Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

الأداة المساعدة لمرحلة محددة في منتصف إلى أواخر Published: December 2, 2013 doi: 10.3791/50493
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa Carver College of Medicine

Summary

العزلة مرحلة محددة من منتصف إلى أواخر بصيلات ذبابة الفاكهة مفيد لمجموعة متنوعة من الأغراض. مثل بصيلات تطوير في الثقافة، والذي يسمح للتلاعب الجيني و / أو الدوائية أن تقترن في المختبر فحوصات التنمية والتصوير الحي. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام بصيلات للدراسات الجزيئية، مثل عزل مرنا والبروتين.

Abstract

ذبابة الفاكهة oogenesis أو تطوير جريب وقد استخدم على نطاق واسع للمضي قدما في فهم العمليات البيولوجية التنموية والخلايا المعقدة. وتصف هذه الورقة أساليب كيفية عزل بصيلات مرحلة منتصف إلى أواخر (المرحلة 10B-14) والاستفادة منها لتقديم رؤى جديدة في الأحداث الجزيئية والمورفولوجية التي تحدث خلال نوافذ ضيقة من الوقت التنموية. بصيلات معزولة يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من أساليب فنية تجريبية، بما في ذلك في المختبر فحوصات التنمية، التصوير الحية، وتحليل مرنا التعبير وتحليل لطخة غربية البروتينات. سوف بصيلات في المرحلة 10B (S10B) أو في وقت لاحق استكمال التطوير في الثقافة، وهذا يسمح لأحد أن الجمع بين اضطرابات وراثية أو دوائية مع تطوير في المختبر لتحديد الآثار المترتبة على مثل هذه التلاعبات على العمليات التي تحدث خلال فترات محددة من التنمية. بالإضافة إلى ذلك، لأن هذه المسام تطوير في الثقافة، هي مناسبة بشكل مثالي لأنها دراسات التصوير الحي، والتي غالبا ما تكشف عن آليات جديدة التي تتوسط الأحداث المورفولوجية. ويمكن أيضا أن تستخدم بصيلات معزولة عن التحليلات الجزيئية. على سبيل المثال، والتغيرات في التعبير الجيني التي تنجم عن الاضطرابات الوراثية يمكن تعريف للنوافذ التنموية المحددة. بالإضافة إلى ذلك، ومستوى البروتين، والاستقرار، و / أو تعديل ما بعد النقل الدولة خلال مرحلة معينة من التنمية جريب يمكن فحص من خلال تحليل لطخة غربية. وبالتالي، والعزلة مرحلة محددة من بصيلات ذبابة الفاكهة يوفر مصدرا غنيا للمعلومات في عمليات الحفاظ على نطاق واسع للتنمية والتشكل.

Introduction

ويتكون كل من المبيض ذبابة الفاكهة ~ 16 ovarioles، أو سلاسل من بالتتابع تستحق غرف البيض أو بصيلات. ويتكون كل جريب من بويضة واحدة، 15 خط الجرثومية المستمدة ممرضة أو دعم الخلايا، والخلايا الجسدية ~ 650 تسمى خلايا بصيلات (الشكل 1A). ينقسم ذبابة الفاكهة oogenesis إلى 14 مراحل محددة شكليا التنمية 1. ويلاحظ كل مرحلة من مراحل التنمية جريب عدة مرات ضمن ذبابة واحدة، مما يجعل من السهل نسبيا لعزل عدد كبير من بصيلات مرحلة محددة.

في منتصف إلى أواخر مراحل oogenesis (مراحل 10B-14) بشكل خاص مناسبة تماما للمرحلة العزلة (الشكل 1). في المرحلة 10B (S10B)، هو ممدود بصيلات بالكامل (أي طوله يساوي ذلك من المرحلة 14 (S14) جريب، انظر الشكل 1 والشكل 2H) ويتكون نصف طول المسام من خلايا ممرضةفي حين أن النصف الآخر هو البويضة (الشكل 1C). في هذه المرحلة الخضوع لخلايا ممرضة مثيرة الأكتين إعادة عرض، وتعزيز الأكتين القشرية وتوليد حزم متوازية من خيوط الأكتين 2. في الوقت نفسه، يبلغ عدد سكانها خلايا بصيلات، ووصف الخلايا الجاذبية، تهاجر بين الخلايا ممرضة والبويضة، ومجموعتين من الخلايا الظهرية جريب تصبح محددة للخضوع الهجرة لتشكيل الزوائد الظهرية والأجهزة التنفسية أنبوبي لالجنين 3 . الخلايا ممرضة ثم العقد (S11)، والضغط محتوياتها حشوية إلى البويضة في عملية تسمى خلية ممرضة الإغراق، والتي تنص على البويضة مع العوامل اللازمة لذلك لاستكمال مرحلة التطور الجنيني (1D الشكل). الخلايا ممرضة ثم الخضوع لموت الخلايا (S12-S13) 4، وتفرز خلايا بصيلات ونمط قشر البيض 5 (أرقام 1E-G). وهكذا، فإن نهاية oogenesis غنية مع إنمائية هامةعمليات التخلق د.

بصيلات معزولة منتصف إلى أواخر مرحلة (S10B-S14) يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من الأغراض، بما في ذلك تحليل الجزيئي. على سبيل المثال، مرنا من بصيلات نظموا يمكن أن تكون معزولة عن RT-PCR، ميكروأري، أو تحليلات الحمض النووي الريبي وما يليها. هذا يسمح احد للنظر في التعبير الجيني داخل نافذة التنموية قصيرة، مع عدد قليل من أنواع الخلايا الحالية، وتحديد كيفية تغير التعبير الجيني عن طريق الاضطرابات إما دوائية أو وراثية. ويمكن أيضا أن تستخدم مرحلة العزلة للنظر في البروتينات بواسطة النشاف الغربية. مثل هذا التحليل مهم لأنه يسمح احد لقياس مستوى البروتين التعبير في البرية من نوع مقابل المسوخ في مراحل معينة. في حين يمكن للمرء أن استخدام مناعي يحلل لتحقيق نتائج مماثلة، الكمي لمضان هو أقل قوة بسبب المتطلبات الصارمة أن كل بكسل تكون ضمن مجموعة خطية من الكشف 6. بالإضافة إلى ذلك، قد يوفر تحليل لطخة غربية معلومات أخرى، مثل هذاو إذا تم تعديل البروتين posttranslationally أو ما يعبر عنه من الإسوي لصق محددة. ويمكن أيضا أن تستخدم مراحل معزولة لمزيد من تنقية البروتين، بما في ذلك تجزئة التحت خلوية أو coimmunoprecipitation.

