Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Trypsin Digest protokollet för att analysera den Retinal kärlsystemet av en musmodell

doi: 10.3791/50489 Published: June 13, 2013

Summary

Trypsin digest är en av de vanligaste metoderna för att analysera retinal kärlsystem. Detta manuskript beskriver metoden i detalj, inklusive viktiga förändringar för att optimera tekniken och ta bort icke-vaskulär vävnad samtidigt som den övergripande arkitekturen av fartygen.

Abstract

Trypsin Digest är guldmyntfoten metod för att analysera näthinnan kärlsystemet 1-5. Det möjliggör visualisering av hela nätverk av komplexa tredimensionella retinala blodkärl och kapillärer genom att skapa en tvådimensionell platt-mount av sammanlänkade vaskulära kanalerna efter rötning av icke-vaskulära komponenter i näthinnan. Detta gör att man kan studera olika patologiska kärlförändringar, såsom microaneurysms, kapillär degeneration och onormal endotelceller att pericyter förhållanden. Emellertid är metoden tekniskt utmanande, särskilt i möss, som har blivit den mest tillgängliga djurmodell för att studera näthinnan på grund av den enkla genetiska manipulationer 6,7. I musen ögat, är det särskilt svårt att helt ta bort de icke-vaskulära komponenter samtidigt som det övergripande arkitekturen av näthinnans blodkärl. Hittills finns det en brist på litteratur som beskriver trypsin smälta tekniken i detalj in musen. Detta manuskript ger en detaljerad steg-för-steg metod för trypsin smälta i mus näthinnan, och samtidigt ge tips om felsökning svåra steg.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Visualisering vaskulaturen av näthinnan är en mycket viktig metod för att dissekera av mekanismen av olika ögonsjukdomar, såsom diabetisk retinopati. Det gör att man kan bedöma de tidigaste kärlmissbildningar, inklusive microaneurysms, kapillär degeneration och pericyter förlust 8,9. Hittills har det funnits flera tekniker utvecklats för att analysera retinal kärlsystemet. Perfusion av olika färgämnen har använts för att belysa de fartyg, men alla har delat liknande begränsningar. Injektion belyser sällan hela retinal kärlsystemet inte ges vid ett högt tryck, vilket riskerar att spricka och skada fartyg 1. Immunfärgning av vaskulär endotel med fluorofor-märkta G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 konjugerat, I21413, Invitrogen, 1:100 utspädning) och retinal platta fästen kan belysa den övergripande arkitekturen av fartygen, men utan detaljerad visualisering av kapillärer, basalmembran och pericyter . Det noterades avFriedenwald att fartygen kan belysas genom färgning platt-fästen av näthinnan med periodisk syra-Schiff (PAS) eller hematoxylin och eosin (H & E) färgning 10. Dock var färgning ospecifik för fartygen och betonade icke-vaskulär vävnad också, vilket gör det svårt att skilja fartygen. Under 1960-talet utvecklades Cogan och Kuwabara trypsinet digest teknik som gjorde det lättare att visualisera näthinnan kärlsystemet genom uppslutning av nonvascular komponenterna i näthinnan 1. Sedan dess har trypsin smälta blivit guldmyntfoten metoden att analysera kärlsystemet av näthinnan 2-5. Det är dock viktigt att notera att andra alternativa tekniker för att isolera vaskulaturen har beskrivits. Användningen av osmotisk lys har använts för att isolera vaskulaturen och tillåta biokemiska studier av vävnad 11,12, men förfarandet har inte använts som en primär metod för anatomisk studie. Vävnaden Tryckmetodenanvändes för att isolera stora delar av mikrovaskulatur och ger förmågan att studera electrotonic arkitekturen i vaskulaturen 13. I teorin kan denna teknik också användas för att studera anatomiska förändringar, som kvaliteten på fartygen är hög. Det är dock endast kunde isolera segment av hela vaskulaturen nätverket. Även om dessa metoder inte kan ersätta trypsin smälta, är det viktigt att notera att de har olika fördelar och brister och kompletterar varandra i detta avseende.

