Filtro de ar de dispositivos, incluindo malhas não tecidos de electrospun Proteínas Recombinantes de seda de aranha

Summary

Fibras de seda de aranha exibir extraordinárias propriedades mecânicas. Projetada

Abstract

Com base na sequência natural de Araneus fibroína 4 (ADF4), a aranha proteína de seda recombinante eADF4 (C16) foi projetado. Esta proteína é altamente repetitiva tem um peso molecular de 48kDa e é solúvel em solventes diferentes (de hexafluoroisopropanol (HFIP), o ácido fórmico e tampões aquosos). eADF4 (C16), dispõe de um elevado potencial para diversas aplicações técnicas, quando transformados em morfologias tais como películas, cápsulas, partículas, hidrogéis, revestimentos, fibras, não tecidos e malhas. Devido à sua estabilidade química e morfologia controlada, esta última pode ser usada para melhorar os materiais de filtro. Neste protocolo, apresentamos um procedimento para aumentar a eficiência de diferentes dispositivos de filtro de ar, por deposição de malhas não tecidos de proteínas da seda de aranha recombinantes electrospun. Eletrofiação de eADF4 (C16) dissolvido em HFIP resultados de fibras lisas. Variação da concentração de proteína (5-25% w / v), resulta em diferentes diâmetros de fibras (80-1,100 nm) eassim, os tamanhos dos poros da malha não urdida.

O pós-tratamento dos eADF4 (C16) a partir de HFIP electrospun é necessário uma vez que a proteína exibe uma estrutura predominantemente α-helicoidal secundário recentemente fiados em fibras, e, por conseguinte, as fibras são solúveis em água. O tratamento subsequente com vapor de etanol induz a formação de resistente à água, as estruturas estáveis ​​β folhas, preservar a morfologia das fibras de seda e malhas. Análise da estrutura secundária foi realizada utilizando a espectroscopia de infravermelho transformada de Fourier (FTIR) e posteriores Fourier auto-deconvolution (FSD).

O principal objectivo foi o de melhorar a eficiência do filtro de substratos de filtro existentes através da adição de camadas não tecidas de seda superior. Para avaliar a influência de electrospinning duração e, portanto, a espessura da camada não tecida sobre a eficiência do filtro, foram realizados ensaios de permeabilidade ao ar, em combinação com as medições de deposição de partículas. As experiências foram realizadas de acordo com a normaprotocolos.

Introduction

Devido à sua combinação de força e extensibilidade, fibras de seda de aranha pode absorver mais energia cinética do que a maioria de outras fibras naturais ou sintéticas ^1. Além disso, ao contrário dos materiais poliméricos sintéticos mais materiais de seda são biocompatíveis e não tóxicos e que não causam reacção alérgica quando incorporados ^2,3. Riscos de saúde putativas pode ser prevenida usando seda de aranha. Estas características tornam seda de aranha altamente atractivo para uma variedade de aplicações médicas e técnicas. Uma vez que as aranhas não podem ser cultivadas, devido ao seu comportamento canibalístico, métodos biotecnológicos foram desenvolvidos para a produção de proteínas de seda de aranha, tanto de forma rentável, e em quantidades suficientes ^4.

A proteína de seda recombinante eADF4 (C16) foi desenvolvido com base na seqüência natural de Araneus fibroína 4 (ADF4). eADF4 (C16) tem um peso molecular de 48kDa ⁵ e é solúvel em vários dissolventes (hexafluoroisopropanol (HFIP) ^{6, 7} e ácido fórmico tampões aquosos) ^8. eADF4 (C16) podem ser processados ​​em diferentes morfologias tais como películas ^{9, 8} cápsulas, as partículas ^{10, 11,} hidrogéis, revestimentos de ^{7, 12} e malhas de fibras não urdidas ^6. Devido à sua estabilidade química, este último fornecer um elevado potencial em aplicações de filtros.