ويمكن أيضا مرحلة محددة جريب العزلة استخدامها لفي المختبر فحوصات التنمية 7 و 8 الحية التصوير. ستواصل معزولة بصيلات S10B-S13 S14 لتطوير لفي وسائل الإعلام ثقافة بسيطة (انظر أدناه). من المهم أن نلاحظ أن بصيلات S10A لن تقدم من خلال خلية ممرضة الإغراق باستخدام الظروف الثقافة مناقشتها في هذه المخطوطة. وقد استخدمنا S10B في المختبر فحوصات التنمية لتحديد دور البروستاجلاندين، سواء دوائيا وراثيا، في تنظيم الأكتين إعادة عرض باستخدام خلية ممرضة الإغراق والتنمية للقراءة عموميات 7،9. وبالمثل، فإن مراحل لاحقة من التطور ويمكن أيضا أن تكون معزولة لتحديد آثار العلاجات الدوائية أو رجل الوراثيةipulations على عمليات معينة مثل الهجرة الجاذبية الخلية، الظهرية أطرافهم الهجرة / تشكيل 10، وموت الخلايا ممرضة. مثل هذه المقايسات يمكن استخدامها لأداء شاشات التفاعل المهيمنة أو المقايسات، على سبيل المثال، في حين تغاير الزيجوت لطفرات في PXT أو fascin وحده لن يكون له تأثير على S10B التنمية في المختبر، وبصيلات من heterozygotes المزدوجة خلية ممرضة المعرض إلقاء العيوب وكتلة في التنمية 9.

بالإضافة إلى ذلك، لأن S10B-13 يمكن أن تتطور في الثقافة، وجميع العمليات التي تحدث خلال هذه الفترة يمكن ملاحظة من قبل الحية التصوير. هذا التصوير لا يمكن أن يؤديها مجرد استخدام الضوء المرسل (إذا كان أحد لا يهتم إلا تغييرات في التشكل الإجمالي) أو مع المجهري متحد البؤر باستخدام الذباب المعدلة وراثيا معربا عن تحقيقات الفلورسنت أو بصيلات ملطخة الأصباغ التصوير الحي. يتم استخدام التصوير الحي للمضي قدما إلى حد كبير فهمنا من العمليات التنموية. في الواقع، تخيل العيشز من بصيلات مرحلة متأخرة توسعت المعرفة الهجرة الظهرية أطرافهم، مثالا tubulogenesis 10. ونحن نتوقع أن تصوير حي لعمليات مرحلة متأخرة إضافية، بما في ذلك ديناميات الأكتين خلال خلية ممرضة الإغراق، وتقديم رؤى جديدة في هذه الأحداث التنموية. من المهم أن نلاحظ أنه في حين سوف S10A والمراحل الأولى من التنمية جريب لا تزال تتطور لتصبح S14 في الثقافة، ويعيش التصوير من الأحداث التي وقعت خلال تلك المراحل للتنمية هو ممكن باستخدام ظروف ثقافة بديلة 11-14 (انظر مناقشة لمزيد من المعلومات).

هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لعزل بصيلات مرحلة متأخرة لأي تطوير في المختبر والعيش التصوير، أو التحليلات الجزيئية (مرنا والبروتين العزلة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد ذبابة الفاكهة الى المرحلة قبل عزل

  1. جعل عجينة الخميرة الرطب من خلال الجمع بين 50 غرام من الخميرة الجافة النشطة مع 90 مل من الماء المقطر. تخلط مع ملعقة من الجمع بين. السماح للخليط الوقوف لمدة 30 دقيقة قبل ~ تقييم الاتساق. يجب أن يكون التناسق فقط سميكة بما فيه الكفاية على الانضمام إلى جانب قنينة يطير ولكن ليس الجري الجانب. لتحقيق الاتساق المطلوب قد يكون من الضروري أن تضيف ما يصل الى 10 مل من الماء إضافية أو كمية صغيرة من الخميرة الجافة. تخزين في حاوية مغطاة في 4 درجات مئوية. الخميرة تخزين يمكن استخدامها ل~ 1-2 أسابيع.
  2. جمع <24 ساعة الذباب البالغين من العمر (الذكور والإناث) من المورثات المطلوبة ووضعها في قارورة مع الطعام ذبابة بالإضافة إلى عجينة الخميرة الرطب طخت على الجانب من القارورة. ودرجة الحرارة التي يتم الاحتفاظ الذباب تختلف تبعا للتجربة. للتجارب روتينية، تتم المحافظة على الذباب في درجة حرارة الغرفة. في حين أن التجارب التي الجين هويجري بإفراط (overexpressed) باستخدام نظام UAS/GAL4 15 مايو تتطلب الحفاظ على الذباب عند 25 درجة مئوية أو أعلى، حسب الاقتضاء.
  3. توفير الذباب مع مسحة من معجون الخميرة الطازجة يوميا لمدة 2 ايام. ملاحظة: كما يتم تنظيم التنمية جريب بإحكام من قبل الحالة التغذوية للالطاير الإناث، فمن الضروري توفير الطاير مع الخميرة الغنية بالمغذيات عجينة لمدة 36 ساعة على الأقل قبل تشريح.