Den trypsin digest metoden är tekniskt utmanande och är svår att utföra genomgående 6,7. Vidare har det noterats att trypsin digest är särskilt svårt på en musmodell, särskilt om man önskar att upprätthålla den totala vaskulära arkitekturen av näthinnan 6,7. Utmaningar inkluderar (1) over-rötning av näthinnan som orsakar förlust av både kärlsystemet samt icke-vaskulär vävnad, (2) under-matsmältning, kräveromfattande mekanisk dissektion vilket i sin tur kan leda till skador på fartyget sängen, (3) dålig separation av icke-vaskulär vävnad från kärlsystemet vilket leder till icke-specifik färgning. Flera manuskript har markerat dessa utmaningar, men ingen har gett en detaljerad och konsekvent protokoll för att övervinna dem 14,15. Detta manuskript kommer att införa en steg-för-steg metod beskriver tekniken för att utföra trypsin smälta på mus och råtta näthinnor med specifika tips om hantering av särskilt svåra steg. En schematisk översikt visas i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett. Retinal Framställning

  1. Enucleate musen ögat. Använda en hand, öppna ögonlocken så att ögat är synlig. Med den andra handen, med en böjd pincett (böjda uppåt), utöva påtryckningar på högre och lägre aspekter av bana förrän Globe sticker. Stäng försiktigt pincett vid den bakre sidan av ögat och lyft i en kontinuerlig rörelse för att enucleate ögat.
  2. Fix ögat med 10% neutral buffrad formalin under minst 24 tim.
  3. Placera öga i PBS-lösning i en liten petriskål.
  4. Dissekera ut näthinnan försiktigt under ett mikroskop, var noga med att undvika att framkalla stora tårar. Gör ett snitt i hornhinnan med dissektion sax. Sedan, medan du håller snittet området med raka pincett, en sax för att klippa längs gränsen av hornhinnan och senhinnan bort hornhinnan. Använda fina böjda och raka pincett, försiktigt skal sklera och åderhinnan bort från näthinnan mot synnerven. Detta steg kräver tålamodsnabbt frigöra näthinnan kan leda till tårar. Ta bort objektivet och eventuellt överskott av iris och skräp från näthinnan 16.

2. Vatten Tvättar

  1. Placera näthinnan i en 24-brunnars skål och täck med vatten (ca 500 pl, filtreras med åtminstone en 45 ^ m filter).
  2. Byt vatten varje 30 min-1 timme, minst 4-5 gånger.
  3. Lämna över natten i vatten med försiktig skakning vid rumstemperatur.

Obs: tvättningsstegen är mycket viktiga eftersom de hjälper separera neurala retinaskikt från blodkärlen.

Tre. Trypsin Digest

  1. Avlägsna vatten och inkubera näthinnan i en lösning av 3% trypsin (Difco 1:250) i 0,1 M Tris-buffert (pH 7,8) vid 37 ° C under försiktig till ingen skakning. Trypsin digest är slutförd när vävnaden börjar visar tecken på sönderfall (ca 1,5 h).
    Obs: Undvik snabb skakningeftersom detta kan skada kärlsystemet.
  2. Försiktigt, pipettera ut trypsin i en separat brunn med ett mikroskop för att undvika att röra näthinnan. Detta överskott trypsin kan användas senare när manipulera fartygen under mikroskop, i steg 4.3.