Aqui, apresentamos um protocolo para fabricar dispositivos de filtro de ar, incluindo uma malha não-tecido de proteínas da seda de aranha recombinantes electrospun. Electrospinning fiação ou electrostático é uma técnica geralmente utilizada para a produção de fibras de polímeros com diâmetros na gama de 10 nm, ¹³ -10 mM, malhas e não tecidos já foram investigados para aplicações de filtro ^14. No passado, electrospinning tem sido aplicado com sucesso para a transformação de regeneração ^15, bem como produzida de forma recombinante de seda de aranha ¹⁶proteínas. Tipicamente, uma alta tensão (5-30 KV) é aplicada a uma seringa e um contra-eléctrodo (0-20 kV), colocada a uma distância de 8-20 cm. O campo electrostático forte induz forças repulsivas na solução carregada. Se a tensão superficial é excedido, um cone de Taylor é formado, e um jacto fino irrompe da ponta ^17,18. Após formação, as instabilidades de dobragem ocorrem no jacto causando mais estendendo-se o solvente se evapora, e uma fibra sólida é formada. Finalmente, a fibra é depositado aleatoriamente no contra-eléctrodo como uma malha não urdido ^19. Propriedades da fibra, como topologia de diâmetro e superfície (lisa, porosa) são principalmente dependentes de parâmetros de solução, como a concentração, a viscosidade, a energia livre de superfície e intrínseco de condutividade elétrica do solvente e permeabilidade ^20. Eletrofiação de eADF4 (C16) dissolvido em resultados HFIP em fibras lisas com diâmetros de 80-1,100 nm dependendo da concentração de proteína na solução.eADF4 (C16) a partir de HFIP electrospun exibe uma estrutura predominantemente α-helicoidal secundário e as fibras são solúveis em água ^6. A fim de estabilizar as fibras de seda, as estruturas β folhas tem que ser induzida por meio de tratamento subsequente com etanol. Em contraste com os métodos de tratamento de ^pós-21 previamente estabelecidas, neste estudo eADF4 (C16) não-tecidos foram tratados com o vapor de etanol, a fim de preservar a morfologia das fibras de seda. Análise da estrutura secundária foi realizada utilizando espectroscopia de infravermelhos transformada de Fourier (FTIR) e subsequente auto-desconvolução de Fourier (FSD), como descrito na literatura, ^22. FSD é um instrumento de processamento de sinal que permite a resolução dos espectros de FTIR que consiste em várias bandas sobrepostas. Deste modo, as bandas indistintas da ampla em meio I região pode ser reduzida utilizando um filtro passa-alto para receber um espectro deconvoluídos com melhores resoluções de pico.

A fim de avaliar a eficiency de substratos de filtro complementadas com malhas, não tecidos de seda, ensaios de permeabilidade ao ar foram realizadas utilizando um dispositivo de Akustron de acordo com protocolos padrão. As taxas de deposição foram medidos usando um Palas universal sizer partícula.

Protocol

1. Spinning Preparação Dope

1. Tome liofilizado eADF4 (C16) proteína.
2. Pesar 20 mg de eADF4 (C16) em 1 ml de um vaso de reacção, usando uma escala de alta precisão.
3. Adicionar 200 ul de hexafluoroisopropanol (HFIP) e selar o recipiente com Parafilm.
   Nota: HFIP é altamente volátil e deletéria. Como ele pode causar danos na vias respiratórias, o trabalho sob uma capa de segurança, pipeta com cuidado, e tampar o tubo.
4. Vortex a suspensão por 1 min e agitar ainda mais para limpar a solução. Para garantir que toda a quantidade de proteína é completamente dissolvido, esperar durante a noite.