2. عزل أقام ذبابة الفاكهة مسام أواخر منتصف إلى

  1. السماح لوسائل الإعلام أن يأتي إلى درجة حرارة الغرفة (~ 30 دقيقة). إذا كان بصيلات نظموا ذاهبون لاستخدامها في المختبر لفحوصات التنمية، طازجة إعداد IVEM وسائل الإعلام (وسائل الإعلام غريس الحشرات، و 10٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني، و 1X البنسلين / الستربتوميسين). إذا كان بصيلات نظموا ذاهبون لاستخدامها في مرنا أو البروتين العزلة استخدام الحشرات إما نعمة أو IVEM سائل الإعلام. هام: درجة الحرارة وسائل الإعلام أمر بالغ الأهمية. إذا كان الإعلام هو الباردة على انها ستغيركل من الأكتين وcytoskeletons أنيبيب والتنمية كتلة.
  2. تخدير الذباب في القارورة yeasted عن طريق حقن ثاني أكسيد الكربون غاز 2 وتضع الأنثى 3-5 الذباب على وسادة تحت ذبابة CO 2. هام: لا تترك الإناث أكثر مما يمكن تشريح في فترة زمنية 10 دقيقة على لوحة الطاير ومدد التعرض لأول أكسيد الكربون يمكن أن يسبب العقم 2 والموت.
  3. ملء بئر واحدة من لوحة 9 بقعة مع وسائل الإعلام ووضعه على رأس السطح الداكن (قطعة من زجاج شبكي أسود يعمل بشكل جيد). تركز نطاق تشريح على الجزء السفلي من البئر.
  4. باستخدام ملقط دومون # 5 التقاط أنثى واحدة بيد واحدة (وهذا هو الأفضل القيام باستخدام يدك المهيمنة). غالبا ما يكون أسهل لالتقاط الإناث على الأجنحة والساقين والصدر أو البطن للانتقال. يغرق الأنثى في وسائل الإعلام مليئة جيدا. ضبط بؤرة المجهر عند الضرورة.
  5. باستخدام الزوج الثاني من ملقط عقد في اليد غير السائد، والاستيلاء على الإناث في نهاية الأمامي من البطنبحيث يتم وضع نهاية الخلفي نحو يدك المهيمنة (الشكل 2A). تأكد للحفاظ على الطاير المغمورة في وسائل الإعلام.
  6. مع يدك المهيمنة، استخدم ملقط للاستيلاء على بشرة في الجزء 2 المصطبغة معظم الخلفي ومزق بعيدا عن بقية البطن (أرقام 2B-C).
  7. باستخدام الملقط في اليد المهيمنة، الضغط بلطف نهاية الأمامي من البطن حتى المبيضين الظهور (أرقام 2D-E). إذا لزم الأمر، ووضع ملقط بين اثنين من المبيضين وتسحبهم من الذبيحة.
  8. إما نقل المبيضين لبئر جديد مع وسائل الإعلام الجديدة (الشكل 2F) أو إزالة الذبيحة إلى Kimwipe أو منشفة ورقية. هذا مهم بشكل خاص إذا كان يتم عزل بصيلات من أجل التنمية في المختبر.
  9. كرر حتى تم عزلها 3-5 أزواج من المبيضين. ملاحظة: ويتكون كل مبيض ~ 16 ovarioles أو سلاسل من النضج بصيلات بالتتابع. كل ovarioleويرد ضمن غمد العضلات.
  10. باستخدام الملازم دبوس والإبر زودت معهم، وسحب بلطف بعيدا المبيض عن طريق تشغيل الإبر بين ovarioles (الشكل 2G). وهذا في بعض الأحيان الإفراج عن بصيلات الفردية كذلك.
  11. يجب ovarioles الفردية والمراحل المورفولوجية تمييزها بسهولة التنمية جريب يكون الآن مرئية (الشكل 2G، مازحت بصرف النظر المبيض). الرجوع إلى الأرقام 1 و 2H للاختلافات المورفولوجية التي يمكن استخدامها للتمييز بين المراحل المختلفة. لعزل بصيلات التي تقع ضمن ovarioles سليمة والواردة في غمد العضلات لا يزال، استخدام إبرة لخفض عبر ovariole في الجزء الأمامي من بصيلات السابقة وفي الخلفي من جريب التالية المسام من الفائدة على الفور. وهذا كسر غمد العضلات ويمكن الآن بصيلات الاهتمام بعيدا أن تقطع بعيدا عن بصيلات المجاورة دون الإضرار بها. كما يتم فصل مراحل الفردية، نقل بصيلات من الفائدة، وذلك باستخدام ماصة الزجاج، وإلى بئر جديدة مع وسائل الإعلام الجديدة. هذا مهم خصوصا عندما عزل بصيلات من أجل التنمية في المختبر. ملاحظة: من المهم للضغط على لمبة ماصة قبل دخول وسائل الاعلام لمنع فقاعات الهواء من إعادة توزيع بصيلات الاهتمام في جميع أنحاء البئر. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان بصيلات يتم التمسك ماصة الزجاج، ويمكن precoated ماصة مع 3٪ ألبومين المصل البقري (BSA) من قبل pipetting الحل BSA صعودا وهبوطا عدة مرات والشطف مع وسائل الاعلام تشريح.
  12. مرة واحدة وقد تم عزل ما يكفي من بصيلات، والمضي قدما مع التجارب اللاحقة.

3. في المختبر تطوير S10B مسام

  1. عزل بصيلات S10B باستخدام بروتوكول مرحلة العزلة (الخطوة 2) في وسائل الإعلام IVEM. تأكد من أن يتم نقل بصيلات بسرعة بعيدا عن الحطام. كما سوف تستمر هذه بصيلات إلى أن تنضج، فمن IMPOrtant أن S10Bs يتم جمعها لمدة 30-60 دقيقة ثم توضع في وسائل الإعلام نضوج في الاختيار. ملاحظة: S10B بحاجة إلى أن تميز بعناية من بصيلات S10A (الشكل 1C مقارنة 1B)، وسوف بصيلات S10A لا تنضج في وسائل الإعلام الثقافة IVEM. في كل S10A وبصيلات S10B، ويتألف نصف طول خلايا الممرضة، والنصف الآخر هو البويضة، ولكن في S10B طول جريب هو مساوية لبصيلات S14.
  2. باستخدام ماصة الزجاج، ونقل 30 ~ بصيلات S10B في بئر من 24 لوحة جيدا زراعة الأنسجة. ملاحظة: تأكد للتحقق من أن كل من بصيلات نقله هي S10B ولم تنضج لS11.
  3. إعداد 1 ميكرولتر من وسائل الإعلام نضوج لكل بئر، أي وسائل الإعلام بالإضافة إلى IVEM الكواشف الدوائية.
  4. باستخدام ماصة الزجاج انسحبت *، وإزالة وسائل الإعلام بقدر من البئر (الخطوة 3.2) ممكن، وبسرعة إضافة وسائط نضوج في الاختيار. ملاحظة: من الضروري استخدام الزجاج سحبت نقطةETTE كما بصيلات نظموا يمكن اتخاذها بسهولة مع أي الماصات الزجاج أو نصائح ماصة مع Pipetman.
    * لجعل ماصات سحبت: 1) تسخين جزء رقيقة طويلة، الماصات الزجاج في لهب الموقد بنسن فقط حتى يبدأ الزجاج لتخفيف؛ 2) التحرك فورا ماصة للخروج من اللهب وسحب أفقيا لرسم ماصة في أنبوب فاينر، 3) كسر لتوليد نقطة غرامة. تنبيه: استخدام حماية العين كأجزاء من الزجاج قد يطير.
  5. كرر الخطوات من 3،1-3،4 عن العديد من الآبار كما يتطلب التجربة.
  6. تسمح المسام لتطوير ل> 10 ساعة لتصبح النتيجة تقدم التنموية تحت نطاق تشريح. ملاحظة: عادة ما يتم تسجيل التجارب في اليوم التالي لإتاحة الوقت الكافي للبصيلات لتطوير. S10B هو ~ 5 ساعة، S11 هو ~ 30 دقيقة، S12 هو ~ 2 ساعة، وS13 هو ~ 1 ساعة في مدة عند 25 درجة مئوية 1 والتنمية في درجة حرارة الغرفة وسوف يستغرق وقتا أطول قليلا. تجارب مماثلة لتلك التي وصفها لبصيلات S10B يمكن أن يكونتنفيذها باستخدام بصيلات S11-S13.

