Summary
Стадия конкретных изоляция середине-конце Drosophila фолликулов полезна для различных целей. Такие фолликулы развиваются в культуре, что позволяет генетических и / или фармакологических манипуляций, чтобы использоваться в сочетании с в пробирке анализов развития и живого изображения. Кроме того, фолликулы могут быть использованы для молекулярных исследований, таких как изолирующий мРНК и белок.
Abstract
Drosophila оогенез или развитие фолликула широко используется для продвижения понимания сложных развития и клеточных биологических процессов. Это методы статья описывает, как изолировать середине-конце этапа фолликулы (Стадия 10В-14) и использовать их, чтобы обеспечить новому взглянуть на молекулярном и морфологических событий, происходящих во время жесткой окон времени развития. Изолированные фолликулы могут быть использованы для различных экспериментальных методов, в том числе в пробирке анализов развития, живого изображения, анализа экспрессии мРНК и Вестерн-блоттинга белков. Фолликулы на стадии 10B (S10B) или более поздней версии завершит разработку в области культуры; это позволяет объединить генетические или фармакологические возмущения с развитием в пробирке, чтобы определить последствия таких манипуляций на процессы, происходящие в определенные периоды развития. Кроме того, поскольку эти фолликулы развиваются в культуре, они идеально подходят для изучения живого изображения, Которые часто показывают новые механизмы, которые опосредуют морфологические события. Изолированные фолликулы также могут быть использованы для молекулярных анализов. Например, изменения в экспрессии генов, которые являются результатом генетических возмущений может быть определен для конкретных окон развития. Кроме того, уровень белка, стабильность, и / или посттрансляционная состояние модификация в течение определенного этапа развития фолликула может быть рассмотрено через вестерн-блот анализа. Таким образом, изоляция стадиеспецифический из Drosophila фолликулов обеспечивает богатый источник информации в широко консервативных процессов развития и морфогенеза.
Introduction
Каждый дрозофилы яичников состоит из ~ 16 овариол или цепочек последовательно созревания яиц камер или фолликулов. Каждый фолликул состоит из одного ооцита, 15 зародышевой линии, полученные медсестра или поддерживающих клеток и ~ 650 соматических клеток, называемых фолликул клеток (фиг. 1A). Drosophila оогенез разделена на 14 морфологически определенных стадиях развития 1. Каждый этап развития фолликула наблюдается много раз в пределах одного лету, что делает его относительно легко изолировать значительное количество сценических конкретных фолликулов.
В середине-конце этапы оогенезе (Этапы 10B-14) особенно хорошо подходят для изоляции стадии (рис. 1). В Этап 10B (S10B), фолликул полностью вытянута (т.е. его длина равна стадии 14 (S14) фолликула, см. рисунок 1 и рисунок 2H) и половины длины фолликула состоит из питающих клетокв то время как другая половина является ооцитов (рис. 1С). На данном этапе медсестра клетки подвергаются драматический актина ремонт, укрепление корковой актин и генерации параллельных пучков нитей актина 2. В то же время, население ячейки стручка, называется центростремительные клетки, мигрируют в между питающих клеток и яйцеклетки, и два спинных группы ячейки стручка стать указанный пройти миграции для формирования спинные придатки, трубчатые дыхательные аппараты для эмбриона 3 . Медсестра клетки затем контракт (S11), сжимая свои цитоплазматические содержимое в яйцеклетку в процессе, называемом медсестра клеток демпинга, который обеспечивает яйцеклетки с виду факторы, необходимые для того, чтобы завершить эмбриогенеза (рис. 1D). Медсестра клетки затем пройти гибель клеток (S12-S13) 4, и фолликул клетки секретируют и рисунок на яичную скорлупу 5 (рис. 1E-G). Таким образом, конец оогенезе богат важной ап развитияг морфогенетические процессы.
Изолированные середине-конце этапа фолликулы (S10B-S14) может быть использован для различных целей, в том числе молекулярных анализов. Например, мРНК из фолликулов, организованных могут быть выделены для ОТ-ПЦР, микрочипов, или РНК-SEQ анализов. Это позволяет смотреть на экспрессии генов в течение короткого окна развития, с помощью всего нескольких типов клеток, присутствующих, и определить, как экспрессия генов изменяется либо фармакологических или генетических возмущений. Стадия изоляция может также использоваться, чтобы смотреть на белках с помощью вестерн-блоттинга. Такой анализ важен, поскольку он позволяет количественно уровень экспрессии белка дикого типа по сравнению с мутантами на определенных этапах. Хотя можно было бы использовать иммунофлуоресцентного анализа для достижения аналогичных результатов, количественное определение флуоресценции менее надежными из-за строгих требований, которые все пиксели быть в пределах линейного диапазона обнаружения 6. Кроме того, вестерн-блот анализ может предоставить другую информацию, напримерс если белок посттрансляционно изменены или выражается с определенной изоформы сплайсинга. Изолированные этапы также могут быть использованы для дальнейшей очистки белка, в том числе внутриклеточного фракционирования или коиммунопреципитации подтверждено.