2. Eletrofiação

1. Preparação do dispositivo de electrospinning (Figura 1): colocar o material de filtro na parte superior do contra-eléctrodo e a tensão predefinida de ambos os eléctrodos (-22,5 kV) e o contra-eléctrodo (2,5 kV). Defina o volume de fluxo de 315 mL / h.
   Nota: wnquanto electrospinning, HFIP tóxico será evaporada. Verifique se o seu dispositivo eletrofiação está ligado a um exaustor.
2. Dê uma agulha 20 G disponível comercialmente e moer a ponta afiada com um moedor de mão para um comprimento residual de 30 mm. Ligação a agulha a uma seringa de 1 ml.
   Nota: A ponta da agulha é necessária avião, a fim de gerar um cone de Taylor bem definida.
3. Coloque a totalidade do lubrificante de fiação (200 mL) para dentro da seringa. Sobrepor a droga com 100 ul de ar, a fim de permitir que a solução completa para ser extrudido durante o processo de fiação.
   Nota: A fim de evitar o entupimento da agulha, certifique-se de que não existem partículas de agregados (ou impurezas) do lubrificante de fiação. Trabalhar sob um exaustor!
4. Coloque a seringa cheia para a bomba de seringa do dispositivo de electrospinning e pressionar cuidadosamente o pistão na seringa até que uma gotícula de aparecer na ponta da agulha. Bloquear o pistão.
5. Defina a distânciaentre a ponta da agulha e o contra-eléctrodo de 8-20 cm.
6. Iniciar a bomba de seringa e remover o (geralmente secas) de gotículas a partir da abertura da agulha. Activar a todas as instalações de segurança do dispositivo de electrospinning imediatamente e iniciar a fonte de alta voltagem assim como uma nova gota aparece. Eletrofiação da droga fiação começará posteriormente. Use um cronômetro para controlar o tempo de fiação.
   Nota: A fim de evitar secagem da solução e, assim, o entupimento da agulha, que é necessário para iniciar imediatamente o processo de fiação, depois de remover a gota seco.
7. Desde electrospinning de proteínas de seda de aranha recombinantes, depende da temperatura e humidade, uma adaptação dos parâmetros de processo para condições laboratoriais individuais pode ser necessário (Figura 2).
   Nota: Para evitar que a gota de secagem (Figura 2B) permitir um caudal suficiente. Se houver uma baixa umidadty na atmosfera circundante, ajuste da umidade relativa ou aumentar a vazão. Diminuir a tensão até um cone de Taylor adequada ocorre (Figura 2A). Quando não existe uma solução na ponta (Figura 2C), aumentar a taxa de fluxo e reduzir a tensão até que uma gotícula ocorre. Em seguida, ajustar a tensão, a fim de estabelecer um cone de Taylor regular e estável (Figura 2A).
8. Após 30 seg / 60 seg / 90 seg de eletrofiação desligar a bomba de seringa. A fim de evitar a queda de gotas, esperar 10 segundos antes de desligar a fonte de alta tensão para libertar a pressão residual dentro da seringa.
9. Passos 6-8 podem ser realizados em diferentes tipos de materiais de filtro, tais como a poliamida, polipropileno e poliéster, malhas, não tecidos, papel, bem como preto para comparação.
10. Para produzir um não tecido mesh para os experimentos de estabilidade subseqüentes, use papel preto em vez de material filtrante e execute as etapas 5 a 7. Após 5 min de electrospinning, pareo processo tal como descrito no passo 8.

3. Pós-tratamento de malhas não-tecidos de seda

1. Um forno de pré-aquecimento a 60 ° C.
2. Coloque os suportes de filtro com eADF4 (C16) malhas não tecidos verticalmente e com uma distância mínima de 2 cm em um recipiente de vidro com fechadura. O recipiente deve ter duas aberturas que irão ser utilizados para introduzir posteriormente etanol e água.
   Nota: Ao fixar os materiais filtrantes, certifique-se de que a área necessária para os experimentos de permeabilidade não está danificado pelos grampos.
3. Ligação duas seringas de 60 ml, cheio com um álcool e um cheio com água, com tubos de silicone que apontam para o interior da parte inferior do contentor de pós-tratamento (Figura 3).
   Nota: A fim de ser capaz de remover o líquido do recipiente, após o tratamento, o lugar das aberturas dos tubos de tão perto quanto possível do fundo.
4. Colocar o recipiente de pós-tratamento no ovpt e adicionar 60 ml de etanol por meio de extrusão da seringa. Use um cronômetro para controlar a duração do tratamento.
5. Após 90 min de tratamento de vapor de etanol, remover o etanol, com a seringa a partir do vidro, e adicionar 60 ml de água a partir da segunda seringa.
6. Espere por mais 90 min, em seguida, retire a água e desligue o forno. A fim de evitar a condensação de gotículas, deixar o recipiente dentro do forno até que tenha arrefecido completamente.

4. Análise de aranha não tecidos malhas de seda

1. Prepare as malhas não tecidos de seda para testes de estabilidade em papel preto ou qualquer outro suporte removível. Corte dois quadros de papelão e ajustar fita adesiva dupla-pegajosa. Pressione um quadro para a seda não tecido mesh depositado em papel preto e usar um bisturi para cortar o excesso de fibras de seda (manter as fibras em excesso para posterior SEM-imaging). Retire cuidadosamente o quadro, a fim de destacar o não tecido do papel. Repita este passo com o segundo quadro(Figura 4).
2. Teste de mergulho prático: Corte um pedaço (1 cm ²⁾ de cada um, o pós-tratados e não-tratados de seda não tecido mesh e mergulhá-lo em água deionizada. O não-tratado não tecido de seda de malha irá dissolver imediatamente, enquanto que a malha não urdido tratado será estável (Figura 5). Depois de mergulhar, secar a amostra mergulhada e prepará-lo para SEM imagem.
3. A espectroscopia de infravermelhos transformada de Fourier (FTIR) e subsequente medição auto-desconvolução de Fourier (FSD): Transmitância: A fim de obter informações sobre as alterações estruturais das proteínas de seda sobre pós-tratamento das malhas, não tecidos, FTIR pode ser aplicada usando os parâmetros -mode, varredura de 800 a 4.000 ^cm-1, 60 acumulações são medidos e média para cada espectro, uma referência é medido por espectro. Para a análise quantitativa dos dados, pode ser empregue FSD (Figura 6 e Figura 7). Assim, as curvas são reduzidos ao ar dadoseA entre 1590 e 1705 centímetros ^-1 e uma correção de linha de base é realizada. Um ajuste de mínimos quadrados local é calculado de acordo com as posições de pico tomadas a partir de estudos anteriores (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1698 ^{cm-1) 22.}
4. Imagem MEV: SEM pode ser aplicado para estudar diâmetros de fibra e a morfologia das fibras de seda em diferentes substratos de filtro e para analisar a influência do pós-tratamento sobre a morfologia da fibra (Figura 8). Use ampliações de 5.000 a 25.000 x x para obter imagens bastante detalhadas.

5. Determinação da Permeabilidade ao ar

1. Coloque uma parte boa montagem do material do filtro na área de medição de um dispositivo de permeabilidade ao ar Akustron. Observação :: Se você usar outro tipo de dispositivo de permeabilidade ao ar, certifique-se de que preenche os requisitos da norma DIN 53 887, DIN 53 120, ISO 9237 e as normas ASTM D 737-96.
2. Empregar um dispositivo Akustron permeabilidade ao ar (ou qualquer outro, conforme ilustrado em 5.1). Se necessário calcular os dados normalizados [l / (m ² x seg)].
3. Repita pelo menos 10 vezes os passos 1 e 2 com diferentes partes de sua amostra e calcular a média aritmética (Figura 9).
   Nota: A permeabilidade ao ar de medição requer o contacto do dispositivo e a malha não urdida. Assim, um tratamento cuidadoso das amostras é essencial para prevenir a ruptura do delicado de seda de malha não urdido.

6. Determinação da eficiência do filtro

1. É uma máquina adequada com controlo de pressão e contador de partículas, tal como um calibrador de partículas (Universal Palas GmbH, Karlsruhe, Ger).
2. Coloque as amostras de filtro no dispositivo de retenção de partículas e uma medida (Figura 10). Aerosol: Di-etil-hexil-sebacat (DEHS); tamanhos de partículas: 0,3-3 mM, duração: 30 seg; velocidade do líquido: 2,350 cm / s; fluxo de ar: 3.400 m ³ / h.
   Nota: Lidar com a amostra com cuidado e não toque na superfície para evitar a destruição da malha não tecido e evitar qualquer tipo de poluição. Certifique-se de criar amostras suficientes de igual qualidade para medições de desempenho.

Representative Results

Eletrofiação de soluções de seda de aranha recombinantes, com concentrações de 10% w / v de HFIP resultou em fibras lisas, com diâmetros variando de 80 a 120 nm, permitindo a formação de malhas, não tecidos. Pós-tratamento com vapor de etanol não levou a alterações morfológicas conspícuas, que era, por isso, estabeleceu como uma forma adequada de não tecido de seda de pós-tratamento (Figura 8). As mudanças estruturais foram detectados utilizando FT-IR e subsequente FSD meio de bandas que foi realizado para analisar os picos contribuição individuais (Figura 6). Pode ser mostrado que o pós-tratamento conduz a um aumento em estruturas β folhas, enquanto o teor de α-und estruturas helicoidais aleatórios bobina decresce (Figura 7). Este resultado pode ser praticamente provado por meio de imersão um pós-tratado não urdido em água (Figura 5). Mesmo depois de uma semana, sem dissolução da malha não tecida irá ocorrer.

A fiação duração é o parâmetro mais importante relativo à aplicação de falsos tecidos de seda em materiais filtrantes, devido à queda de pressão baseado no aumento da densidade de fibras electrospun. Extendida fiação durações und assim um maior número de camadas de fibra, em resultado de uma diminuição exponencial da permeabilidade ao ar. Este efeito pode ser detectado por todos os materiais de substrato de filtro diferentes, antes e depois do pós-tratamento (Figura 9). Da mesma forma, a eficiência de filtração dos materiais de filtro de seda contendo de partículas sub-micrométricas aumenta (Figura 10). Enquanto durações fiação curtos (30 seg) ganhar eficiência filtro de baixa, durações de giro mais altas (90 sec) levam a uma maior eficiência.

Figura 1. Alta tensão elétrica (0-30 kV) i s aplicados a uma seringa cheia com uma solução de seda, e um contra-eléctrodo (0-20 KV) é colocado a uma distância de 8-20 cm. Esta configuração conduz a um campo electrostático forte, induzindo forças repulsivas na solução carregada. Se a tensão superficial é excedido, um cone de Taylor é formado, e um jacto fino irrompe da ponta. Após formação, as instabilidades de dobragem ocorrem no jacto causando mais estendendo-se o solvente se evapora, e uma fibra sólida é formada. Finalmente, a fibra é depositado aleatoriamente no contra-eléctrodo na forma de uma malha não urdida.

Figura 2. De fotografias de um cone de Taylor normal (A), uma gota seca (B), e os custos sem gotícula (C).

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Figura 3. Processo esquemático de vapor durante pós-tratamento. No primeiro passo, a câmara é cheia com o etanol, e a amostra é vaporizada a 60 ° C durante 90 min. A fim de suavizar as malhas, não tecidos para o tratamento subsequente, o etanol é removido e as fibras são cozinhados com vapor de água durante 90 min a 60 ° C. clique aqui para ver figura maior .

Figura 4. Fotografia de uma estrutura de papelão com anexas malhas, não tecidos de seda para ser utilizados para o pós-tratamento.