4. عزل مرحلة للتصوير لايف

  1. عزل بصيلات مرحلة متأخرة (S10B-14) يعبر عن علامة فلوري الاختيار باستخدام بروتوكول مرحلة العزلة (الخطوة 2) في وسائل الإعلام IVEM، بسرعة التحرك بصيلات بعيدا عن الحطام.
  2. نقل بصيلات الاهتمام في وسائل الإعلام الجديدة ومن ثم نقل بواسطة الزجاج ماصة لوحة بيتري أسفل ساترة. الحرص على إضافة وسائل الإعلام بحيث يصل فقاعات في منطقة أسفل ساترة ولكن لا تمتد.
  3. لفترة أطول الأفلام مرور الزمن، فمن الضروري في بعض الأحيان للحفاظ على الرطوبة داخل لوحة بيتري بإضافة طوى Kimwipe، مبلل بالماء، إلى حافة داخل لوحة بيتري. وضع غطاء على القمة.
  4. الصورة على مجهر مقلوب. سوف القرار مفصلة تتطلب متحد البؤر المجهري. فمن الضروري لتحقيق التوازن بين وتيرة التصوير، وقوة الإضاءة، وطول التصوير، وهذا سوف تحتاج إلى أن يعمل بشكل مستقل خارج عن كل لترأداة abeling والعملية التنموية.

5. عزل مرحلة لإعداد مرنا

  1. عزل بصيلات المرحلة الفردية باستخدام بروتوكول مرحلة العزلة (الخطوة 2) مع وسائل الإعلام إما نعمة أو IVEM.
  2. باستخدام ماصة الزجاج، ونقل مراحل الفرد من الاهتمام إلى آبار جديدة مع وسائل الإعلام، بل هو ممكن لجمع مراحل متعددة في آن واحد.
  3. إبقاء مرات جمع أقل من 1 ساعة. نقل بصيلات، وذلك باستخدام ماصة الزجاج، وإلى 1.5 مل أنابيب microfuge.
  4. تدور لفترة وجيزة في الأنبوب-ميكروسنتريفوج مصغرة لتكوير كل من المسام. باستخدام ماصة الزجاج سحبت (انظر الخطوة 3.4) إزالة بعناية كل من وسائل الإعلام. ملاحظة: في حالة استخدام حجم ميكروسنتريفوج كامل، وتدور باستمرار بصيلات على سرعة منخفضة.
  5. إضافة 100 ميكرولتر من Trizol وتطحن باليد ل~ 20 ثانية باستخدام مدقة البلاستيك. تدور باستمرار في كامل السرعة في microcentrifuge والتحرك Trizol إلى 1.5 مل microfuge أنبوب جديد والحرص على عدم تعكير صفو أي د مكعباتebris. المحل في -80 درجة مئوية.
  6. كرر الخطوات من 5،1-5،5 حتى تم الحصول على ما يكفي من بصيلات للتجربة. بشكل روتيني، ~ 75 S10B، ~ 75 S12، S14 و~ 100 ~ بصيلات تسفر عن 10 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.
  7. ذوبان الجليد العينات على الجليد. الجمع بين العينات، حسب الاقتضاء، في واحدة microfuge أنبوب وتبرزي حجم Trizol تصل إلى 800 ميكرولتر. المضي قدما في عزل الحمض النووي الريبي وفقا لتوجيهات من قبل الشركة المصنعة. هام: تذكر أن الدناز علاج الحمض النووي الريبي معزولة مع ريبونوكلياز الدناز الحرة.

6. عزل لمرحلة التنشيف الغربية

  1. سخن كتلة الحرارة إلى 100 درجة مئوية.
  2. عزل بصيلات المرحلة الفردية باستخدام بروتوكول مرحلة العزلة (الخطوة 2) مع وسائل الإعلام إما نعمة أو IVEM. ملاحظة: من الضروري لتحديد تجريبيا كم من مرحلة جريب خاصة وهناك حاجة لمراقبة كل بروتين معين. وأعرب عن البروتينات عالية 1-3 بصيلات S10B / جيد بما فيه الكفاية لرؤية إشارة قوية على لطخة غربية. ومع ذلك، فمن المهم لجعلعينة تمثيلية، على أن بصيلات من الإناث متعددة. وبالتالي، وعادة ما جمعت 15-20 بصيلات مرحلة معينة.
  3. نقل بصيلات، وذلك باستخدام ماصة الزجاج، إلى أنبوب microfuge 1.5 مل. تدور لفترة وجيزة في ميكروسنتريفوج-مصغرة لتكوير بصيلات (انظر الخطوة 5.4). إزالة بعناية جميع وسائل الإعلام باستخدام ماصة الزجاج سحبت (انظر الخطوة 3.4) وإضافة 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X و 50 ميكرولتر من العازلة 2X Laemmli.
  4. طحن باليد ل~ 20 ثانية مع مدقة البلاستيك. ملاحظة: المطاحن البلاستيك يمكن إعادة استخدامها لطحن عينات الغربية عن طريق الغسيل والتعقيم لهم.
  5. تغلي العينات لمدة 10 دقيقة في كتلة الحرارة.
  6. البرد لفترة وجيزة على الجليد وتدور في كامل السرعة لمدة 15 ثانية في microcentrifuge. إما تحميل على الفور على هلام SDS-PAGE أو تخزينها في -20 درجة مئوية. ملاحظة: إذا تم تخزين العينات، وتذكر أن reboil العينات قبل تحميل على هلام.
  7. إجراء تحليل لطخة غربية التالية البروتوكولات القياسية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عندما عزل مراحل معينة من التنمية جريب ذبابة الفاكهة فمن الضروري أن يكون قادرا على التمييز بدقة المراحل المورفولوجية المختلفة. وهذا هو التحدي نوعا ما لS10A وS10B، مثل خلايا البويضة وممرضة لكل يستغرق نصف طول المسام في هذه المراحل (الشكل 1B مقارنة 1C). ومع ذلك، بصيلات S10A هي أقصر في الطول من بصيلات S10B، حيث أن بصيلات S10B وممدود بالكامل، وبالتالي متساوية في الطول إلى بصيلات S14 (الشكل 1C مقارنة 1G). بالإضافة إلى ذلك، مجموعة فرعية من الخلايا الجسدية أو جريب البويضة خلال تسمى خلايا بصيلات الجاذبية تبدأ في الهجرة في فترة ما بين الخلايا ممرضة والبويضة في S10B. خلال S10B، والتي تأخذ ~ 5 ساعة، والخلايا ممرضة الخضوع دينامية إعادة الأكتين بحيث S11 في العقد خلايا الممرضة، والضغط محتوياتها حشوية إلى البويضة. وبالتالي في S11، المنطقة خلية ممرضة لديهاانخفضت بشكل ملحوظ، في حين أن بويضة وسعت (1D الشكل). في S12، ممرضة الخلايا تبدأ في الموت والخضوع لتأخذ على مظهر أكثر غموضا (الشكل 1E)؛ المثير للاهتمام، في الثقافة، وبقايا الخلايا ممرضة ظهريا حليقة في بصيلات S12 (انظر S12s في أرقام 3C'-D '). أثناء S13، المنطقة خلية ممرضة شفافة كما يجري الانتهاء موت الخلايا، وتشكيل الظهرية أطرافهم يحدث (الشكل 1F). بواسطة S14 فقط البويضة وخلايا بصيلات لا تزال قائمة، وتشكيل الظهرية أطرافهم كاملة (الشكل 1G).