4. Separera kärlsystemet

  1. Lägg filtrerat vatten till näthinnan. Sedan försöker dra bort interna begränsande membran med pincett, med sax om det behövs. Skaka med mild omröring under 5 min. Försiktigt, pipett ur vattnet under mikroskop för att undvika skador på näthinnan.
  2. Upprepa vattentvättningarna (för 5 minuter vardera) för att hjälpa fria nätverket av fartyg från den vidhäftande näthinnevävnad. Vattentvättningarna klar när det finns lite att inget skräp kvar i vattnet efter tvätt.
  3. Försiktiga manipulationer enligt en dissektion mikroskop behövs nu för att ytterligare frigöra nätverket av fartyg. Nedan finns flera användbara tekniker, som kan användas i sekvens eller individually att uppnå önskat resultat utifrån tekniska preferenser:
    1. Använda en 200 l pipett försiktigt pipettera vatten upp och ner intill fartyg, blåser vatten på fartyg, vilket försiktig omrörning.
    2. Använda 200 l pipett, pipettera trypsinet upp och ner för att hjälpa coat väggar i pipetten. Sedan försiktigt pipettera hela fartyget nätverket upp och ner en gång för att hjälpa till att bryta ned icke-vaskulär vävnad.
      Anmärkning: Centrering av pipettspetsen vid synnerven snarare än kanterna på den vaskulära nätverket kan också förhindra vaskulaturen från att klibba till spetsen.
    3. Lyft försiktigt kärlsystemet med fin pincett ur vatten för att få bort icke-vaskulära komponenter.
    4. Om ovanstående steg inte fungerar, lägg trypsin på näthinnan för att hjälpa till att bryta ner vävnaden, och inkubera vid 37 ° C under flera minuter. Sedan, ta bort trypsin och upprepa steg 4,1-4,3.

<strong> Anmärkning: Se till att belägga alla instrument som kommer i kontakt med fartygen i trypsin (t.ex. pipettspets, pincett). Detta kommer att bidra till att undvika vidhäftning av kärlsystemet till utrustningen.

Fem. Visualisering kärlsystemet

  1. Placera en droppe vatten på ett rent objektglas. Med hjälp av en 200 l pipett eller pincett, överföra smälta fartyg i vattnet. Se till att kärl platt-fästet är utfälld. Ytspänning vattnet hjälper till att vika upp nu VAG vaskulära nätverket. Om vävnaden inte utvecklas, tillsätt ytterligare vatten och försiktigt skaka bilden för att underlätta utspelas.
  2. Avlägsna överflödigt vatten mycket långsamt genom pipettering eller använda en pappershandduk.
  3. Låt objektglasen torka helt.
  4. Stain diabilder via lämpligt protokoll med antingen PAS / hematoxylin eller H & E färgning.
    Obs: PAS / hematoxylin är användbar för att identifiera kärlväggen och cellulär kärnor, H & E är användbar för demonstration av RBC samt.
  5. Torka och montera (Permount monteringsmedium).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den slutliga produkten av en lyckad procedur är en platt-mount av hela nätverket av musen retinal kärlsystemet, med arkitekturen bibehålls, färgades med antingen PAS / hematoxylin eller H & E, som visas i figurerna 2-4. Klar differentiering av endotelceller och pericyter kan ses som visas i figur 3. I näthinnan, kärnorna av endotelceller är ovala eller avlånga och helhet ligga inom kärlväggen. Pericyter kärnor är små, sfäriska, bets tätt och i allmänhet har en utskjutande läge utmed kapillärväggen.

Trypsin Digest är ett vanligt förfarande att analysera vaskulär patologi i diabetiska djurmodeller. Patologiska vaskulära lesioner såsom microaneurysms, pericyter spöken (bevis på pericyter förlust), acellulärt kapillärer och kapillär degeneration har beskrivits. Figur 4 visar ett exempel på kapillär degeneration ses i en db / db mus, en modell för typ II-diabetes. Även om förfarandet har optimerats för mus näthinnor har samma resultat även erhållits i råtta näthinnor såsom visas i figur 5. Det är viktigt att notera att råtta näthinnor är mycket större, och en 12-brunnar användes i stället för en 24-brunnar. Den vaskulatur nätverk av råttans näthinnan är också mindre ömtålig än mus motsvarighet.

Det är oerhört viktigt att avlägsna så mycket av den icke-vaskulär vävnad som möjligt. Eventuella rester kommer att leda till icke-specifik färgning och leda till dålig visualisering av vaskulaturen. Figur 6 representerar ett exempel på misslyckad avlägsnande av hela icke-kärlvävnad i steg 4. Likaså är det också viktigt att ha näthinnan vikas upp vid montering för att förbättra visualisering av vaskulaturen. Figur 7 representerar misslyckade utvikning av den vaskulära platt-mount i steg 5.1.