Стадия конкретных изоляции фолликул также может быть использован для в пробирке анализов развития 7 и живого изображения 8. Изолированные S10B-S13 фолликулы будут и впредь развиваться на S14 в простой питательных сред (см. ниже). Важно отметить, что S10A фолликулы не будет прогрессировать через медсестры клетки сброс с использованием условий культивирования, обсуждаемые в этой рукописи. Мы использовали S10B в пробирке анализов развития определить роль простагландинов, как фармакологически и генетически, в регулировании актина ремоделирования с помощью медсестры ячейку демпинг и развитие как прочитанные-аутов 7,9. Точно так же более поздних стадиях развития могут быть также выделены для определения последствий фармакологического лечения или генетической человекаipulations по конкретным процессов, таких как центростремительной миграции клеток, спинной придатком миграции / формирования 10, и смерти медсестры клеток. Такие анализы могут быть использованы для выполнения доминирующие экраны взаимодействия или анализов, например, в то время как гетерозиготность мутаций в PXT или fascin только не имеют никакого влияния на S10B развития в пробирке, фолликулы от двойных гетерозигот экспонат медсестра клеток демпинговым дефекты и блок в развития 9.
Кроме того, поскольку S10B-13 может развиваться в культуре, все процессы, которые происходят в это время можно наблюдать живой-изображений. Такая процедура может быть проведена просто с помощью проходящего света (если интересоваться только в грубых изменений в морфологии) или с конфокальной микроскопии с использованием трансгенных мух, выражающие флуоресцентных зондов или фолликулов, окрашенные в прямом эфире изображений красителей. Онлайн изображений используется существенно продвинуть наше понимание процессов развития. Действительно, жить Imaginг поздней стадии фолликулов расширила знания спинной придаток миграции, пример тубулогенеза 10. Мы ожидаем, что жить изображений дополнительных поздней стадии процессов, в том числе динамики актина во время медсестра клетки демпинговым, обеспечит новые идеи этих событий в развитии. Важно отметить, что в то время как S10A и ранние этапы развития фолликула не будет продолжать развиваться в S14 в культуре, жить-визуализации событий, происходящих в течение этих стадиях развития возможно с помощью альтернативных условиях культивирования 11-14 (см. Обсуждение для более информация).
Здесь мы предлагаем подробные протоколы для изоляции поздней стадии фолликулы либо развития в пробирке и жить-визуализации или молекулярного анализа (мРНК и изоляции белка).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка дрозофилы до стадии изоляции
- Сделать влажную пасту дрожжей путем объединения 50 г активных сухих дрожжей с 90 мл дистиллированной воды. Смешайте с помощью шпателя, чтобы объединить. Дайте смеси постоять ~ 30 минут прежде, чем оценки соответствия. Консистенция должна быть достаточно толстой, чтобы присоединиться к стороне лету флакона, но не бежать вниз по склону. Для достижения желаемой консистенции может быть необходимо добавить до 10 мл дополнительным количеством воды или небольшого количества сухих дрожжей. Храните в закрытом контейнере при 4 ° С. Хранится дрожжи могут быть использованы в течение ~ 1-2 недели.
- Соберите <24 часа в сутки старые взрослых мух (мужчин и женщин) желаемого генотипов и положил их в сосуд с лету еды плюс мокрой дрожжей пасты размазанной на стороне флакона. Температура, при которой мухи поддерживаются будет варьировать в зависимости от эксперимента. Для рутинных экспериментов, мухи выдерживают при комнатной температуре. В то время как эксперименты, в которых генбудучи избыточно экспрессируется с использованием системы UAS/GAL4 15 мая требуют поддержания мух при 25 ° С или выше, по мере необходимости.
- Обеспечить мух со свежим мазке дрожжей пасты в день в течение 2-х дней. ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку развитие фолликула жестко регулируется состояние питания женского лету, очень важно обеспечить муху с богатых питательными веществами дрожжевого теста, по крайней мере 36 ч до вскрытия.
2. Изоляция Середина-конце Постановка Drosophila фолликулов
- Разрешить СМИ до комнатной температуры (~ 30 мин). Если в постановке фолликулы будет использоваться для в пробирке анализов развития, недавно подготовить IVEM СМИ (насекомых СМИ Грейс, 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки, и 1x пенициллина / стрептомицина). Если в постановке фолликулы будет использоваться для мРНК или изоляция белок использовать либо насекомое Грейс или IVEM СМИ. ВАЖНО: Температура теплоносителя имеет решающее значение. Если носитель холодно измениткак актин и микротрубочки цитоскелетом и развитие блока.
- Обезболить мух в дрожжевого флакона путем введения CO 2 газ и разместить 3-5 женского мух на лету площадку под CO 2. ВАЖНО: Не оставляйте больше женщин, чем можно разрезать в период времени 10 мин на лету площадку как Длительное воздействие СО 2 может вызвать бесплодие и смерть.
- Заполните одну лунку 9-точечной пластины со средствами массовой информации и разместить его на вершине темной поверхности (кусок черного плексигласа работает хорошо). Сфокусируйтесь на рассекает сферу на дно колодца.
- Использование # 5 Дюмон щипцы забрать одну самку одной рукой (лучше всего это сделать с помощью доминирующую руку). Зачастую легче забрать самку крыльев, ног или грудной клетки в брюшной полости перехода. Погрузите самку в средствах массовой информации, заполненных хорошо. Настройте фокус микроскопа по мере необходимости.
- Использование вторую пару щипцов состоится в недоминантной стороны, захватить самку на переднем конце брюшкатаким образом, что задний конец расположен по направлению к доминирующей рукой (рис. 2а). Удостоверьтесь, чтобы держать муху погруженный в средствах массовой информации.
- С доминирующей рукой, использовать щипцы, чтобы захватить кутикулу на 2-м самым задней пигментного сегменте и сорвать его от остальной части живота (рис. 2В-C).
- Используя щипцы в доминирующей рукой, слегка сжать передний конец брюшка, пока яичники не появятся (рисунки 2D-E). При необходимости разместить щипцы между двумя яичников и вытащить их из туши.
- Либо переместите яичники новой скважины свежей средой (рис. 2F) или удалить тушу к Kimwipe или бумажным полотенцем. Это особенно важно, если фолликулы изоляции для развития в пробирке.
- Повторяйте, пока 3-5 пары яичников не были выделены. ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый яичник состоит из ~ 16 овариол или цепочки последовательно созревания фолликулов. Каждый яйцевая трубкасодержится в мышечной оболочки.
- Использование контактных тиски и иглы, поставляемые с ними, мягко растащить яичник, запустив иглы между овариол (рис. 2G). Это иногда выпустить отдельные фолликулы, а также.
- Теперь Индивидуальные овариол и легко различимые морфологические этапы развития фолликула должна быть видна (рис. 2G, дразнили друг от друга яичников). На рисунках 1 и 2 полугодии для морфологических различий, которые могут использоваться, чтобы отличить различные этапы. Для выделения фолликулы, которые находятся в неповрежденных овариол и до сих пор содержащихся в мышечной оболочке, используйте иглу, чтобы сократить через яйцевая трубка на переднем предыдущего фолликула и на задней фолликула сразу после фолликул интересов. Это нарушит мышечную оболочку и фолликул интерес прочь сейчас можно отрезать от соседних фолликулов, не повреждая ее. Как отдельные этапы разделены, перемещать фолликулы, представляющие интерес, используя стеклянную пипетку, к новой скважины свежей средой. Это особенно важно при выделении фолликулов для развития в пробирке. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выжать пипетки лампочку перед входом в СМИ, чтобы предотвратить воздушные пузыри от перераспределения фолликулы интерес во всем хорошо. Кроме того, если фолликулы прилипания к стеклянной пипетки, пипетка может быть предварительно нанесенным покрытием с 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) с помощью пипетки раствор BSA вверх и вниз несколько раз, и промывкой рассекает массовой информации.
- Как только необходимое фолликулы были выделены, продолжить последующих экспериментах.
3. Экстракорпоральное Развитие S10B фолликулов
- Изолировать S10B фолликулы с использованием протокола изоляции этап (этап 2) в IVEM СМИ. Убедитесь, что фолликулы быстро отошел от мусора. Как эти фолликулы будет назревать, это ИМПОrtant что S10Bs собраны в течение 30-60 мин, а затем помещают в средствах массовой информации созревания выбора. ПРИМЕЧАНИЕ: S10B необходимо тщательно отличать от S10A фолликулов (рис. 1в по сравнению с 1В), как S10A фолликулы не созревают в культуральной среде IVEM. В обоих S10A и S10B фолликулов, половина длины состоит из питающих клеток, а другая половина является ооцитов, но в S10B длина фолликула равна фолликулов S14.
- Используя стеклянную пипетку, перемещать ~ 30 S10B фолликулов в лунку планшета для культуры ткани 24-луночного. ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, чтобы убедиться, что все фолликулов переводимых являются S10B и не созрели для S11.
- Подготовьте 1 мкл созревания СМИ на лунку, то есть IVEM СМИ плюс фармакологические реагенты.
- Использование вытащил стекло пипетки *, удалите как можно больше средств массовой информации из колодца (шаг 3.2), насколько это возможно, и быстро добавить созревания средств по выбору. ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно использовать вытащил стеклянную пипсEtte в постановке фолликулов можно легко компенсироваться либо с стеклянными пипетки или наконечники пипеток с Pipetman.
* Чтобы вытащил пипетки: 1) нагреть тонкую часть длинных стеклянных пипеток в пламени горелки Бунзена просто пока стекло не начинает размягчаться, 2) немедленно переместить пипетки из пламени и тянуть горизонтально, чтобы привлечь пипетку в тоньше трубка; 3) разорвать генерировать тонкий момент. ВНИМАНИЕ: Используйте защитные очки, как осколки стекла могут улететь. - Повторите шаги 3.1-3.4 столько скважин как эксперимент требуется.
- Разрешить фолликулы разработать для> 10 часов и оценка прогрессирование с развитием с помощью препаровальной лупы. ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты, как правило, забил на следующий день, чтобы обеспечить достаточное время для фолликулы, чтобы развиться. S10B ~ 5 ч, S11 составляет ~ 30 мин, S12 составляет ~ 2 часа, и S13 составляет ~ 1 час в продолжительности при 25 ° С 1 и развития при комнатной температуре потребуется немного больше времени. Подобные эксперименты описанному для S10B фолликулов может бытьвыполняется с помощью S11-S13 фолликулов.
4. Стадия Изоляция для живых изображений
- Изолировать поздней стадии фолликулы (S10B-14), выражающая флуоресцентный маркер выбора с использованием протокола изоляции этап (этап 2) в IVEM СМИ, быстро движущихся фолликулы от мусора.
- Перемещение фолликулы, представляющие интерес в новых медиа, а затем передать на стеклянной пипетки на покровное нижней Петри пластины. Позаботьтесь, чтобы добавлять носители так, чтобы она всплывает в области покровное нижней, но не перекинуться.
- Для более длинных фильмов покадровой, иногда бывает необходимо для поддержания влажности в чашку Петри, добавив свернутое Kimwipe, смоченную водой, к внутреннему краю чашки Петри. Поместите крышку на вершине.
- Изображение на инвертированный микроскоп. Подробное разрешение потребует конфокальной микроскопии. Необходимо сбалансировать частоту изображений, сила освещения, и длины изображений; это нужно будет самостоятельно разработаны для каждого лabeling инструмент и процесс развития.
5. Стадия Изоляция для мРНК Подготовка
- Изолировать отдельные сценические фолликулы с использованием протокола изоляции этап (этап 2) либо с СМИ Грейс или IVEM.
- Используя стеклянную пипетку, перемещать отдельные этапы интерес в новых скважин со средствами массовой информации; можно собрать несколько этапов сразу.
- Держите раз сбора до 1 часа. Перемещение фолликулов, используя стеклянную пипетку, до 1,5 мл микроцентрифужные пробирки.
- Вращайте пробирки на мини-микроцентрифуге для осаждения всех фолликулов. Использование вытащил стеклянную пипетку (см. шаг 3.4) тщательно удалить все СМИ. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании в полный размер микроцентрифужную, спин вниз фолликулов на низкой скорости.
- Добавить 100 мкл TRIzol и измельчить его вручную в течение ~ 20 сек, используя пластиковую пестик. Спином вниз на полной скорости в микроцентрифуге и двигаться Trizol на новый 1,5 мл пробирке будьте осторожны, чтобы не нарушить любой гранулированный дebris. Хранить при температуре -80 ° С.
- Повторите шаги 5.1-5.5, пока достаточно фолликулы не были получены в эксперименте. Регулярно, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, и ~ 100 S14 фолликулы дают ~ 10 мкг РНК.
- Оттепель образцы на льду. Объединить образцы, в случае необходимости, в один пробирке и довести объем тризола до 800 мкл. Продолжайте выделения РНК в соответствии с указаниями производителя. ВАЖНО: Не забудьте ДНКазы лечения изолированной РНК с РНКазы свободной ДНКазы.
6. Стадия Изоляция для Западной блоттинга
- Разогреть нагревательный блок до 100 ° С.
- Изолировать отдельные сценические фолликулы с использованием протокола изоляции этап (этап 2) либо с СМИ Грейс или IVEM. ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо эмпирически определить, сколько того или иного этапа фолликула необходимы для наблюдения каждого конкретного белка. Для сильно выраженных белков 1-3 S10B фолликулы / а достаточно, чтобы увидеть сильный сигнал на вестерн-блоттинга. Тем не менее, важно, чтобырепрезентативная выборка, принимая фолликулы из нескольких самок. Таким образом, 15-20 фолликулы определенном этапе обычно собираются.
- Перемещение фолликулы, с помощью стеклянной пипетки в 1,5 мл пробирке. Кратко Спин в мини-микроцентрифуге для осаждения фолликулы (см. шаг 5.4). Осторожно снимите все СМИ, используя вытащил стеклянную пипетку (см. шаг 3.4) и добавить 50 мкл 1x PBS и 50 мкл 2x Лэммли буфера.
- Измельчить вручную в течение ~ 20 сек с пластиковым пестиком. ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковые пестики могут быть повторно использованы для шлифовки западные образцы промывкой и автоклавирования их.
- Варить образцы в течение 10 мин в тепловом блоке.
- Кратко Холод на льду и спина на полной скорости в течение 15 секунд в микроцентрифуге. Либо сразу загрузить на геля SDS-PAGE или магазин при температуре -20 ° С. ПРИМЕЧАНИЕ: Если образцы хранятся, помните повторное испарение образцов перед загрузкой на гель.
- Выполнение Вестерн-блоттинга по стандартным протоколам.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Когда выделения специфических этапы развития Drosophila фолликула важно иметь возможность точно различать различные морфологические этапы. Это несколько сложным для S10A и S10B, как медсестра клетки и ооцит каждый занимают половину длины фолликула на этих этапах (Фиг.1В по сравнению с 1С). Тем не менее, S10A фолликулы короче в длину, чем S10B фолликулов, как фолликулы S10B полностью вытянута и, таким образом одинаковой длины к S14 фолликула (рис. 1С по сравнению с 1G). Кроме того, подмножество фолликула или соматических клеток над яйцеклетки называется центростремительные фолликул клетки начинают мигрировать в между питающих клеток и яйцеклетки в S10B. Во S10B, который принимает ~ 5 ч, медсестра клетки подвергаются динамическим ремоделирования актина, так что на S11 контракт медсестра клетки, сжимая свои цитоплазматические содержимое в яйцеклетку. Таким образом, на S11, регион медсестра клетка имеетзначительно сократилось, в то время как яйцеклетка расширила (рис. 1D). В S12, медсестра клетки начинают пройти смерть и взять на себя более непрозрачной появления (рис. 1E); интересно, в культуре, медсестра сотовые остатки локон дорсально в S12 фолликулов (см. S12S на рисунках 3C'-D '). Во S13, регион медсестра клеток прозрачна, как гибель клеток в настоящее время завершается, и формирование спинной придатком происходит (рис. 1F). По S14 только яйцеклетка и фолликул клетки остаются, и формирование спинной придатком завершена (рис. 1G).
В пробирке развитие анализ может быть использован для оценки последствий различных фармакологических методов лечения и генетических мутаций по развитию S10B и медсестры клетки демпинг (рис. 3). Развитие S10Bs в культуре является надежной, однако, ряд факторов может привести к ухудшению результатов эксперимента. На фиг.3А,Экспериментальные данные как успешный и неудачного эксперимента предоставляются. Успешный эксперимент, в котором 80-100% фолликулов дикого типа в контрольных СМИ захоронения полное медсестра клеток и прогресс до S12-14 (рис. 3А, вес 1). Иногда контроль дикого типа не будет выполнена, это означает, что менее 80% фолликулов разработать (Фиг.3А, вес 2). Эта ошибка может быть вызвана целым рядом вопросов, в том числе:. 1) неспособность отличить S10A от S10B фолликулов (см. 1 и 2), 2) проблемам СМИ (температура, возраст, и т.д.), и / или 3) фолликулы были подвергается мусора слишком долго.
В развитие пробирке S10Bs может быть использован в сочетании с медикаментозной терапии. Для таких экспериментов, важно, что контроль наркотиков, то есть лечение дикого типа фолликулов с наркотиками, выполняются с каждым эксперимента потому, что эффективность препарата и / или Концентратион может меняться со временем. Для фармакологических экспериментов, удобно проанализировать соотношение количества процент фолликулов, развивающихся в лекарственной терапии в том, что в контрольной информации; этот контроль за небольшими различиями генетического фона. Часто бывает полезно для лечения с концентрацией препарата IC 50, это концентрация, которая блокирует 50% дикого типа (уже означает) фолликулы от прохождения медсестра ячейку демпинг и дальнейшее развитие. . Таким образом, отношение для дикого типа фолликулов, как ожидается, 0,5 (фиг.3В, препарат 1) Фиг.3В является примером того, как препарат (аспирин) может стать слишком концентрированный (препарат 2, вероятно, из-за испарения растворителя) и блок более 50% фолликулов дикого типа из развивающихся. Для дальнейшей иллюстрации в пробирке развития анализа, изображения двух скважин развивающихся S10B фолликулов предоставляются. Цифры 3C и D иллюстрируют фолликулы S10B в началеанализ, в управления или аспирин обработанной (~ 2 мм) информации. Цифры 3C 'и D' иллюстрируют конце анализа, показывая, что большинство фолликулов, обработанных контрольными разработанных для S14, в то время как большинство фолликулов, обработанных аспирин не имеют завершена медсестра клеток демпинга.
В пробирке развитие анализа также могут быть использованы для скрининга генетических фонов, которые более чувствительны к конкретного препарата. Рисунок 3E содержит два примеров. В первом примере, генетический фон (expt1, синий бар) не взаимодействуют с аспирином как отношение остается ~ 0,5, и наоборот, во втором примере, генетический фон (expt2, красный бар) усиливает действие аспирина. Таким образом, в пробирке развитие анализ может быть использован для определения последствий мутаций и фармакологических реагентов на развития и морфологических событий, происходящих во время поздней оогенезе; кроме того, анализ может быть использован для оценки как фармакологического и генетических взаимодействий (см. 9).
Изоляция этап также может быть использован для живого изображения процессов развития. Рисунок 4 является примером покадровой фильм фолликула S10B выражающей атрофина-GFP, актиновый связывающий домен от человека атрофина слитый с зеленого флуоресцентного белка. Используя этот инструмент визуализации, актина образование расслоение и конденсации могут быть визуализированы. Многие инструменты доступны для живого изображения, в том числе белка ловушки трансгенных линий 16,17, БАС приводом флюоресцентно отмеченных органелл маркеров (митохондрии, Гольджи, эндоплазматический ретикулум и т.д..), БАС приводом флюоресцентно отмеченных цитоскелета маркеры (актина и актин-связывающие белки, микротрубочки и микротрубочек связывающие белки), трансгенные линии, выражающие любое флюоресцентно отмеченных интерес белок и витальных красителей (Нил Красный этикетки нейтральные липиды, Эду этикетки тиражирование ДНК, FM4-64 этикетки мембраны).
ove_content "> Молекулярный анализ может выполняться с использованием изолированных этапы Drosophila фолликулов. Для анализа белка по вестерн-блоттинга, необходимо эмпирически определить, сколько фолликулов, из определенной стадии развития, обязаны соблюдать интересующий белок. Рисунок 5 является примером того, как последовательно разбавленной концентрированный белковый лизата, чтобы определить количество S10B фолликулов, необходимых для наблюдения конкретный белок, Fascin. В этом случае S10B фолликул Достаточно заметить, этот белок с помощью вестерн-блоттинга.
Рисунок 1. Диаграмма, описывающая клеточный состав Drosophila фолликулов и изображений, иллюстрирующих морфологическое различие середине-конце стадии дрозофилы следуюlicles. А. Схема, изображающая клеточный состав в S10A фолликула. BG. Представитель изображения S10A-S14 Drosophila фолликулов, сделанных с использованием стерео рассекает сферу. Drosophila фолликул состоит из 16 половых клеток, полученных: 1 ооцитов (красный, А) и 15 медсестры или поддерживающие клетки (желтый, А), которые окружены ~ 650 соматически-производных эпителиальных клеток (белых, малиновый и бирюзовый, А ). В S10A, половина длины фолликула состоит из питающих клеток (желтый кронштейн, В), которые, подпадающих под стрейч ячейки стручка (пурпурный в А), а другая половина состоит из яйцеклетки (красная звездочка , В), который покрыт основных тела фолликула клеток (белых в A). В S10B, медсестра клетки (желтый кронштейн, C) и ооцитов (красная звездочка, С) каждый сочинять половину леngth фолликула, однако общая длина фолликула теперь равна фолликула S14 (ср. С до G). Во S11, медсестра клетки (желтый кронштейн, D) быстро сжать их цитоплазматические содержимое в удлиняющейся яйцеклетки (красной звездочкой, D) в / миозина зависит от процесса актина называют медсестра ячейку демпинга. По S12, яйцеклетка (красная звездочка, Е) полностью вытянута, как медсестра клеток демпинга полные и только остатки медсестра клеток остаются (желтый кронштейн, E). Медсестра сотовые остатки (желтый кронштейн, F) в комплекте гибель клеток в S13. S14 представляет собой полностью зрелый фолликул, который состоит из яйцеклетки (красная звездочка, G), соматических клеток, и яичной скорлупы, в том числе спинных придатков (белые стрелки, G). В. Шкала бар = 0,1 мм.
Рисунок 2. Изображения с обзором яичников вскрытия и изоляции фолликула. А. Погрузите муху в рассекающих СМИ и ориентировать его так, что он проводится, щипцов, в недоминантной стороны. Б. Использование доминирующую руку, схватить кутикулу на задней части живота. С. Потяните кутикулу от, подвергая яичники (желтая стрелка). Д. Работа на передней части живота к задней, слегка сжать живот выпуская яичники (желтая стрелка). Е. Отделите яичники (желтая стрелка) от любого оставшегося кутикулы (красный наконечник стрелы) и / или внутренние органы (белые стрелки). Ф. Перенесите отдельные яичники свежим также содержащих рассекающих СМИ. Г. Tease кроме яичники, используя рассекает иглы, чтобы разоблачить Индидельных фолликулы (сравните нетронутыми яичник (верхний) в разделенных яичника (внизу). Белые Arrowhead указывает на зарезал S10B фолликула, пример фолликула, которые не должны быть использованы для последующих экспериментов. Х. Выберите морфологические этапы интерес (Стадии 10А -14 (S10A-S14) показаны).
Рисунок 3. Примеры в пробирке анализов развития. А. Схема процент S10B фолликулов, что полное развитие в культуре. вес 1 является примером ожидаемого развития дикого типа S10B фолликулов (96% развивающихся), а вес 2 является примером слабого развития в культуре (68% развивающихся). Мы, как правило, отбросить весь эксперимент, если развитие дикого типа S10B фолликулов в контрольных СМИ ниже 80%. B. 50 для аспирина на процент развивающихся в контрольных средах. IC 50 представляет собой концентрацию, который блокирует 50% фолликулов S10B из развивающихся, это означает, что значение дикого типа должно быть ~ 0,5. Наркотиков 1 является примером ожидаемого соотношения дикого типа (0,52), в то время как препарат 2 является примером того, что происходит, когда концентрация препарата слишком сильный (0,37). CD. Изображения в пробирке скважин. CC '. Управления лечение. DD '. Аспирин лечение (~ 2 мМ). CD. Изображение S10Bs в начале анализа. С'-D'. изображение фолликулов в конечной точке анализа. Контроль лечить S10B фолликулы развиваться S14s в культуре (C '), в то время как большинство аспирин лечение фолликулов не смогут завершить медсестра ячейку демпинг (D').
Рисунок 4. Пример, показывающий использование изолированной S10B фолликулов для живого изображения. А.Ф.. Максимальные проекции 3 ломтика от покадровой Z-стеки фолликула S10B, выделенной из атрофина :: GFP выражающие трансгенных мух (SQH-атрофина :: GFP). A 'F'. Увеличено вставки выделить один медсестра клетку от - Ф. Ф. '. F-актин (атрофина :: GFP), белый.,'. Время (т) = 0 мин. В, В '. Т = 20 мин. C, C'. Т = 40 мин. D, D '. т = 60 мин. Е, Е'. т = 80 мин. F, F '. т = 100 мин. В начальной точке времени, короткие нитей актина можно наблюдать расширение внутрь от медсестры клеточных мембран (А, А '). Эти нитей актина удлиненные всей начале моменты времени (BC "по сравнению с А, А '), пока они не будут полностью удлиненный (D, D'). В более поздние моменты времени, эти полностью вытянутые нитей актина затем сократить и конденсироваться на протяжении медсестра ячейки захоронения (EF ') А. Шкала бар = 50 мкм.'. Бар Масштаб = 10 мкм.
_upload/50493/50493fig5highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg "/>
.. Рисунок 5 Иллюстрация того, как определить количество фолликулов, необходимых для изучения конкретного белка методом Вестерн-блоттинга Это вестерн-блот глядя на Fascin выражения в S10B фолликулов (1:20, С.Н. 7С, Кули, L.; Развивающие Studies Гибридома банк (DSHB), разработанный под эгидой NICHD и поддерживается в Университете штата Айова, биологический факультет, Iowa City, IA, 52242). Цифры по всей верхней представляют приблизительное количество S10B фолликулов загружалась на полосу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila фолликул состоит только из небольшого числа типов клеток, что делает его идеально подходит как для морфологических и молекулярных анализов. Кроме того, из-за структуры яичника, это относительно легко получить большое количество конкретных стадиях развития фолликулов с общим рамки вскрытии и минимальной подготовки. Как каждый этап представляет собой короткий временной окно, изоляция этап может обеспечить значительные молекулярные проницательности в развитии процессов, происходящих на этом этапе. Например, мы использовали изоляцию этап фолликула в середине-конце для характеристики изменений экспрессии генов, происходящих во время S10B, S12 и S14 18. Данный анализ показывает, ряд ранее неохарактеризованных генов, вероятно, способствовать развитию фолликулов и, в частности, яичной скорлупы образования.
Изоляция этап может обеспечить значительное понимание морфологических событий через живого изображения. Такая процедура может быть проведена на аль л этапы развития Drosophila фолликула. Хотя основное внимание в этой работе является S10B-14, читатели могут обратиться к следующим статьям для живого визуализации ранних стадиях: гермарии 13, фолликул удлинения 19, и сценических 9 11,12,14. Условия культивирования, используемые в этих исследованиях отличны от тех, которые обсуждались в этой работе. В частности, эти исследования использовали Шнейдера насекомых СМИ с переменными уровнями FBS (2,5-15%), а также добавлением инсулина 11-13,19 и, в некоторых случаях, дальнейшее добавление трегалозы, метопрен, 20-гидроксиэкдизон, и аденозин deamidase 14. Важно отметить, что эти живые изображения исследования значительно расширили наше понимание событий, происходящих в течение этих более ранних стадиях развития. Тем не менее, эти ранние стадии фолликулы не может прогрессировать вплоть до финальной стадии развития фолликула, S14. И наоборот, S10B-13 будет развиваться в S14 в культуре.
ove_content "> Во S10B-S14 многих морфологических процессов, происходящих, которые могут быть изучены живого изображения. Например, жить изображений может быть использован для изучения процесса медсестра ячейки захоронения, процесс, при котором медсестра клетки сжать их цитоплазматические содержимое в яйцеклетку предоставить ему всем необходимым для завершения эмбриогенеза. Медсестра клеток демпинга можно наблюдать покадровой обработки изображений с использованием проходящего света 7 или по конфокальной микроскопии с использованием трансгенных линий, экспрессирующих флуоресцентные маркеры (см. рисунок 4). Дальнейшее использование живого изображения, как ожидается, создание новых понимание динамики цитоскелета, необходимых для медсестры клеток демпинга. Live-визуализация поздних стадиях также расширили наше понимание спинной придаток зачатков миграции и тубулогенеза 10.В пробирке развития S10B-S13 фолликулов может быть использован для определения влияние как фармакологических реагентов и генетических манипуляций на процессы происходятзвонить в это время. Мы использовали в разработке пробирке из S10B фолликулов установить роль простагландинов в регулировании медсестра ячейку демпинга 7. Впоследствии мы использовали этот анализ, чтобы выполнить экран фармакологического-взаимодействия, а именно, мы испытывали, если потеря одной копии регулятором актина усиливает или подавляет медсестра клеток захоронения дефекты, связанные с потерей простагландинов. Этот экран выявил ряд предполагаемых нижестоящих мишеней (9 и Спрэклин, Мейера, и Tootle, неопубликованные данные). Анализ также может быть использован для изучения генетических взаимодействий на основе оценки дефекты развития, такие как блок в медсестра клетки демпинг, из-за гетерозиготности для двух различных факторов (для примера этого см. 9).
В то время как изоляция середине-конце стадии Drosophila фолликулов является довольно простой процесс, существует ряд критических факторов для оптимального успеха. Во-первых, подготовка мухочень важно. Лучше всего, чтобы сохранить различные генотипы мух в качестве подобного состояния, как это возможно, то есть количество мух в одном флаконе, соотношение самок и самцов (соотношение 2:1 идеально подходит), и обеспечить доступ свежего, мокрый дрожжи последовательно. Кормление (мокрый дрожжи) и время вскрытия изменит распространенность различных стадиях развития. Мы обнаружили, что, когда мухи последовательно подается утром, больше S10Bs могут быть выделены в первой половине дня, в то время как больше S12S присутствуют во второй половине дня. Второй критический фактор является СМИ. Для развития в пробирке и живого изображения важно подготовить свежие IVEM СМИ. Кроме того, средства массовой информации должны нагреться до комнатной температуры, а холодные СМИ изменит цитоскелетом, как актин и микротрубочки, и поэтому, нарушить дальнейшее развитие. Важно также, чтобы сохранить фолликулы от мусора. Иногда, во время вскрытия, кишка выйдет с яичниками. Мы обнаружили, что если кишка разрыви фолликулы находятся в загрязненной среды, фолликулы вряд ли развиваться в культуре. Как фолликулы продолжают развиваться в культуре, важно повторного подтверждения постановку после вскрытия, прежде чем приступить либо развития в пробирке или молекулярных анализов. Наконец, важно иметь соответствующие средства управления для экспериментов. Для развития в пробирке, необходимо использовать дикого типа фолликулов, чтобы проверить, что СМИ позволяет для нормального развития (80-100% полной медсестра клеток демпинг), и, чтобы проверить, что фармакологические реагенты действуют как ожидалось (см. Рисунок 3).
В заключение, изоляция середине-конце этап Drosophila фолликулов может обеспечить значительное понимание процессов развития с помощью различных экспериментальных методик.
Таблица специфических реагентов и оборудования:
| Название реагента | Компания | Кошкаalogue число | Комментарии (по желанию) |
|---|---|---|---|
| Сухие дрожжи | Джинеси Научно | 62-103 | Любой источник активных сухих дрожжей в порядке |
| Грейс насекомых Медиа | Lonza | 04-457f | |
| Инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка | Атланта биологические препараты | S11050H | Любой термоинактивированной FBS должен работать |
| 10x ручка / Стрептококковое | Гибко / Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin тиски и иглы | Тед Пелла, Inc | 13561-10 | |
| Пятно плиты, Девять Ну | Гранулирование | 7220-85 | |
| # 5 Дюмон щипцы | Изысканные Наука Инструменты | 11252-20 | |
| 24 мульти-луночные планшеты | Becton Dickinson | 35 3226 | Любое 2Тканевой культуры блюдо 4-а должны работать |
| Покровные Bottom Посуда (35 мм) | Маттек корпорация | P35G-1.0-14-С | Покровные толщина будет зависеть от микроскоп / цель используется |
| Стеклянные пипетки | Гранулирование | 7095B-5x (для передачи фолликулы) 7095B-9 (для производства вытащил пипетки) | |
| Образец пестиком (1,5 мкл; РНКазы / ДНКазы) | Исследовательские Products International | 199228 | Любая пластиковая пестик, который подходит 1,5 мкл микроцентрифужные пробирки можно использовать |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Там нет ничего, чтобы раскрыть.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Томаса Lecuit (SQH-атрофина :: GFP линия), в Блумингтон со-центр, и процесс развития Studies гибридомные банк для реагентов. Кроме того, мы благодарим всех членов Tootle Lab за полезные обсуждения и критики рукописи. Финансирование от Национального научного фонда MCB-1158527, и исходные финансовые средства от анатомии и Департамента клеточной биологии, Университет Айовы поддержала эту работу. Национальные институты здравоохранения Predoctoral подготовки Грант в фармакологических наук T32GM067795 поддерживается AJS. Поддержка хранения данных была предоставлена ИКТ, который финансируется через CTSA при поддержке Национального Центра Ресурсов Исследования и Национального центра Продвижение поступательного науки, Национальные Институты Здоровья, через Грант UL1RR024979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