في المختبر التنمية مقايسة يمكن استخدامها لتقييم عواقب مختلف العلاجات الدوائية والطفرات الوراثية على التنمية S10B وخلية ممرضة الإغراق (الشكل 3). تطوير S10Bs في ثقافة قوية، ولكن عددا من العوامل يمكن أن تؤدي إلى نتائج تجريبية الفقراء. في الشكل 3A،يتم توفير البيانات التجريبية من كلا ناجحة والتجربة الفاشلة. تجربة ناجحة هو الذي 80-100٪ من البرية من نوع بصيلات في وسائل الاعلام سيطرة خلية ممرضة كاملة الإغراق والتقدم إلى S12-14 (الشكل 3A، وزن 1). في بعض الأحيان من النوع البري ضوابط ستفشل، وهذا يعني أن أقل من 80٪ من بصيلات تطوير (الشكل 3A، وزن 2). يمكن أن يكون سبب هذا الفشل من جانب عدد من القضايا بما في ذلك: 1) عدم القدرة على التمييز بين S10A من بصيلات S10B (يرجى الرجوع إلى الشكلان 1 و 2)، 2) مشاكل وسائل الإعلام (درجة الحرارة، والعمر، الخ)، و / أو 3) كانت بصيلات تتعرض لالحطام لفترة طويلة جدا.

في المختبر تطوير S10Bs يمكن استخدامها في تركيبة مع العلاج الدوائي. لمثل هذه التجارب، فمن المهم أن الضوابط المخدرات، أي معاملة من نوع البرية بصيلات مع المخدرات، وتجرى مع كل تجربة لفعالية المخدرات و / أو ويركزأيون يمكن أن تتغير مع الوقت. لإجراء التجارب الدوائية، وأنها مريحة لتحليل نسبة مئوية من بصيلات النامية في العلاج الدوائي لأنه في وسائل الاعلام السيطرة، وهذا يتحكم الفروق الخلفية الوراثية طفيفة. غالبا ما يكون من المفيد لعلاج مع تركيز IC 50 من المخدرات، وهذا هو التركيز الذي يمنع 50٪ من البرية من نوع (اذا ستشغل) بصيلات تمر من خلية ممرضة الإغراق ومزيد من التطوير. وبالتالي، من المتوقع أن تكون 0.5 (الشكل 3B، المخدرات 1) نسبة لمن النوع البري بصيلات الشكل 3B هو مثال لكيفية المخدرات (الأسبرين) يمكن أن تصبح مركزة جدا (2 المخدرات؛ بسبب التبخر المحتمل أن المذيبات) وكتلة أكبر من 50٪ من النوع البري من بصيلات النامية. لمزيد من توضيح في المختبر تطوير الفحص، يتم توفير الصور بئرين تطوير بصيلات S10B. أرقام 3C وD توضيح بصيلات S10B في بدايةالفحص، في السيطرة أو الأسبرين يعالج (~ 2 مم) وسائل الاعلام. أرقام 3C 'و D' توضيح نهاية الفحص، وكشف عن أن أغلبية تحكم بصيلات المعالجة المتقدمة لS14، في حين أن الغالبية العظمى من الأسبرين بصيلات معاملة لم خلية ممرضة الانتهاء الإغراق.

يمكن أيضا فحص في المختبر التنمية أن تستخدم للكشف عن خلفيات وراثية التي هي أكثر حساسية لدواء معين. يحتوي الشكل 3E مثالين على ذلك. في المثال الأول، فشل الخلفية الوراثية (expt1، شريط أزرق) للتفاعل مع الأسبرين كما لا تزال نسبة ~ 0.5، وعلى العكس، في المثال الثاني، والخلفية الوراثية (expt2، شريط أحمر) يعزز من تأثير الأسبرين. وبالتالي، فإن تطوير فحص في المختبر يمكن استخدامها لتحديد عواقب الطفرات والكواشف الدوائية على الأحداث التنموية والمورفولوجية التي تحدث في أواخر oogenesis؛ بالإضافة إلى ذلك، فإن فحص يمكن استخدامها لتقييم كل الدوائية والتفاعلات الوراثية (انظر 9).

ويمكن أيضا مرحلة العزلة استخدامها لتصوير حي من العمليات التنموية. الشكل 4 مثالا من فيلم الوقت الفاصل بين بصيلات S10B معربا عن Utrophin-GFP، المجال ملزمة أكتين من Utrophin الإنسان تنصهر لبروتين الفلورية الخضراء. باستخدام هذه الأداة والتصوير، وأكتين تشكيل حزمة والتكثيف يمكن تصور. العديد من الأدوات المتاحة للتصوير الحية، بما في ذلك خطوط المعدلة وراثيا فخ بروتين 16،17، UAS مدفوعة الموسومة fluorescently علامات عضية (الميتوكوندريا، جولجي، الشبكة الإندوبلازمية، الخ.)، UAS مدفوعة الموسومة fluorescently علامات هيكل الخلية (الأكتين والأكتين البروتينات ملزمة، أنيبيب و أنيبيب ملزمة البروتينات)، خطوط المعدلة وراثيا تعرب عن أي الموسومة fluorescently البروتين من الفائدة، والأصباغ الحيوية (النيل الأحمر تسميات الدهون المحايدة، والعلامات ايدو تكرار الحمض النووي، FM4-64 التسميات الأغشية).

ove_content "> التحليلات الجزيئية يمكن القيام بها باستخدام المراحل المنعزلة من بصيلات ذبابة الفاكهة. لتحليل البروتين النشاف الغربية، فمن الضروري تحديد تجريبيا كم من بصيلات، لمرحلة معينة من التطور، هناك حاجة لمراقبة البروتين من الفائدة. الشكل 5 هو مثال على كيفية تخفيف بالتتابع البروتين المحللة مركزة لتحديد عدد من بصيلات S10B اللازمة لمراقبة بروتين معين، Fascin. في هذه الحالة واحدة S10B جريب كافية لمراقبة هذا البروتين عن طريق النشاف الغربية.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط تصف التكوين الخلوي للبصيلات ذبابة الفاكهة والصور التي توضح الفرق المورفولوجية من منتصف إلى أواخر مرحلة ذبابة الفاكهة فلlicles. A. مخطط تصور تركيبة الخلوية من جريب S10A. BG. صور الممثل بصيلات S10A-S14 ذبابة الفاكهة التي يتم التقاطها باستخدام جهاز ستيريو تشريح النطاق. تتكون بصيلات ذبابة الفاكهة من 16 المشتقة من خلايا سلالة الجرثومية: 1 بويضة (أحمر، A) و 15 ممرضة أو دعم الخلايا (الأصفر، A)، والتي تحيط بها ~ 650 الخلايا الظهارية المستمدة جسديا (الأبيض والأرجواني، والأزرق السماوي، و ). في S10A، ويتألف نصف طول المسام من خلايا الممرضة (قوس الصفراء، B)، والتي تغطيها الخلايا تمتد جريب (أرجواني في A)، ويتكون النصف الآخر من البويضة (النجمة الحمراء ، B)، والتي يتم تغطيتها من قبل خلايا بصيلات الجسم الرئيسي (أبيض في A). في S10B، خلايا الممرضة (قوس أصفر، C) والبويضة (النجمة الحمراء، C) كل يؤلف نصف جنيهngth من المسام، ولكن طول العام للجريب الآن مساوية لبصيلات S14 (قارن C إلى G). أثناء S11، خلايا الممرضة (قوس أصفر، D) الضغط بسرعة محتوياتها حشوية في البويضة التمطيط (النجمة الحمراء، D) في / عملية تعتمد على الميوسين أكتين تسمى خلية ممرضة الإغراق. بواسطة S12، البويضة (النجمة الحمراء، E) وممدود تماما كما خلية ممرضة الإغراق هو تظل كاملة وإلا بقايا خلايا الممرضة (قوس أصفر، E). بقايا خلايا الممرضة (قوس أصفر، F) موت الخلايا كاملة في S13. S14 يمثل جريب ناضجة تماما، والذي يتكون من بويضة (النجمة الحمراء، G)، والخلايا الجسدية، وقشر البيض، بما في ذلك الزوائد الظهرية (السهام البيضاء، G). B. مقياس بار = 0.1 مم.

الرقم 2 الشكل 2. صور تقديم لمحة عامة عن تشريح المبيض وبصيلات العزلة. A. يغرق الطاير في وسائل الإعلام تشريح وتوجيهه بحيث يقام عليها، بواسطة ملقط، في اليد غير السائد. B. استخدام اليد المهيمنة، والاستيلاء على بشرة في الخلفي من البطن. C. سحب إهاب قبالة، كشف المبيضين (السهم الأصفر). D. العمل من الأمامية من البطن نحو الخلفي، الضغط بلطف على البطن الإفراج المبيضين (السهم الأصفر). E. فصل المبايض (السهم الأصفر) من أي بشرة المتبقية (رأس السهم الأحمر) و / أو الأعضاء الداخلية (السهام البيضاء). نقل F. المبيضين معزولة إلى الطازجة التي تحتوي على وسائل الإعلام بشكل جيد تشريح. G. ندف بصرف النظر المبيضين، وذلك باستخدام الإبر تشريح، لفضح متصلينبصيلات vidual (قارن المبيض سليمة (أعلى) لفصل المبيض (القاع). النقاط رأس السهم الأبيض إلى S10B جريب طعن، مثال على المسام التي لا ينبغي أن تستخدم لتجارب لاحقة. H. تحديد المراحل المورفولوجية الفائدة (مراحل 10A -14 (S10A-S14) معروضة).

الرقم 3
الشكل 3. أمثلة في المختبر فحوصات التنمية. A. الرسم البياني لنسبة S10B بصيلات بأن التنمية التامة في الثقافة. وزن 1 مثال التنمية المتوقع من النوع البري بصيلات S10B (96٪ النامية)، في حين أن وزن 2 مثالا للتنمية الفقراء في الثقافة (68٪ النامية). ونحن عادة تجاهل التجربة كاملة إذا كانت التنمية من النوع البري بصيلات S10B التحكم في وسائل الإعلام هو أقل من 80٪. B. 50 IC للأسبرين إلى البلدان النامية نسبة السيطرة في وسائل الإعلام. وIC 50 هو تركيز الذي يمنع 50٪ من بصيلات S10B من البلدان النامية، وهذا يعني يجب أن تكون القيمة من نوع البرية ~ 0.5. 1 المخدرات هو مثال على نسبة من النوع البري المتوقع (0.52)، في حين المخدرات 2 هو مثال على ما يحدث عندما يكون تركيز الدواء قوي جدا (0.37). CD. صور في المختبر آبار تطويرية. CC '. مراقبة المعالجة. DD '. الأسبرين يعالج (~ 2 مم). CD. صورة من S10Bs في بداية الفحص. C'، D '. صورة بصيلات عند نقطة نهاية الفحص. معاملة السيطرة بصيلات S10B تطوير لS14s في الثقافة (C ')، في حين تفشل غالبية الأسبرين يعالج بصيلات لاستكمال خلية ممرضة الإغراق (D'). 50 IC للأسبرين إلى البلدان النامية نسبة السيطرة في وسائل الإعلام. هذا مثال من تجربتين يبحث عن الدوائي التفاعلات. وexpt1 (الشريط الأزرق) متحولة لا يغير من تأثير IC 50 للأسبرين (0.57)، في حين أن expt2 (شريط أحمر) متحولة يعزز تأثير الأسبرين (0.16).