ure 1 "fo: innehåll-width =" 5.75in "fo: src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50489/50489fig1.jpg "/>
Figur 1. . Schematisk trypsin Digest Protocol (1) retinal Förberedelser: isolera näthinnan från ögat, (2) Vatten tvättar: Tvätta i filtrerat vatten över natten, (3) Trypsin Digest: Inkubera under 3% trypsin vid 37 ° C under 1-1,5 h; (4) Separera kärlsystemet: isolera kärlsystem via serie vatten tvättar och dissektion under mikroskop, (5) Flytta vasculature att glida och låt torka, (6) Visualisera kärlsystemet:. fläcken slide med PAS eller H & E, torka och montera Klicka här att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Kontroll db / m mus trypsin digest (H & E, 20x).Denna siffra är en översikt av näthinnans vaskulära nätverket visar normal vaskulär arkitektur.

Figur 3
Figur 3. Kontroll db / m mus trypsin digest (H & E, 600x). Detta är en förstorad vy av näthinnan i figur 2 som visar normal vaskulär arkitektur. Endotelcell (vit pil) och pericyter (svart pil) är markerade.

Figur 4
Figur 4. Diabetic db / db mus trypsin digest (H & E, 500x). Av 52 veckor, db / db-möss börjar utveckla vaskulär patologi såsom kapillär degeneration (vit pil).

Figur 5
Figur 5. Normal råttanäthinnan trypsin digest, (PAS, 20x [a], 100x [b]). En översikt och förstorad bild av en normal råtta vaskulär nätverk.

Figur 6
Figur 6. Kontroll C57/BL6 mus trypsin digest, icke-vaskulär vävnad intakt (H & E, 20x [a], 100x [b]). Med dålig avlägsnande av icke-vaskulära vävnaden, det är icke-specifik färgning försämra visualiseringen av fartyg.

Figur 7
Figur 7. Kontroll db / m mus trypsin digest, dålig montering (H & E, 20x). Om näthinnan inte tillräckligt ovikta, är otillräcklig visualisering av vaskulära nätverket.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Trypsin Digest är en standardmetod för att bedöma vaskulaturen av näthinnan. Tyvärr är det tekniskt utmanande och kan resultera i hög prov förlust om den inte utförs på rätt sätt. Vidare är förfarandet särskilt svår i möss, vilket kan begränsa tillämpningen av denna teknik i de vanligaste genetiska djurmodeller av ögonsjukdomar. Detta dokument ger vägledning om hur man ska utföra proceduren på ett effektivt och konsekvent i mus ögon.

Det finns flera viktiga steg i protokollet. Först är det viktigt att näthinnan dissekeras ut försiktigt för att undvika stora tårar, för att säkerställa att den vaskulära nätverket förblir intakt. Andra, tvättning näthinnan i filtrerat vatten över natten är viktigt eftersom det hjälper separerar neuroretinal lagren från blodkärlen, vilket underlättar en lättare separation efter trypsin smälta. En ändring som skulle kunna påskynda processen skulle vara att placera näthinnan i 1% triton X-100 blandas i filtrerat vatten under 1-2 timmar. Sedan kan trypsin digest utföras samma dag efter en serie av vatten tvättar för att avlägsna Triton X.

Det är viktigt att de retinala vävnaderna stå under ständig övervakning under trypsin digest för att undvika oavsiktlig upplösning av vaskulatur vävnad. Baserat på vår erfarenhet, är ca 1-1,5 h är tillräcklig för att åstadkomma nedbrytning av nervvävnad, samtidigt kärlsystemet intakt. Mindre tid behövs för yngre möss. Försiktig skakning kan utföras under trypsin digest för att underlätta separation av blodkärl från den kvarvarande vävnaden, men är inte nödvändigt. Det är viktigt att undvika kraftig omrörning eftersom detta kan leda till att riva av fartygen.

De kritiska steg som kräver mest uppmärksamhet innebär separera kärlsystemet efter trypsindigerering. När du utför vattentvättningarna, är det viktigt att undvika pipettering kärlsystemet. Pipettering avkärlsystemet bör endast användas som ett förfarande för separering vaskulaturen efter väggarna har belagts med trypsin. Alla manipulationer måste göras noggrant under dissektionsmikroskop som nätverk av kärl kan lätt skadas. De olika tekniker som beskrivs i steg 4 kan användas framgångsrikt i en mängd olika kombinationer. I slutändan kommer det att vara upp till den enskilde försöksledaren att hitta den metod som fungerar bäst för dem. Det är viktigt att alla verktyg som kommer att komma i kontakt med blodkärlen beläggas med trypsin. Doppa verktygen intermittent och ofta i trypsin under förfarandet kan förhindra vidhäftning av kärlsystemet och potentiella störningar.

