Summary
A tripsina é uma compilação dos métodos mais utilizados para analisar a vasculatura retiniana. Este manuscrito descreve o método em detalhes, incluindo alterações importantes para otimizar a técnica e remover o tecido não-vascular, preservando a arquitetura geral dos vasos.
Abstract
Tripsina digest é o método padrão de ouro para analisar a vasculatura retiniana 1-5. Ela permite a visualização de toda a rede de vasos complexas tridimensionais retina sanguíneos e capilares, criando um bidimensional plana de montagem dos canais vasculares interligados após digestão dos componentes não-vasculares da retina. Isto permite estudar várias alterações patológicas vasculares, tais como a degeneração capilar, microaneurismas, e anormal endoteliais rácios pericyte. No entanto, o método é tecnicamente difícil, especialmente em ratos, que se tenham tornado o modelo animal mais amplamente disponíveis para estudar a retina por causa da facilidade de manipulações genéticas 6,7. No olho do rato, é particularmente difícil de remover completamente os componentes não-vasculares, mantendo a arquitectura geral dos vasos sanguíneos da retina. Até o momento, há uma escassez de literatura que descreve a técnica de digestão de tripsina em detalhe in o mouse. Este manuscrito fornece uma metodologia detalhada passo-a-passo da tripsina digest no rato retina, além de fornecer dicas sobre solução de problemas etapas difíceis.
Introduction
A visualização da vascularização da retina é uma abordagem extremamente importante para dissecar os mecanismos de várias doenças oculares, tais como retinopatia diabética. Ele permite avaliar as anomalias vasculares, incluindo primeiros microaneurismas, degeneração e perda capilar, pericyte 8,9. Até à data, tem havido várias técnicas desenvolvidas para analisar a vascularização da retina. Perfusão de vários corantes foi utilizada para realçar os vasos, mas todos têm partilhado limitações semelhantes. Injeção raramente destaca toda a vascularização da retina, a menos dado a uma pressão elevada, o que corre o risco de se romper e danificar os vasos 1. Imunocoloração do endotélio vascular com fluorophore marcado G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 conjugado; I21413; Invitrogen; 1:100) e monta plano de retina pode-se destacar a arquitetura geral dos vasos, mas sem visualização detalhada dos capilares, membranas basais e pericitos . Foi notada pelosFriedenwald que os navios podem ser destacados pela coloração plana montagens de retina com ácido periódico de Schiff (PAS) ou hematoxilina e eosina (H & E) coloração 10. No entanto, a coloração não foi específico para os vasos e destacada do tecido não-vascular, bem como, o que torna difícil a diferenciação dos vasos. Na década de 1960, Cogan e Kuwabara desenvolveu a técnica digest tripsina que tornou mais fácil a visualização da vascularização da retina através da digestão dos componentes não-vasculares da retina 1. Desde essa altura, a tripsina digest tornou-se o método padrão de ouro na análise da vasculatura da retina 2-5. No entanto, é importante notar que outras técnicas alternativas para isolar a vasculatura tenham sido descritas. A utilização de lise osmótica foi usado para isolar a vasculatura e permitir estudos bioquímicos do tecido 11,12, mas o procedimento não tem sido utilizada como um método primário para estudo anatómicos. O método de impressão de tecidos tem sidousado para isolar grandes segmentos da microvasculatura e permite a possibilidade de estudar a arquitectura electrotonic da vasculatura 13. Em teoria, esta técnica também pode ser usada para estudar alterações anatómicas, como a qualidade dos vasos é elevado. No entanto, só é capaz de isolar segmentos de toda a rede vascular. Embora estes métodos não podem substituir a tripsina digest, é importante notar que eles têm diferentes vantagens e desvantagens e são complementares a este respeito.
O método digest tripsina é tecnicamente desafiador e é difícil de executar de forma consistente 6,7. Além disso, tem sido observado que a tripsina digest é especialmente difícil num modelo de ratinho, especialmente se se deseja preservar a arquitectura global vascular da retina 6,7. Os desafios incluem (1) sobre-digestão da retina que provoca a perda de ambas a vasculatura, bem como do tecido não-vascular, (2) sub-digestão, requerendoextensa dissecção mecânica que poderia levar a danos do leito do navio, (3) separação deficiente do tecido não vascular a partir da vasculatura levando a coloração não específica. Vários manuscritos têm destacado estes desafios, mas nenhum deles forneceu um protocolo detalhado e consistente para superá-los 14,15. Este manuscrito irá introduzir uma metodologia passo a passo detalhando a técnica para realizar a digestão da tripsina no rato e rato retinas com dicas específicas sobre o tratamento das etapas particularmente difíceis. Um esquema geral é mostrado na Figura 1.
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Protocol
1. Preparação da retina
- Enuclear o olho mouse. Usando um lado, abrir as pálpebras para que o olho é visível. Com a outra mão, usando uma pinça curva (curvas virada para cima), aplicar pressão sobre aspectos superior e inferior da órbita até que se projeta globo. Com cuidado, feche fórceps no aspecto posterior do olho e levante em um movimento contínuo para enuclear o olho.
- Corrigir olhos com 10% de formalina tamponada neutra por pelo menos 24 horas.
- Lugar olho em solução PBS em uma pequena placa de Petri.
- Dissecar retina cuidadosamente sob um microscópio, tendo o cuidado de evitar induzir grandes lágrimas. Faça um corte inicial na córnea com uma tesoura de dissecção. Em seguida, mantendo a área de corte com uma pinça reta, use uma tesoura para cortar ao longo da fronteira da córnea e esclera remoção da córnea. Usando pinça fina curvas e retas, cuidadosamente descascar a esclera e coróide longe da retina para o nervo óptico. Esta etapa exige paciência,libertando rapidamente a retina pode levar às lágrimas. Remover a lente e qualquer excesso de detritos da íris e a retina 16.
2. A água lava
- Ponto retina num prato de 24 cavidades e cobrir com água (aproximadamente 500 mL, filtrado com pelo menos um filtro de 45 mm).
- Troque a água a cada 30 min-1 hora, pelo menos 4-5 vezes.
- Deixe durante a noite em água com agitação suave à temperatura ambiente.
Nota: Os passos de lavagem são muito importantes, pois ajudam a separar as camadas da retina neural a partir dos vasos sanguíneos.
3. Tripsina Digest
- Remover a água e retina incubar numa solução de 3% de tripsina (Difco 1:250) em tampão Tris 0,1 M (pH 7,8) a 37 ° C com agitação suave para não. Tripsina digestão é completado quando o tecido começa a exibir sinais de desintegração (aproximadamente 1,5 horas).
Nota: Evite agitação rápidapois isso pode danificar a vasculatura. - Cuidadosamente, pipetar a tripsina em separado bem usando um microscópio para evitar tocar a retina. Este excesso de tripsina pode ser usado mais tarde, quando manipular os navios sob o microscópio, no passo 4.3.
4. Separar a vasculatura
- Adicionar água filtrada para a retina. Em seguida, tentar descolar a membrana limitante interna com uma pinça, usando uma tesoura, se necessário. Agite com agitação suave durante 5 min. Cuidadosamente, pipeta a água sob o microscópio para evitar danificar a retina.
- Repita lavagens com água (por 5 min cada) para ajudar a libertar a rede de vasos do tecido da retina aderente. Lavagens de água são completados quando existe pouca ou nenhuma detritos remanescentes na água após a lavagem.
- Manipulações cuidadosas sob um microscópio de dissecação são agora necessários para liberar ainda mais a rede de vasos. Estes são várias técnicas úteis, que podem ser usados em sequência ou individually para atingir o resultado desejado com base na preferência do técnico:
- Usando uma pipeta de 200 mL, pipetar cuidadosamente água para cima e para baixo ao lado de vasos, soprando água em vasos, causando agitação suave.
- Usando uma pipeta de 200 mL, pipeta a tripsina cima e para baixo para ajudar paredes casaco da pipeta. Então, com cuidado pipeta toda a rede de vasos cima e para baixo uma vez para ajudar a quebrar tecido não vascular.
Nota: centragem da ponta da pipeta no nervo óptico, em vez de as bordas da rede vascular pode também prevenir a vascularização de furar a ponta. - Levante cuidadosamente vasculatura com uma pinça fina de água para desalojar os componentes não-vasculares.
- Se as etapas acima não funcionarem, adicione tripsina para a retina para ajudar a quebrar o tecido, e incubar a 37 ° C por alguns minutos. Em seguida, retire de tripsina e repita os passos de 4,1-4,3.
<strong> Nota: Certifique-se de casaco de todos os instrumentos que entrarão em contato com os vasos em tripsina (por exemplo, a ponta da pipeta, fórceps). Isto irá ajudar a evitar a adesão da vasculatura para o equipamento.
5. Visualizando a vasculatura
- Colocar uma gota de água sobre uma lâmina de limpeza. Usando uma pipeta ou uma pinça 200 ul, transferir os vasos digeridos na água. Verifique se o plano de montagem vascular é desdobrada. A tensão superficial da água ajuda a desdobrar a rede vascular agora diáfano. Se o tecido não se desdobra, adicione mais água e agitar suavemente a lâmina para facilitar desdobramento.
- Retire o excesso de água muito lentamente por pipetagem ou usando uma toalha de papel.
- Deixar as lâminas para secar completamente.
- Mancha lâminas via protocolo apropriado tanto com PAS / Hematoxilina ou H & E mancha.
Nota: PAS / hematoxilina é útil para a identificação da parede do vaso e núcleos celulares, H & E é útil para o demonstration de RBC bem. - Desidratar e montar (Permount meio de montagem).
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Representative Results
O produto final de um processo bem sucedido é um plano de montagem de toda a rede da vasculatura da retina do rato, com a arquitectura mantida, coradas quer com PAS / hematoxilina ou H & E, tal como mostrado nas Figuras 2-4. Limpar a diferenciação das células endoteliais e pericitos pode ser visto como mostrado na Figura 3. Na retina, os núcleos das células endoteliais são ovais ou alongadas e ficar inteiramente dentro da parede do vaso. Pericyte núcleos são pequenos, esférico, mancha densamente e, geralmente, tem uma posição saliente, ao longo da parede capilar.
Tripsina digest é um procedimento comum para analisar a patologia vascular em modelos animais diabéticos. As lesões vasculares patológicas tais como microaneurismas, fantasmas pericyte (evidência de perda pericyte), capilares acelular e degeneração capilar têm sido descritos. Figura 4 mostra um exemplo de degeneração capilar visto numa db / db rato, um modelo de tipo II diabetes. Embora o processo foi optimizado para rato retinas, resultados similares foram também obtidos em retinas de ratos, conforme mostrado na Figura 5. É importante notar que as retinas de ratos são muito maiores, e uma placa de 12 poços foi utilizada em vez de uma placa de 24 poços. A rede vascular da retina de rato também é menos frágil do que a contrapartida do rato.
É extremamente importante para remover o máximo de tecido não vascular possível. Quaisquer restos conduzirá a coloração não específica e reduzir a visualização da vascularização. Figura 6 representa um exemplo de remoção de vencida o tecido não-vascular completo no passo 4. Da mesma forma, é também importante ter a retina ser desdobrada quando da montagem, de modo a melhorar a visualização da vascularização. Figura 7 representa vencida desdobramento do plano de montagem vascular no passo 5.1.
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Figura 1. . Esquemático de Tripsina Digest protocolo (1) Preparação da retina: isolar retina do olho, (2) A água lava: Lavar em água filtrada durante a noite, (3) Tripsina Digest: Incubar em 3% de tripsina, a 37 ° C durante 1-1,5 horas; (4) A separação da vasculatura: isolar vasculatura via série de lavagens com água e dissecção sob microscópio; (5) Mova vasculatura para deslizar e deixe secar; (6) Visualizando a vasculatura:. slides mancha com PAS ou H & E, desidratar e montar Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Controle db / m rato tripsina digest (H & E, 20x).Esta figura é uma visão geral da rede vascular da retina mostrando a arquitetura vascular normal.
Figura 3. Controle db / m rato tripsina digest (H & E, 600x). Esta é uma visão ampliada da retina na Figura 2 que mostra a arquitetura vascular normal. Células endoteliais (seta branca) e pericyte (seta preta) são destaque.
Figura 4. Diabetic db / db rato tripsina digest (H & E, 500x). Por 52 semanas, camundongos db / db começar a desenvolver a patologia vascular como a degeneração capilar (seta branca).
Figura 5. Rato normalretina tripsina digest, (PAS, 20x [a], 100x [b]). Uma visão geral e imagem ampliada de uma rede vascular rato normal.
Figura 6. Controlo C57/BL6 rato digest de tripsina, o tecido não vascular intacta (H & E, 20x [a], 100x [b]). Pobre Com a remoção do tecido não-vascular, existem coloração visualização prejudicando não específica dos vasos.
Figura 7. Controle db / m rato tripsina digest, montagem pobres (H & E, 20x). Se a retina não é desdobrado de forma adequada, não há visualização inadequada da rede vascular.
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Discussion
Tripsina digest é um método padrão para avaliar a vasculatura da retina. Infelizmente, não é tecnicamente difícil e pode resultar numa elevada taxa de perda de amostra se não for realizado correctamente. Além disso, o procedimento é especialmente difícil, em ratos, o que pode limitar a aplicação desta técnica, os modelos animais genéticos usados de doenças oculares. Este documento fornece orientação sobre como realizar o procedimento de forma eficaz e consistente no rato olhos.
Existem várias etapas críticas do protocolo. Em primeiro lugar, é essencial que a retina ser dissecados cuidadosamente para evitar quaisquer grandes rasgos, para assegurar que a rede vascular permanece intacta. Em segundo lugar, a lavagem da retina em água filtrada durante a noite é importante porque ajuda a separar as camadas neurorretiniana dos vasos sanguíneos, o que facilita uma separação mais fácil após digestão com tripsina. Uma modificação que pode acelerar o processo seria a de colocar a retina em 1% de triton X-100 misturado na água filtrada durante 1-2 horas. Em seguida, a tripsina digest pode ser realizada no mesmo dia depois de uma série de lavagens de água para remover o Triton X.
É importante que os tecidos da retina ser monitorizada constantemente durante a digestão com tripsina, a fim de evitar a dissolução inadvertido do tecido vascular. Com base na nossa experiência, cerca de 1-1,5 horas é suficiente para realizar a digestão do tecido neural, preservando ao mesmo tempo a vasculatura intacta. Menos tempo é necessário para os ratos mais jovens. Agitação suave pode ser realizada durante a digestão com tripsina de modo a facilitar a separação dos vasos sanguíneos a partir do tecido restante, mas não é necessário. É importante evitar a forte agitação, como esta pode levar à ruptura dos vasos.
Os passos críticos que exigem mais atenção implicar a separação da vasculatura, após digestão com tripsina. Ao realizar as lavagens com água, é importante para evitar a pipetagem da vasculatura. A pipetagem dasa vasculatura só deve ser usada como um método de separação da vasculatura, após as paredes foram revestidas com tripsina. Todas as manipulações devem ser feito cuidadosamente sob o microscópio de dissecação como a rede de vasos pode ser facilmente danificada. As diferentes técnicas descritas no passo 4 pode ser utilizada com sucesso numa variedade de combinações. Em última instância, caberá ao experimentador indivíduo para encontrar o método que funciona melhor para eles. É importante que todas as ferramentas que entrem em contacto com os vasos sanguíneos ser revestidos com tripsina. Mergulhando as ferramentas de forma intermitente e, muitas vezes em tripsina durante o procedimento pode evitar a aderência de ruptura vascular e potencial.
A eficácia do processo é também dependente do modelo do rato do fundo. Alguns fundos de mouse não é tão propício para a preservação de toda a rede vascular. Por exemplo, o fundo FVB é homozigótica para uma fosfodiesterase-6 mutação tornando-os propensos a redegeneração Tinal 17. Pela nossa experiência, descobrimos que sua vascularização da retina é inerentemente mais frágil, e não fomos capazes de preservar toda a rede vascular. Assim, é importante que o fundo ser tomado em consideração, antes de tentar essa técnica.
Em última análise, a principal limitação deste procedimento é habilidades de dissecação de um indivíduo. É importante notar que mesmo que um indivíduo conhece bem as técnicas, que podem ser necessárias várias tentativas antes que comecem a obtenção de resultados consistentes. Assim, recomendamos que o pessoal de laboratório interessados realizar várias dissecações práticas para ganhar confiança e chegar à melhor e mais consistente abordagem antes de realizar o procedimento em seu tecido experimental. É importante notar que, uma vez que domina, digest de tripsina é uma técnica valiosa que pode ser utilizada para avaliar a patologia vascular (Figura 4). Tripsina digest também pode ser realizada successfully em preservada retinas que estiveram no fixador durante vários anos um.
Em conclusão, a tripsina digest continua a ser um método extremamente útil para analisar a vascularização da retina desde sua descrição por Cogan e Kuwabara na década de 1960. Ele permite a visualização detalhada da rede vascular inteiro, em comparação com a imunofluorescência / H & E / PAS coradas, flat-montagens e corante injeções. Embora seja tecnicamente difícil, este manuscrito descreve em detalhe o procedimento de modo que possa ser realizada com sucesso. Como resultado, esperamos investigadores inexperientes com o método terá uma orientação suficiente para permitir uma análise bem sucedida e consistente da vasculatura retiniana em seus modelos experimentais.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi parcialmente financiado pelo NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Sociedade para a Prevenção da Cegueira (JCC, AAF), fundos irrestrito ao Departamento de Oftalmologia da investigação para prevenir a cegueira (RPB), NY e RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 | |
References
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