الرقم 4
الشكل 4. مثال يوضح استخدام معزولة S10B بصيلات للتصوير الحية. AF. التوقعات القصوى من 3 شرائح من الوقت الفاصل بين ض أكوام من جريب S10B معزولة عن Utrophin :: GFP معربا عن الذباب المعدلة وراثيا (SQH-Utrophin :: GFP). A'-F '. إدراجات تضخيم تسليط الضوء على خلية واحدة من ممرضة A- F. AF '. F-الأكتين (Utrophin :: GFP)، والأبيض. A، A'. الوقت (ر) = 0 دقيقة. B، B '. ر = 20 دقيقة. C، C'. ر = 40 دقيقة. D، D '. ر = 60 دقيقة. E، E'. ر = 80 دقيقة. F، F '. ر = 100 دقيقة. في نقطة الوقت الأولي، خيوط الأكتين قصيرة يمكن ملاحظة توسيع الداخل من أغشية الخلايا ممرضة (A، A '). هذه خيوط الأكتين استطال طوال الوقت المبكر نقاط (BC 'مقارنة A، A') حتى يتم ممدود بالكامل (D، D '). في نقطة وقت لاحق، هذه خيوط الأكتين ممدود بالكامل ثم تقصير وتتكثف في جميع أنحاء الخلية ممرضة الإغراق (EF ') A. مقياس بار = 50 ميكرون. أ ". شريط مقياس = 10 ميكرون.

_upload/50493/50493fig5highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg "/>
. الرقم 5 توضيحات لكيفية تحديد عدد بصيلات اللازمة لفحص بروتين معين عن طريق تحليل لطخة غربية هذا هو لطخة غربية تبحث في التعبير Fascin في بصيلات S10B (1:20، SN 7C، كولي، L.؛ دراسات الإنمائية البنك هجين (DSHB)، التي وضعت تحت إشراف معاهد الصحة القومية والتي تحتفظ بها جامعة ولاية ايوا، قسم الأحياء، مدينة أيوا، IA، 52242). الأرقام في أعلى تمثل العدد التقريبي لبصيلات S10B تحميلها في الممر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وتتكون بصيلات ذبابة الفاكهة فقط عدد قليل من أنواع الخلايا، مما يجعلها مثالية لكلا المورفولوجي والتحليلات الجزيئية. وعلاوة على ذلك، ونظرا لهيكل المبيض، فمن السهل نسبيا الحصول على أعداد كبيرة من مراحل محددة للتنمية جريب مع نطاق تشريح المشتركة والحد الأدنى من التدريب. حيث أن كل مرحلة يمثل نافذة زمنية قصيرة، يمكن أن مرحلة العزلة تقديم رؤى الجزيئية كبيرة في العمليات التنموية التي تحدث خلال تلك المرحلة. على سبيل المثال، وقد استخدمنا منتصف إلى أواخر مرحلة جريب العزلة لوصف التغييرات التعبير الجيني التي تحدث أثناء S10B، S12، S14 و18. ويشير هذا التحليل من المحتمل أن تساهم في التنمية المسام، وعلى وجه الخصوص، وتشكيل قشرة البيضة عدد من الجينات uncharacterized سابقا.

يمكن أن مرحلة العزلة تقديم رؤى درامية في الأحداث الصرفي من خلال التصوير الحي. هذا التصوير لا يمكن أن يؤديها على قناة مراحل ل التنمية جريب ذبابة الفاكهة. في حين أن التركيز في هذا العمل هو S10B-14، ويشار القراء على المقالات التالية ليعيش التصوير من المراحل السابقة: germarium 13، جريب استطالة 19، والمرحلة 9 11،12،14. الشروط الثقافة المستخدمة في هذه الدراسات تختلف عن تلك التي تمت مناقشتها في هذا العمل. على وجه التحديد، وتستخدم هذه الدراسات شنايدر الحشرات وسائل الإعلام مع مستويات مختلفة من FBS (2،5 حتي 15٪) وكذلك إضافة الأنسولين 11-13،19، وفي بعض الحالات، إضافة مزيد من طرهالوز، الميثوبرين، 20 hydroxyecdysone، و الأدينوزين نازعة الأميد 14. من المهم أن نشير إلى أن هذه الدراسات التصوير الحي تقدمت بشكل كبير من فهمنا للأحداث التي تحدث خلال هذه المراحل المبكرة من التنمية. ومع ذلك، يمكن لهذه المسام مرحلة مبكرة لا تقدم على طول الطريق إلى المرحلة النهائية من تطوير المسام، S14. على العكس، سوف S10B-13 لتطوير S14 في الثقافة.

ove_content "> وخلال S10B-S14 العمليات المورفولوجية كثيرة تحدث التي يمكن دراستها عن طريق التصوير الحي. على سبيل المثال، والتصوير الحية يمكن استخدامها لدراسة عملية الخلية ممرضة الإغراق، العملية التي الخلايا الممرضة ضغط محتوياتها حشوية في البويضة لتزويده كل ما يحتاج لإكمال مرحلة التطور الجنيني. خلية ممرضة الإغراق يمكن ملاحظتها من خلال الوقت الفاصل بين التصوير باستخدام الضوء المنقولة 7 أو عن طريق التصوير متحد البؤر باستخدام خطوط المعدلة وراثيا معربا عن علامات الفلورسنت (انظر الشكل 4). استمرار استخدام التصوير الحي ومن المتوقع أن تقديم رؤى جديدة في ديناميات هيكل الخلية اللازمة لخلية ممرضة الإغراق. العيش التصوير من مراحل لاحقة وقد تقدمت أيضا فهمنا للبراعم أطرافهم الظهرية الهجرة وtubulogenesis 10.

في تطوير المختبر من بصيلات S10B-S13 يمكن استخدامها لتحديد الآثار المترتبة على كل من الكواشف الدوائية والتلاعب الجيني على العمليات تحدثيرن خلال هذا الوقت. وقد استخدمنا في تطوير المختبر من بصيلات S10B لإنشاء دور البروستاجلاندين في تنظيم خلية ممرضة الإغراق 7. بعد ذلك لقد تم استخدام هذا الاختبار لأداء شاشة الدوائية التفاعل، على وجه التحديد، لقد تم اختبار إذا فقدان نسخة واحدة من منظم يعزز الأكتين أو يقمع الخلية ممرضة إلقاء العيوب بسبب فقدان البروستاجلاندين. وقد كشفت هذه الشاشة عددا من الأهداف المفترضة المصب (9 و شركة سبراكلين، ماير، وبوق، بيانات غير منشورة). ويمكن أيضا أن تستخدم الفحص لدراسة التفاعلات الوراثية من خلال تقييم العيوب التنموية، مثل كتلة في الخلية ممرضة الإغراق، وذلك بسبب تغاير الزيجوت لمدة العوامل المختلفة (للحصول على مثال هذا راجع 9).