Effekten av förfarandet är också beroende på bakgrunden musmodell. Vissa mus bakgrunder inte är så gynnsam för att bevara hela kärlsystemet nätverket. Till exempel är den FVB bakgrunden homozygota för en fosfodiesteras-6 mutationen gör dem benägna till retinal degeneration 17. Från vår erfarenhet, har vi funnit att deras retinal vasculature natur är mer bräcklig, och vi kunde för att bevara hela kärlsystemet nätverket. Det är sålunda viktigt att bakgrunden beaktas innan du försöker denna teknik.

Ytterst är den största begränsningen för detta förfarande en individs dissektion färdigheter. Det är viktigt att notera att även om en person känner de tekniker väl, kan det ta flera försök innan de börjar uppnå jämna resultat. Därför rekommenderar vi att de berörda lab personal utföra flera praxis dissektioner att vinna förtroende och komma fram till den bästa och mest konsekventa strategi innan du utför proceduren på sin experimentella vävnad. Det är viktigt att notera att när behärskar, är trypsin smälta en värdefull teknik som kan användas för att bedöma vaskulär patologi (Figur 4). Trypsin smälta kan också utföras framgångsgångsrikt på konserverade näthinnor som har varit i fixativ för flera år 1.

Sammanfattningsvis fortsätter trypsin digest är en mycket användbar metod för att analysera näthinnans kärlsystem sedan dess beskrivning av Cogan och Kuwabara på 1960-talet. Den tillåter detaljerad visualisering av hela vaskulära nätverket, jämfört med immunofluorescens / H & E / PAS färgade snitt, platt-fästen och dye-injektioner. Även om det är tekniskt svårt, beskriver detta manuskript proceduren i detalj så att den kan utföras med framgång. Som ett resultat, hoppas vi utredare nybörjare att metoden kommer att ha tillräcklig vägledning för att möjliggöra framgångsrik och konsekvent analys av näthinnans blodkärl i deras experimentella modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete har delvis stöd av NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Society for förhindrande av Blindness (JCC, AAF), fria medel till Ögonkliniken från forskning att förebygga blindhet (RPB), NY och RPB Medical Student Fellowship Grant (JLL).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
10% neutral buffered formalin Fischer Scientific SF100-4
Trypsin (1:250) Amresco 0458-50G Make 3% trypsin in 0.1 M Tris
TRIZMA base Sigma T1503-1KG Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C)
TRIZMA Sigma T3253-500G
Steritop sterile vacuum bottle Millipore SCGPS05RE Create filtered water
EQUIPMENT
Dissecting microscope Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm)
Straight scissors Fine Science Tools 15024-10 Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm
Straight Forceps (Inox) Dumont #5 11252-20 Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm
Curved Forcepts (Dumostar) Dumont #7 11297-10 Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm
Dubnoff Metabolic Shaker Incubator Precision Scientific BDG59442 Shaker optional
24-well dish Falcon 353047
Microscope Slides VWR 82027-132

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
  2. Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
  3. Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
  4. Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
  5. Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
  6. Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
  7. Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
  8. Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
  9. Chapter 30. Diabetic Retinopathy. Lippincott Williams and Wilkins. (2005).
  10. Rosenblatt, B., Benson, W. E. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. Yannoff, M., Duker, J. 3rd edition, Mosby, Inc. (2008).
  11. Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
  12. Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156, (10), 1025-1032 (2000).
  13. Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
  14. Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
  15. Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
  16. Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
  17. Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
  18. The Jackson Laboratory [Internet]. Available from: http://jaxmice.jax.org/strain/001800.html (2012).
Trypsin Digest protokollet för att analysera den Retinal kärlsystemet av en musmodell
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).More

Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model. J. Vis. Exp. (76), e50489, doi:10.3791/50489 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter