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Bioengineering

Filtre à air dispositifs, y compris maillages non tissé de électrofilées protéines recombinantes de soie d'araignée

doi: 10.3791/50492 Published: May 8, 2013

Summary

Fibres de soie d'araignée présentent des propriétés mécaniques exceptionnelles. Conçu

Abstract

Sur la base de la séquence naturelle d'Araneus diadematus Fibroïne 4 (ADF4), la protéine de soie d'araignée recombinante eADF4 (C16) a été conçu. Cette protéine hautement répétitif a un poids moléculaire de 48kDa et qui est soluble dans différents solvants (hexafluoroisopropanol (HFIP), l'acide formique et des tampons aqueux). eADF4 (C16) offre un fort potentiel pour des applications diverses techniques lors transformé en morphologies telles que des films, des capsules, des particules, des hydrogels, des revêtements, des fibres et des maillages non-tissés. En raison de leur stabilité chimique et une morphologie contrôlée, celle-ci peut être utilisé pour améliorer des matériaux filtrants. Dans ce protocole, nous présentons une procédure visant à améliorer l'efficacité des différents dispositifs de filtration de l'air, par dépôt de mailles non tissées de électrofilées protéines de soie d'araignée recombinantes. Electrospinning de eADF4 (C16) dissous dans les résultats HFIP en fibres lisses. Variation de la concentration en protéine (de 5 à 25% p / v) donne lieu à différents diamètres de fibres (80-1,100 nm) etpar conséquent, les tailles des pores de la maille non tissée.

Post-traitement de eADF4 (C16) électrofilées de HFIP est nécessaire étant donné que la protéine présente une structure principalement α-hélicoïdale secondaire dans les fibres fraîchement filées, et donc les fibres sont solubles dans l'eau. Un traitement ultérieur avec de la vapeur d'éthanol induit la formation d'eau d'étanchéité, les structures β-feuille stables, en conservant la morphologie des fibres de soie et des maillages. Analyse de la structure secondaire a été réalisée en utilisant la transformée de Fourier spectroscopie infrarouge (FTIR) et Fourier subséquente auto-déconvolution (FSD).

L'objectif principal était d'améliorer l'efficacité du filtre de supports de filtres existants en ajoutant des couches non tissées de soie sur le dessus. Pour évaluer l'influence de électrofilature durée et l'épaisseur de la couche ainsi tissé sur l'efficacité du filtre, nous avons réalisé des tests de perméabilité à l'air en combinaison avec les mesures des dépôts de particules. Les expériences ont été effectuées conformément à la normeprotocoles.

Introduction

En raison de leur combinaison de la force et de l'extensibilité, de fibres de soie d'araignée peuvent absorber plus d'énergie cinétique que la plupart des autres fibres naturelles ou synthétiques 1. En outre, contrairement à la plupart des matériaux polymères synthétiques tissus de soie sont non toxiques et biocompatibles et ne causent aucune réaction allergique lorsqu'elles sont incorporées 2,3. Risques pour la santé putatifs peuvent être évités en utilisant la soie d'araignée. Ces caractéristiques font de la soie d'araignée très attrayant pour une variété d'applications médicales et techniques. Depuis araignées ne peuvent pas être cultivées en raison de leur comportement cannibale, méthodes biotechnologiques ont été développés pour produire des protéines de soie d'araignée, à la fois rentable et en quantité suffisante 4.

La protéine de soie recombinant eADF4 (C16) a été conçu sur la base de la séquence naturelle d'Araneus diadematus Fibroïne 4 (ADF4). eADF4 (C16) a un poids moléculaire de 48kDa 5 et est soluble dans divers solvants (hexafluoroisopropanol (HFIP) 6, l'acide formique 7 et tampons aqueux) 8. eADF4 (C16) peuvent être transformés en différentes morphologies tels que les films 9, 8 capsules, les particules 10, 11 hydrogels, les revêtements 7, 12 et fibres non tissées 6 mailles. En raison de leur stabilité chimique, ces derniers accordent un fort potentiel dans les applications de filtrage.

Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des dispositifs de filtration de l'air, y compris un maillage tissé de électrofilées protéines de soie d'araignée recombinantes. Électrofilage de filage ou électrostatique est une technique généralement utilisée pour la production de fibres de polymère ayant des diamètres dans la gamme de 10 nm -10 pm 13, et des maillages non tissées ont déjà été étudiées pour des applications de filtrage 14. Dans le passé, electrospinning a été appliquée avec succès pour le traitement des régénérée 15 ainsi que produite par recombinaison 16 soie d'araignéeprotéines. Typiquement, une tension électrique élevée (5-30 kV) est appliquée à une seringue et d'une contre-électrode (0-20 kV) placé dans une distance de 8-20 cm. Le fort champ électrostatique induit des forces répulsives au sein de la solution chargée. Si la tension de surface est dépassé, un cône de Taylor est formée, et un mince jet jaillit de l'extrémité 17,18. Après formation, les instabilités de flexion se produisent à l'intérieur du jet provoquant étirement en outre que le solvant s'évapore, et une fibre solide est formé. Enfin, la fibre est déposé au hasard sur la contre-électrode en tant que mailles non tissé 19. Propriétés de la fibre comme le diamètre et la surface de topologie (lisse, poreux) sont principalement dépendante de paramètres de la solution tels que la concentration, la viscosité, l'énergie libre de surface et la conductivité électrique intrinsèque du solvant et de la perméabilité 20. Electrospinning de eADF4 (C16) en solution dans HFIP résultats dans les fibres lisses d'un diamètre de 80-1,100 nm en fonction de la concentration de protéine dans la solution.eADF4 (C16) électrofilées de HFIP affiche une structure principalement α-hélicoïdal secondaire, et les fibres sont solubles 6 eau. Afin de stabiliser les fibres de soie, les structures β-feuilles doivent être induite par un traitement ultérieur avec de l'éthanol. Contrairement aux méthodes précédemment établies de post-traitement 21, dans cette étude eADF4 (C16) non-tissés ayant été traitée avec de la vapeur d'éthanol, afin de préserver la morphologie des fibres de soie. Analyse de la structure secondaire a été réalisée en utilisant la transformée de Fourier spectroscopie infrarouge (FTIR) et Fourier subséquente auto-déconvolution (FSD), comme décrit dans la littérature 22. FSD est un outil de traitement du signal qui permet la résolution des spectres FTIR composé de plusieurs bandes qui se chevauchent. Ainsi, les bandes indistinctes du large au milieu, je région peut être réduit en utilisant un filtre passe-haut pour recevoir un spectre déconvolué avec l'amélioration des résolutions de pointe.

Afin d'évaluer l'efficiency de substrats filtrants complétés avec des mailles de soie tissés, des tests de perméabilité à l'air ont été effectuées en utilisant un dispositif de Akustron selon des protocoles standards. Les taux de dépôt ont été mesurées en utilisant un universel granulomètre Palas.

Protocol

1. Filage de préparation

  1. Prenez lyophilisé eADF4 (C16) protéines.
  2. Peser 20 mg de eADF4 (C16) dans un récipient de réaction de 1 ml à l'aide d'une balance de haute précision.
  3. Ajouter 200 pi de hexafluoroisopropanol (HFIP) et sceller le récipient avec du Parafilm.
    Remarque: HFIP est très volatile et délétère. Comme il peut causer des dommages dans les voies respiratoires, travailler sous une hotte de sécurité, pipette soigneusement et hermétiquement le tube.
  4. Vortex la suspension pendant 1 min et encore secouer pour effacer la solution. Pour s'assurer que la totalité du montant de la protéine est complètement dissous, attendez au lendemain.

2. Electrospinning

  1. Préparez l'appareil electrospinning (Figure 1): placer le matériau filtrant au-dessus de la contre-électrode et le préréglage de la tension à la fois de l'électrode (-22.5 kV) et la contre-électrode (+2,5 kV). Réglez le débit à 315 pl / h.
    Note: wien que electrospinning, HFIP toxique sera évaporée. Assurez-vous que votre appareil est connecté à électrofilature une hotte.
  2. Prenez disponible dans le commerce 20 G aiguille et moudre le bout pointu avec un moulin à main à une longueur résiduelle de 30 mm. Branchez l'aiguille à une seringue de 1 ml.
    Remarque: Une extrémité de l'aiguille d'avion est nécessaire, afin de générer un cône de Taylor bien définie.
  3. Chargez l'ensemble filer (200 pi) dans la seringue. Superposer la dope avec 100 ul d'air, afin de permettre à la solution complète à extruder au cours du processus de filage.
    Note: Afin d'éviter le colmatage de l'aiguille, assurez-vous qu'il n'y a pas de particules (agrégats ou des impuretés) dans la solution de filage. Travailler sous une hotte!
  4. Fixer la seringue remplie à la pompe de seringue du dispositif et presser électrofilage avec soin sur le piston de la seringue jusqu'à ce qu'une goutte apparaisse à la pointe de l'aiguille. Verrouiller le piston.
  5. Réglez la distanceentre la pointe de l'aiguille et la contre-électrode à 8-20 cm.
  6. Démarrer la pompe de la seringue et retirer la gouttelette (habituellement séché) de l'ouverture de l'aiguille. Activer toutes les installations de sécurité du dispositif électrofilature immédiatement et commencer à la source de haute tension dès qu'une nouvelle goutte apparaît. Electrospinning de la solution de filage va commencer postérieurement. Utiliser un chronomètre pour contrôler la durée de rotation.
    Note: Afin d'éviter le dessèchement de la solution et ainsi obstruer de l'aiguille, il est nécessaire de commencer immédiatement le processus de filage après avoir enlevé la goutte séché.
  7. Depuis électrofilature de protéines de soie d'araignée recombinante dépend de l'humidité et de la température, une adaptation des paramètres du processus vers des conditions individuelles de laboratoire peut être nécessaire (Figure 2).
    Remarque: Pour éviter la gouttelette de séchage (figure 2B) permettre un débit suffisant. Si il ya une faible humidificationté dans l'atmosphère environnante, ajuster l'humidité relative ou augmenter le débit. Abaisser la tension jusqu'à un cône approprié Taylor se produit (figure 2A). Quand il n'y a pas de solution à la pointe (figure 2C), augmenter le débit et réduire la tension jusqu'à une goutte survient. Ensuite, ajuster la tension en vue d'établir un cône de Taylor régulière et stable (figure 2A).
  8. Après 30 sec / 60 sec / 90 sec de l'interrupteur de la pompe de la seringue électrofilature. Afin d'éviter la chute des gouttelettes, attendre 10 secondes avant d'éteindre la source de haute tension pour relâcher la pression résiduelle dans la seringue.
  9. Les étapes 6 à 8 peuvent être effectuées sur différents types de matériaux de filtration, tels que le polyamide, le polypropylène et des mailles non tissé de polyester, ainsi que de papier noir pour la comparaison.
  10. Pour produire un maillage tissé pour des expériences de stabilité ultérieures, utilisez du papier noir à la place de matériau filtrant et effectuez les étapes 5 à 7. Après 5 min de electrospinning, arrêterle procédé tel que décrit à l'étape 8.

3. Post-traitement des maillages non-tissés de soie

  1. Préchauffer un four à 60 ° C.
  2. Placer les supports de filtres avec eADF4 (C16) mailles non tissées verticalement et avec une distance minimale de 2 cm dans un récipient en verre verrouillable. Le récipient doit avoir deux ouvertures qui seront utilisés pour introduire ensuite l'éthanol et de l'eau.
    Note: Lors de la fixation des matériaux filtrants, assurez-vous que la surface nécessaire pour les expériences de perméabilité n'est pas endommagé par les pinces.
  3. Connectez deux 60 seringues ml, l'un rempli avec de l'éthanol et un rempli avec de l'eau, avec des tubes de silicone pointant dans le fond intérieur du récipient post-traitement (figure 3).
    Remarque: Dans le but de pouvoir enlever le liquide du récipient, après le traitement, placer les ouvertures des tubes le plus près possible du fond.
  4. Placez le récipient post-traitement dans la VOfr et ajouter 60 ml d'éthanol par extrusion de la seringue. Utiliser un chronomètre pour contrôler la durée du traitement.
  5. Après 90 min de traitement à la vapeur d'éthanol, éliminer l'éthanol avec la seringue à partir de la vitre, et ajouter 60 ml d'eau à partir de la seconde seringue.
  6. Attendez encore 90 min, puis retirez l'eau et éteindre le four. Afin d'éviter les gouttelettes de condensation, laissez le récipient dans le four jusqu'à ce qu'il soit complètement refroidi.

4. Analyse de la soie d'araignée non-tissés Meshes

  1. Préparer les mailles de soie tissés des essais de stabilité sur papier noir ou tout autre support amovible. Coupez deux cadres en carton et d'ajuster la bande adhésive double-collante. Appuyez sur un cadre sur la soie maille tissée déposée sur papier noir et utiliser un scalpel pour couper l'excédent de fibres de soie (garder les excès de fibres pour la suite SEM-imagerie). Retirez délicatement le châssis afin de détacher le non-tissé du papier. Répétez cette étape avec le deuxième cadre(Figure 4).
  2. Test de trempage pratique: Couper un morceau (1 cm 2) de chacun, la soie maille tissée post-traité et non traité et le tremper dans de l'eau déminéralisée. Le maillage de la soie non-tissé non traité se dissoudre immédiatement, tandis que la maille non tissée traitée sera stable (figure 5). Après le trempage, sécher l'échantillon de croisement et le préparer pour l'imagerie SEM.
  3. Transformée de Fourier spectroscopie infrarouge (FTIR)-mesure et suivant Fourier auto-déconvolution (FSD): Transmission: Afin d'obtenir des informations sur les changements de structure des protéines de soie sur un post-traitement des maillages non-tissés, FTIR peut être appliquée en utilisant les paramètres -mode, balayage de 800 à 4000 cm -1, 60 accumulations sont mesurés et moyenne pour chaque spectre, une référence est mesurée par spectre. Pour l'analyse quantitative des données, FSD peut être utilisé (Figure 6 et Figure 7). Ainsi, les courbes sont réduits au ar donnéesch entre 1,590 et 1,705 cm -1 et une correction de base est effectuée. Un ajustement des moindres carrés locale est calculé en fonction des positions de pointe tirées d'études précédentes (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1698 cm -1) 22.
  4. Imagerie SEM: SEM peut être utilisée pour étudier diamètre des fibres et de la morphologie des fibres de soie sur les différents supports de filtres et d'analyser l'influence du post-traitement sur ​​la morphologie de la fibre (figure 8). Utilisez des grossissements de 5.000 x 25.000 x pour obtenir des images suffisamment détaillées.

5. Détermination de la perméabilité à l'air

  1. Placez une pièce de fixation adéquate du matériau filtrant sur ​​la zone de mesure d'un dispositif de perméabilité à l'air Akustron. Remarque :: Si vous utilisez un autre type de dispositif de perméabilité à l'air, assurez-vous qu'il répond aux exigences de la norme DIN 53 887, DIN 53 120, ISO 9237 et ASTM D 737-96.
  2. Employer un dispositif de perméabilité à l'air Akustron (ou tout autre comme représenté en 5.1). Si nécessaire calculer les données normés [l / (m 2 x s)].
  3. Répétez les étapes 1 et 2 au moins 10 fois avec différentes parties de votre échantillon et calculer la moyenne arithmétique (Figure 9).
    Remarque: la perméabilité à l'air de mesure nécessite un contact du dispositif et la maille non tissée. Ainsi, une manipulation soigneuse des échantillons est essentielle pour éviter la rupture de la soie délicate maille tissée.

6. Détermination de l'efficacité Filter

  1. Utilisation d'une machine appropriée avec commande de pression et de compteur de particules, par exemple un granulomètre universel (Palas GmbH, Karlsruhe, Allemagne).
  2. Placer les échantillons de filtre dans le dispositif de rétention de particules et mesure (figure 10). Aérosol: Di-éthyl-hexyl-sebacat (DEHS); tailles de particules: 0,3-3 um, durée: 30 sec; la vitesse du liquide: 2,350 cm / s; Débit d'air: 3.400 m 3 / h.
    Note: Manipuler l'échantillon avec soin et ne pas toucher la surface pour empêcher la destruction de la maille tissée et éviter toute pollution. Veillez à créer suffisamment d'échantillons de qualité égale pour les mesures de performance.

Representative Results

Electrospinning de solutions de soie d'araignée recombinante avec des concentrations de 10% p / v de HFIP entraîné fibres lisses avec des diamètres allant de 80 à 120 nm, ce qui permet la formation de mailles non tissées. Post-traitement avec de la vapeur d'éthanol n'a pas conduit à des changements morphologiques visibles, ce qui était donc établie comme une bonne façon de soie tissée post-traitement (Figure 8). Les changements structurels ont été détectés par FT-IR et FSD ultérieure de milieu I bandes a été effectuée pour analyser les pics de contribution unique (Figure 6). Il a pu être démontré que le post-traitement conduit à une augmentation des structures β-feuille, tandis que la teneur und structures de bobines aléatoires α-hélice diminue (figure 7). Ce résultat peut être pratiquement prouvé par trempage d'un post-traité non-tissé dans l'eau (figure 5). Même après une semaine, sans dissolution de la maille non tissée se produira.

La filature duration est le paramètre le plus important concernant l'application des non-tissés de soie dans les matériaux filtrants en raison de la chute de pression en fonction de la densité croissante de fibres électrofilées. Etendue de filage durées und ainsi un plus grand nombre de couches de fibres se traduisent par une décroissance exponentielle de la perméabilité à l'air. Cet effet a pu être détectée pour les différents matériaux de substrat de filtre avant et après post-traitement (figure 9). De même, l'efficacité de filtrage des matériaux filtrants soie contenant des particules sub-micrométriques augmente (figure 10). Alors que des durées de filage court (30 sec) gagnent en efficacité filtre passe-bas, les durées de filage plus élevées (90 sec) conduisent à des rendements plus élevés.

Figure 1
Figure 1. Tension électrique élevée (0-30 kV) i s appliqué à une seringue remplie d'une solution de la soie, et une contre-électrode (0-20 kV) est placé dans une distance de 8-20 cm. Cette configuration conduit à un fort champ électrostatique, ce qui induit des forces répulsives au sein de la solution chargée. Si la tension de surface est dépassé, un cône de Taylor est formée, et un mince jet jaillit de la pointe. Après formation, les instabilités de flexion se produisent à l'intérieur du jet provoquant étirement en outre que le solvant s'évapore, et une fibre solide est formé. Enfin, la fibre est déposé au hasard sur la contre-électrode sous la forme d'une maille non tissée.

Figure 2
Figure 2. Photographies d'un cône de Taylor régulier (A), une gouttelette séchée (B), et l'installation sans gouttelette (C).

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Figure 3. Procédure schématique lors vapeur post-traitement. Dans la première étape, la chambre est remplie avec de l'éthanol, et l'échantillon est à la vapeur à 60 ° C pendant 90 min. Afin d'adoucir les mailles non tissés pour la manipulation, l'éthanol est éliminé et les fibres sont cuits à la vapeur avec la vapeur d'eau pendant 90 min à 60 ° C. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4
Figure 4. Photographie d'un cadre en carton avec joints mailles non tissées de soie à être utilisés pour le post-traitement.

Figure 5
Figure 5. Electrospun et ensuite post-traitées à l'état sec non-tissé (A) et sous l'eau (B).

Figure 6
La figure 6. Fourier du spectre d'absorbance d'auto-déconvolué d'une bande d'un I non traité (A) et un post-traité (B) la soie d'araignée maille non tissée amide. La ligne continue indique la bande d'absorbance résultant des pics de contribution unique (lignes en pointillés) comme dérivé après déconvolution. L'affectation des courbes respectives se fonde sur des valeurs déjà publiées dans la littérature 22. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 7 t-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg" />
Figure 7. Du contenu de la structure secondaire de mailles non tissées non-traités et post-traité eADF4 (C16).

Figure 8
. Figure 8 images MEB de électrofilé eADF4 (C16)-fibres sur différents substrats filtrants: polyamide (PA), Polyester (PE), polypropylène (PP) et pure eADF4 (C16) fibres avant (S1) et après (S2) Post- traitement avec de la vapeur d'éthanol. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 9. Tests de perméabilité à l'air, avant (A) et après post-traitement (B) de la soie mailles tissés avec de la vapeur d'éthanol, ce qui augmente les temps de filature conduisent à des couches plus non tissés abaissant ensuite la perméabilité à l'air.

Figure 10
La figure 10. D'efficacité du filtre de l'aérosol de di-éthyl-hexyl-sebacat sur ​​électrofilées soie d'araignée mailles non tissées de polyamide matériaux de filtre à différentes durées de filage, agissant sur ​​la quantité de couche de soie, après un post-traitement avec de l'éthanol.

Discussion

Nouveaux dispositifs de filtrage devraient permettre l'abaissement de la consommation énergétique globale en matière de filtration d'air avec une efficacité constante du filtre ou supérieur. Ici, ces dispositifs ont été créés en utilisant des non-tissés de soie d'araignée. Grâce à sa faible tension de surface et une forte volatilité, HFIP a été choisi comme un solvant approprié pour le processus électrofilature. En outre, les solutions aqueuses de soie ont été testés dans les expériences précédentes, mais pas de fibres pourraient être générés. Ici, il serait crucial d'utiliser des additifs afin d'abaisser la tension de surface et ainsi d'améliorer les propriétés de filage de la solution. L'étape la plus critique est d'ajuster les conditions et la concentration de la matière utilisée et le solvant de la solution de filage, filature hauteur, la tension et la vitesse d'extrusion. Au cours de la performance, par exemple le colmatage de la pointe peut être évitée en fournissant à l'extrémité de l'aiguille avec l'humidité sous forme de vapeur d'eau, mais tout type d'ajouts dans la configuration électrofilage pourrait perturber la suitele processus sensible et champ électrique. Paramètres de processus essentiels (concentration, la tension, la distance, humidité) ont été déterminées individuellement réalisation séries expérimentales séparé (données non présentées). Compte tenu de tous les paramètres en considération, il est essentiel de prendre soin d'un cône de Taylor continue et procédé de filage pour créer des fibres uniformes.

L'efficacité du filtre est un des paramètres les plus importants de matériaux filtrants. Ce paramètre est essentiellement influencée par la structure de la matière filtrante. Wovens héritent des tailles de pores uniformes et de perméabilité à l'air suite cohérente. Il est crucial de créer des maillages non-tissés homogènes sur ces matériaux de modèle pour remplir les pores et à générer un filtre zéro défaut. L'efficacité du filtre dans nos filtres montre une dépendance directe sur la durée de rotation (des protéines de soie), et, par conséquent, le nombre de couches de mailles non tissées. Les écarts entre les fibres individuelles sont constamment remplis, permettant la rétention of particules plus petites.

Dans ce travail, nous avons introduit une méthode pour produire un matériau nouveau filtre avec la soie d'araignée mailles non tissées, montrant l'efficacité du filtre élevée. Par conséquent, ces filtres sont des candidats prometteurs pour une utilisation future dans les systèmes de filtration d'air.

Disclosures

Nous n'avons rien à révéler.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants de l'appui technique et scientifique de Anja Lauterbach (Lehrstuhl Biomaterialien), Lorenz Summa (Sandler AG) et Armin Boeck (B / S / H / G). SEM-imagerie a été réalisée par Johannes Diehl (Lehrstuhl Biomaterialien). Le financement provient de BMBF (01RB0710).

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Filtre à air dispositifs, y compris maillages non tissé de électrofilées protéines recombinantes de soie d'araignée
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Lang, G., Jokisch, S., Scheibel, T. Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins. J. Vis. Exp. (75), e50492, doi:10.3791/50492 (2013).More

Lang, G., Jokisch, S., Scheibel, T. Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins. J. Vis. Exp. (75), e50492, doi:10.3791/50492 (2013).

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