في حين عزل منتصف إلى أواخر مرحلة بصيلات ذبابة الفاكهة هو عملية بسيطة نسبيا، وهناك عدد من العوامل الحاسمة للنجاح الأمثل. الأولى، إعداد الذباب هومهم جدا. فمن الأفضل للحفاظ على المورثات مختلفة من الذباب في مماثلة كشرط ممكن، أي عدد من الذباب في قارورة، ونسبة الإناث إلى الذكور (نسبة 2:1 مثالية)، وتقديم الطازجة والخميرة الرطب باستمرار. فإن التغذية (الخميرة الرطب) والوقت تشريح تغيير انتشار مراحل مختلفة من التنمية. وجدنا أنه عندما يتم تغذية الذباب باستمرار في الصباح، وأكثر S10Bs يمكن أن تكون معزولة في الصباح، في حين أن أكثر S12s موجودة في فترة ما بعد الظهر. ومن العوامل الحاسمة الثاني هو وسائل الإعلام. في المختبر لتطوير والتصوير الحي من الضروري إعداد وسائل الاعلام IVEM الطازجة. بالإضافة إلى ذلك، يجب على وسائل الإعلام تأتي إلى درجة حرارة الغرفة مع وسائل الإعلام والبرد تغيير cytoskeletons، سواء الأكتين والأنابيب الدقيقة، وبالتالي تعطيل مزيد من التطوير. من المهم أيضا للحفاظ على بصيلات بعيدا عن الحطام. في بعض الأحيان، أثناء تشريح، فإن الأمعاء يخرج مع المبيضين. وقد وجدنا أنه إذا تمزق الأمعاءويتم الاحتفاظ بصيلات في وسائل الإعلام الملوثة، من غير المحتمل أن تتطور في الثقافة بصيلات. كما تواصل لتطوير بصيلات في الثقافة، لا بد من إعادة التحقق من التدريج بعد تشريح قبل الشروع في المختبر إما التنمية أو التحليلات الجزيئية. أخيرا، من المهم أن يكون الضوابط المناسبة لهذه التجارب. للتنمية في المختبر، فمن الضروري استخدام النوع البري لاختبار بصيلات أن وسائل الإعلام يسمح للتطور الطبيعي (80-100٪ ممرضة خلية كاملة الإغراق)، والتي لاختبار الكواشف الدوائية التصرف كما هو متوقع (انظر الشكل 3).

في الختام، يمكن عزل منتصف إلى أواخر بصيلات المرحلة ذبابة الفاكهة توفر نظرة كبيرة في العمليات التنموية من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات التجريبية.

جدول الكواشف محددة والمعدات:

اسم كاشف شركة قطعدد alogue تعليقات (اختياري)
الخميرة الجافة النشطة جينيسي العلمية 62-103 أي مصدر من الخميرة الجافة بالموقع على ما يرام
غريس الحشرات وسائل الإعلام ونزا 04-457F
الحرارة المعطل مصل بقري جنيني أتلانتا البيولوجية S11050H ينبغي لأي الحرارة المعطل FBS العمل
10X القلم / بكتيريا GIBCO / إينفيتروجن 15140-122
دبوس الملازم وإبر تيد بيلا، شركة 13561-10
لوحة الفور، تسعة حسنا كورنينج 7220-85
# 5 ملقط دومون أدوات العلوم الجميلة 11252-20
24 لوحات متعددة جيدا بيكتون ديكنسون 35 3226 أي 24 يجب أن تعمل جيدا الأنسجة صحن الثقافة
ساترة أطباق أسفل (35 ملم) شركة ماتيك P35G 1.0-14-C وسوف تعتمد على سمك ساترة المجهر / الهدف المستخدمة
الماصات الزجاج كورنينج 7095B-5X (لنقل بصيلات)
7095B-9 (لإنتاج ماصات سحبت)
مدقة العينة (1.5 ميكرولتر؛ ريبونوكلياز / الدناز الحرة) المنتجات البحثية الدولية 199228 أي مدقة البلاستيك الذي يناسب 1.5 أنابيب microfuge ميكرولتر يمكن استخدامها
Trizol إينفيتروجن 15596-018

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

نود أن نشكر توماس Lecuit (SQH-Utrophin :: خط GFP)، ومركز بلومنجتون المالية، والدراسات هجين البنك التنموي للمواد. نشكر كذلك جميع أعضاء مختبر بوق للمناقشات وانتقادات مفيدة للمخطوطة. بتمويل من المؤسسة الوطنية للعلوم الأموال بدء من قسم التشريح وبيولوجيا الخلية MCB-1158527، وجامعة ولاية ايوا أيد هذا العمل. المعاهد الوطنية للصحة دكتوراه مسبقا تدريب المنحة الدوائية العلوم T32GM067795 بدعم AJS. وقدم دعم تخزين البيانات عن طريق تكنولوجيا المعلومات والاتصالات، والتي يتم تمويلها من خلال CTSA بدعم من المركز الوطني لبحوث الموارد والمركز الوطني للنهوض بالحركة العلوم والمعاهد الوطنية للصحة، من خلال منحة UL1RR024979.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Genesee Scientific 62-103 Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media Lonza 04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11050H Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep Gibco/Invitrogen 15140-122
Pin Vises and Needles Ted Pella, Inc. 13561-10
Spot Plate, Nine Well Corning 7220-85
#5 Dumont forceps Fine Science Tools 11252-20
24 multi-well plates Becton Dickinson 35 3226 Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm) MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes Corning 7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes - long Corning 7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) Research Products International 199228 Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol Invitrogen 15596-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).
  2. Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
  3. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
  4. McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
  5. Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
  6. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
  7. Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  9. Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
  11. Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
  12. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
  13. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
  14. Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  16. Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
  17. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
  18. Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
  19. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 82،
الأداة المساعدة لمرحلة محددة في منتصف إلى أواخر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; جريب عزل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Spracklen, A. J., Tootle, T. L. The… More

Spracklen, A. J., Tootle, T. L. The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation. J. Vis. Exp. (82), e50493, doi:10.3791/50493 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter