. Cuidadosamente, pipeta a água sob o microscópio para evitar danificar a retina.
  2. Repita lavagens com água (por 5 min cada) para ajudar a libertar a rede de vasos do tecido da retina aderente. Lavagens de água são completados quando existe pouca ou nenhuma detritos remanescentes na água após a lavagem.
  3. Manipulações cuidadosas sob um microscópio de dissecação são agora necessários para liberar ainda mais a rede de vasos. Estes são várias técnicas úteis, que podem ser usados ​​em sequência ou individually para atingir o resultado desejado com base na preferência do técnico:
    1. Usando uma pipeta de 200 mL, pipetar cuidadosamente água para cima e para baixo ao lado de vasos, soprando água em vasos, causando agitação suave.
    2. Usando uma pipeta de 200 mL, pipeta a tripsina cima e para baixo para ajudar paredes casaco da pipeta. Então, com cuidado pipeta toda a rede de vasos cima e para baixo uma vez para ajudar a quebrar tecido não vascular.
      Nota: centragem da ponta da pipeta no nervo óptico, em vez de as bordas da rede vascular pode também prevenir a vascularização de furar a ponta.
    3. Levante cuidadosamente vasculatura com uma pinça fina de água para desalojar os componentes não-vasculares.
    4. Se as etapas acima não funcionarem, adicione tripsina para a retina para ajudar a quebrar o tecido, e incubar a 37 ° C por alguns minutos. Em seguida, retire de tripsina e repita os passos de 4,1-4,3.

<strong> Nota: Certifique-se de casaco de todos os instrumentos que entrarão em contato com os vasos em tripsina (por exemplo, a ponta da pipeta, fórceps). Isto irá ajudar a evitar a adesão da vasculatura para o equipamento.

5. Visualizando a vasculatura

  1. Colocar uma gota de água sobre uma lâmina de limpeza. Usando uma pipeta ou uma pinça 200 ul, transferir os vasos digeridos na água. Verifique se o plano de montagem vascular é desdobrada. A tensão superficial da água ajuda a desdobrar a rede vascular agora diáfano. Se o tecido não se desdobra, adicione mais água e agitar suavemente a lâmina para facilitar desdobramento.
  2. Retire o excesso de água muito lentamente por pipetagem ou usando uma toalha de papel.
  3. Deixar as lâminas para secar completamente.
  4. Mancha lâminas via protocolo apropriado tanto com PAS / Hematoxilina ou H & E mancha.
    Nota: PAS / hematoxilina é útil para a identificação da parede do vaso e núcleos celulares, H & E é útil para o demonstration de RBC bem.
  5. Desidratar e montar (Permount meio de montagem).

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Representative Results

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O produto final de um processo bem sucedido é um plano de montagem de toda a rede da vasculatura da retina do rato, com a arquitectura mantida, coradas quer com PAS / hematoxilina ou H & E, tal como mostrado nas Figuras 2-4. Limpar a diferenciação das células endoteliais e pericitos pode ser visto como mostrado na Figura 3. Na retina, os núcleos das células endoteliais são ovais ou alongadas e ficar inteiramente dentro da parede do vaso. Pericyte núcleos são pequenos, esférico, mancha densamente e, geralmente, tem uma posição saliente, ao longo da parede capilar.

Tripsina digest é um procedimento comum para analisar a patologia vascular em modelos animais diabéticos. As lesões vasculares patológicas tais como microaneurismas, fantasmas pericyte (evidência de perda pericyte), capilares acelular e degeneração capilar têm sido descritos. Figura 4 mostra um exemplo de degeneração capilar visto numa db / db rato, um modelo de tipo II diabetes. Embora o processo foi optimizado para rato retinas, resultados similares foram também obtidos em retinas de ratos, conforme mostrado na Figura 5. É importante notar que as retinas de ratos são muito maiores, e uma placa de 12 poços foi utilizada em vez de uma placa de 24 poços. A rede vascular da retina de rato também é menos frágil do que a contrapartida do rato.

É extremamente importante para remover o máximo de tecido não vascular possível. Quaisquer restos conduzirá a coloração não específica e reduzir a visualização da vascularização. Figura 6 representa um exemplo de remoção de vencida o tecido não-vascular completo no passo 4. Da mesma forma, é também importante ter a retina ser desdobrada quando da montagem, de modo a melhorar a visualização da vascularização. Figura 7 representa vencida desdobramento do plano de montagem vascular no passo 5.1.

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Figura 1. . Esquemático de Tripsina Digest protocolo (1) Preparação da retina: isolar retina do olho, (2) A água lava: Lavar em água filtrada durante a noite, (3) Tripsina Digest: Incubar em 3% de tripsina, a 37 ° C durante 1-1,5 horas; (4) A separação da vasculatura: isolar vasculatura via série de lavagens com água e dissecção sob microscópio; (5) Mova vasculatura para deslizar e deixe secar; (6) Visualizando a vasculatura:. slides mancha com PAS ou H & E, desidratar e montar Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2
Figura 2. Controle db / m rato tripsina digest (H & E, 20x).Esta figura é uma visão geral da rede vascular da retina mostrando a arquitetura vascular normal.

Figura 3
Figura 3. Controle db / m rato tripsina digest (H & E, 600x). Esta é uma visão ampliada da retina na Figura 2 que mostra a arquitetura vascular normal. Células endoteliais (seta branca) e pericyte (seta preta) são destaque.

Figura 4
Figura 4. Diabetic db / db rato tripsina digest (H & E, 500x). Por 52 semanas, camundongos db / db começar a desenvolver a patologia vascular como a degeneração capilar (seta branca).

Figura 5
Figura 5. Rato normalretina tripsina digest, (PAS, 20x [a], 100x [b]). Uma visão geral e imagem ampliada de uma rede vascular rato normal.

Figura 6
Figura 6. Controlo C57/BL6 rato digest de tripsina, o tecido não vascular intacta (H & E, 20x [a], 100x [b]). Pobre Com a remoção do tecido não-vascular, existem coloração visualização prejudicando não específica dos vasos.

Figura 7
Figura 7. Controle db / m rato tripsina digest, montagem pobres (H & E, 20x). Se a retina não é desdobrado de forma adequada, não há visualização inadequada da rede vascular.

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Discussion

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Tripsina digest é um método padrão para avaliar a vasculatura da retina. Infelizmente, não é tecnicamente difícil e pode resultar numa elevada taxa de perda de amostra se não for realizado correctamente. Além disso, o procedimento é especialmente difícil, em ratos, o que pode limitar a aplicação desta técnica, os modelos animais genéticos usados ​​de doenças oculares. Este documento fornece orientação sobre como realizar o procedimento de forma eficaz e consistente no rato olhos.

Existem várias etapas críticas do protocolo. Em primeiro lugar, é essencial que a retina ser dissecados cuidadosamente para evitar quaisquer grandes rasgos, para assegurar que a rede vascular permanece intacta. Em segundo lugar, a lavagem da retina em água filtrada durante a noite é importante porque ajuda a separar as camadas neurorretiniana dos vasos sanguíneos, o que facilita uma separação mais fácil após digestão com tripsina. Uma modificação que pode acelerar o processo seria a de colocar a retina em 1% de triton X-100 misturado na água filtrada durante 1-2 horas. Em seguida, a tripsina digest pode ser realizada no mesmo dia depois de uma série de lavagens de água para remover o Triton X.

É importante que os tecidos da retina ser monitorizada constantemente durante a digestão com tripsina, a fim de evitar a dissolução inadvertido do tecido vascular. Com base na nossa experiência, cerca de 1-1,5 horas é suficiente para realizar a digestão do tecido neural, preservando ao mesmo tempo a vasculatura intacta. Menos tempo é necessário para os ratos mais jovens. Agitação suave pode ser realizada durante a digestão com tripsina de modo a facilitar a separação dos vasos sanguíneos a partir do tecido restante, mas não é necessário. É importante evitar a forte agitação, como esta pode levar à ruptura dos vasos.

Os passos críticos que exigem mais atenção implicar a separação da vasculatura, após digestão com tripsina. Ao realizar as lavagens com água, é importante para evitar a pipetagem da vasculatura. A pipetagem dasa vasculatura só deve ser usada como um método de separação da vasculatura, após as paredes foram revestidas com tripsina. Todas as manipulações devem ser feito cuidadosamente sob o microscópio de dissecação como a rede de vasos pode ser facilmente danificada. As diferentes técnicas descritas no passo 4 pode ser utilizada com sucesso numa variedade de combinações. Em última instância, caberá ao experimentador indivíduo para encontrar o método que funciona melhor para eles. É importante que todas as ferramentas que entrem em contacto com os vasos sanguíneos ser revestidos com tripsina. Mergulhando as ferramentas de forma intermitente e, muitas vezes em tripsina durante o procedimento pode evitar a aderência de ruptura vascular e potencial.

A eficácia do processo é também dependente do modelo do rato do fundo. Alguns fundos de mouse não é tão propício para a preservação de toda a rede vascular. Por exemplo, o fundo FVB é homozigótica para uma fosfodiesterase-6 mutação tornando-os propensos a redegeneração Tinal 17. Pela nossa experiência, descobrimos que sua vascularização da retina é inerentemente mais frágil, e não fomos capazes de preservar toda a rede vascular. Assim, é importante que o fundo ser tomado em consideração, antes de tentar essa técnica.

Em última análise, a principal limitação deste procedimento é habilidades de dissecação de um indivíduo. É importante notar que mesmo que um indivíduo conhece bem as técnicas, que podem ser necessárias várias tentativas antes que comecem a obtenção de resultados consistentes. Assim, recomendamos que o pessoal de laboratório interessados ​​realizar várias dissecações práticas para ganhar confiança e chegar à melhor e mais consistente abordagem antes de realizar o procedimento em seu tecido experimental. É importante notar que, uma vez que domina, digest de tripsina é uma técnica valiosa que pode ser utilizada para avaliar a patologia vascular (Figura 4). Tripsina digest também pode ser realizada successfully em preservada retinas que estiveram no fixador durante vários anos um.

Em conclusão, a tripsina digest continua a ser um método extremamente útil para analisar a vascularização da retina desde sua descrição por Cogan e Kuwabara na década de 1960. Ele permite a visualização detalhada da rede vascular inteiro, em comparação com a imunofluorescência / H & E / PAS coradas, flat-montagens e corante injeções. Embora seja tecnicamente difícil, este manuscrito descreve em detalhe o procedimento de modo que possa ser realizada com sucesso. Como resultado, esperamos investigadores inexperientes com o método terá uma orientação suficiente para permitir uma análise bem sucedida e consistente da vasculatura retiniana em seus modelos experimentais.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Sociedade para a Prevenção da Cegueira (JCC, AAF), fundos irrestrito ao Departamento de Oftalmologia da investigação para prevenir a cegueira (RPB), NY e RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin Fischer Scientific SF100-4
Trypsin (1:250) Amresco 0458-50G Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base Sigma T1503-1KG Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA Sigma T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle Millipore SCGPS05RE Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors Fine Science Tools 15024-10 Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox) Dumont #5 11252-20 Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar) Dumont #7 11297-10 Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator Precision Scientific BDG59442 Shaker optional
24-well dish Falcon 353047
Microscope Slides VWR 82027-132

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References

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Cite this Article

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).More

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).

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