Figura 5. Electrospun e posteriormente pós-tratadas não tecida no estado seco (A) e em água (B).

Figura 6. Fourier auto-deconvoluídos espectro de absorção de uma amida de uma banda I não tratado (A) e um pós-tratado (B) não tecido de malha de seda de aranha. A linha sólida mostra a banda de absorção resultante dos picos de contribuição individuais (linhas pontilhadas), como derivado após deconvolução. A atribuição das respectivas curvas foi baseada em valores previamente publicados na literatura ^22. Clique aqui para ver a figura maior .

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Figura 7. Teor de estrutura secundária de malhas, não tecidos não-tratadas e pós-tratado eADF4 (C16).

Imagens Figura 8 SEM de electrospun eADF4 (C16) fibras em diferentes substratos de filtro:. Poliamida (PA), poliéster (PE), polipropileno (PP) e eADF4 puro (C16) fibras antes (S1) e depois (S2) pós- tratamento com vapor de etanol. Clique aqui para ver a figura maior .

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Figura 9. Ensaios de permeabilidade ao ar, antes de (A) e depois do pós-tratamento (B) das malhas, não tecidos de seda com vapor de etanol, aumentando os tempos de fiação conduzem a camadas mais, não tecidos, subsequentemente, a redução da permeabilidade do ar.

Figura 10. Eficiência Filtro de aerosol di-etil-hexil-sebacat em electrospun aranha de seda malhas não tecidos em poliamida materiais filtrantes em diferentes durações fiação, que influenciam a quantidade de camada de seda, depois de pós-tratamento com etanol.

Discussion

Os novos dispositivos de filtro deve permitir a redução do consumo de energia em geral em eficiências de filtração do ar constante do filtro ou superior. Aqui, esses dispositivos foram criados usando falsos tecidos feitos de seda de aranha. Devido a sua baixa tensão de superfície e elevada volatilidade, HFIP foi escolhido como um solvente adequado para o processo de electrospinning. Além disso, as soluções aquosas de seda têm sido testados em experiências anteriores, mas sem as fibras podem ser gerados. Aqui, seria essencial para o uso de aditivos, a fim de reduzir a tensão superficial e, assim, melhorar as propriedades da solução de fiação. O passo mais importante é ajustar as condições ea concentração de material utilizado e solvente da solução de fiação, fiação altura, tensão e velocidade de extrusão. Durante o desempenho, por exemplo, o entupimento da ponta pode ser impedida através do fornecimento da ponta da agulha com a humidade na forma de vapor de água, mas qualquer tipo de adições na configuração electrospinning podem posteriormente perturbaro processo sensível e campo eléctrico. Parâmetros de processo essenciais (concentração, a tensão, a distância, de humidade) foram determinados individualmente realização séries experimentais separado (dados não mostrados). Levando em consideração todos os parâmetros é fundamental para cuidar de um cone taylor contínua e processo de fiação para criar fibras uniformes.

A eficácia do filtro é um dos parâmetros mais importantes de materiais filtrantes. Este parâmetro é influenciado principalmente pela estrutura do material do filtro. Wovens herdar tamanhos de poro uniformes e de permeabilidade ao ar subsequentemente consistente. É crucial para criar malhas, não tecidos homogéneas sobre estes materiais de molde para encher os poros e para gerar um filtro de defeito zero. A eficiência do filtro nos filtros mostra uma dependência directa sobre a duração de fiação (das proteínas de seda), e, por conseguinte, o número de camadas de telas não tecidas. As lacunas entre as fibras individuais são constantemente cheio, o que permite a retençãof partículas menores.

Neste trabalho apresentamos um método para produzir um material de filtro romance com seda de aranha malhas não tecidos, mostrando alta eficiência do filtro. Portanto, esses filtros são candidatos promissores para uso futuro em sistemas de filtração de ar.