Summary
Stage-spesifikke isolering av midten til slutten av Drosophila follikler er nyttig for en rekke formål. Slike follikler utvikle seg i kultur, noe som gjør det mulig for genetiske og / eller farmakologiske manipulasjoner for å bli kombinert med in vitro utviklings analyser og levende avbildning. I tillegg kan follikler benyttes til molekylære studier, for eksempel isolering av mRNA og protein.
Abstract
Drosophila oogenesen eller follikkelutvikling har vært mye brukt for å fremme forståelsen av komplekse utviklings-og celle biologiske prosesser. Dette metoder beskriver hvordan man kan isolere midten til sent stadium follikler (Stage 10B-14), og utnytte dem til å gi ny innsikt i de molekylære og morfologiske hendelser under tette vinduer av utviklings tid. Isolerte follikler kan brukes for en rekke eksperimentelle teknikker som in vitro assays utvikling, direkte avbildning, mRNA ekspresjon analyse og western blot-analyse av proteiner. Follikler på Stage 10B (S10B) eller senere vil fullføre utviklingen i kultur, og dette gjør det mulig å kombinere genetiske eller farmakologiske forstyrrelser med in vitro utvikling for å definere effekten av slike manipulasjoner på de prosesser som oppstår under bestemte perioder av utviklingen. I tillegg, fordi disse folliklene utvikler seg i kultur, de er ideell for live imaging studier, Som ofte avslører nye mekanismer som formidler morfologiske hendelser. Isolerte follikler kan også brukes for molekylære analyser. For eksempel kan forandringer i gen-ekspresjon som er resultatet av genetiske forstyrrelser være definert for spesifikke utviklings vinduer. I tillegg kan protein-nivå, stabilitet og / eller posttranslational modifikasjon tilstand under en bestemt fase av follikkelutvikling undersøkes ved western blot analyser. Dermed scenen spesifikke isolering av Drosophila folliklene gir en rik kilde til informasjon i allment bevarte prosesser for utvikling og morphogenesis.
Introduction
Hver Drosophila eggstokk er sammensatt av ~ 16 ovarioles, eller kjeder av sekvensielt modning egg kamre eller follikler. Hver follikkel er sammensatt av en enkelt oocyte, 15 bakterie linje avledet sykepleier eller støttelegemer, og ~ 650 somatiske celler betegnet follicle celler (figur 1A). Drosophila oogenesen er delt inn i 14 morfologisk definerte utviklingsstadier 1.. Hvert trinn av follikkelutvikling observeres mange ganger i løpet av en enkelt fly, noe som gjør det relativt lett å isolere et betydelig antall stadium-spesifikke follikler.
De midten til slutten stadier av oogenesen (Stages 10B-14) er spesielt godt egnet for scenen isolasjon (Figur 1). På Stage 10B (S10B), er hårsekken fullt langstrakt (dvs. dens lengde er lik som i en Stage 14 (S14) hårsekken, se figur 1 og figur 2 H) og halve lengden av hårsekken er sammensatt av sykepleier cellermens den andre halvdelen er oocytten (figur 1C). På dette stadiet sykepleier celler gjennomgå dramatiske aktin ombygging, styrke kortikale aktin og genererer parallelle bunter av aktin filamenter to. På samme tid, en populasjon av follicle celler, betegnet sentripetale celler, migrere inn mellom sykepleier celler og oocytt, og to rygg grupper av follicle celler blir bestemt til å gjennomgå migrasjon for å danne rygg vedheng, rørformede respiratoriske aggregater av embryoet 3 . Sykepleieren cellene deretter kontrakt (S11), klemme sine cytoplasmatiske innholdet i eggcelle i en prosess som kalles sykepleier celle dumping, noe som gir eggcelle med de faktorer som er nødvendige for at den skal fullføre embryogenese (figur 1D). Sykepleieren cellene deretter gjennomgå celledød (S12-S13) 4, og hårsekken cellene skiller og mønster eggeskallet 5 (Tall 1E-G). Dermed er slutten av oogenesen rik med viktig utviklings end morphogenetic prosesser.
Isolerte midten til sent stadium follikler (S10B-S14) kan brukes til en rekke formål, inkludert molekylære analyser. For eksempel kan mRNA fra iscenesatte follikler isoleres for RT-PCR, microarray, eller RNA-seq analyser. Dette gjør det mulig å se på genekspresjon innen kort utviklings vindu, med bare noen få celletyper som finnes, og finne ut hvordan genuttrykk endres ved enten farmakologiske eller genetiske forstyrrelser. Stage isolasjon kan også brukes til å se på proteiner av western blotting. Slike analyser er viktig fordi det gjør det mulig å kvantifisere nivået av proteinekspresjon i villtype-versus mutanter på bestemte stadier. Mens man kan bruke immunofluorescent analyser for å oppnå lignende resultater, kvantifisering av fluorescens er mindre robust på grunn av de strenge krav til at alle pikslene være innenfor det lineære området for påvisning 6.. I tillegg kan western blot analyse gi annen informasjon, for eksempel ens hvis proteinet er posttranslationally modifisert eller uttrykkes fra en bestemt spleise isoform. Isolerte stadier kan også brukes for ytterligere protein rensing, inkludert subcellulære fraksjonering eller coimmunoprecipitation.
Stage spesifikke hårsekken isolasjon kan også brukes for in vitro utviklings analyser 7 og live-imaging åtte. Isolerte S10B-S13 follikler vil fortsette å utvikle seg til S14 i enkle dyrkingsmedier (se nedenfor). Det er viktig å merke seg at S10A follikler ikke vil fremgang gjennom sykepleier celle dumping ved hjelp av kultur forhold som omtales i dette manuskriptet. Vi har brukt S10B in vitro utviklings analyser for å definere rollen til prostaglandiner, både farmakologisk og genetisk, i å regulere aktin ombygging ved hjelp av sykepleier celle dumping og utvikling som leser-outs 7,9. På samme måte kan de senere stadier av utviklingen også være isolert for å bestemme effekten av farmakologiske behandlinger eller genetisk menneskeipulations på bestemte prosesser som sentripetal celle migrasjon, rygg vedheng migrasjon / formasjon 10, og sykepleier celledød. Slike analyser kan brukes til å utføre dominerende interaksjons skjermer eller analyser, for eksempel, mens heterozygosity for mutasjoner i PXT eller fascin alene har ingen effekt på S10B in vitro utvikling, follikler fra doble heterozygotes utstillings sykepleier celle dumping defekter og en blokk i utvikling 9.
I tillegg, fordi S10B-13 kan utvikle seg i kultur, alle de prosesser som skjer i løpet av denne tiden kan observeres av live-imaging. Slike bildebehandling kan utføres bare ved hjelp overført lys (hvis man er bare interessert i brutto endringer i morfologi) eller med konfokalmikroskopi bruker transgene fluer uttrykker fluorescerende prober eller follikler farget med levende bildefargestoffer. Sanntids avbildning blir brukt til i det vesentlige å fremme forståelsen av utviklingsprosesser. Faktisk lever imaging sent stadium follikler har utvidet kunnskapen om rygg vedheng migrasjon, et eksempel på tubulogenesis 10. Vi forventer at levende avbildning av ekstra sent stadium prosesser, herunder aktin dynamikk under sykepleier celle dumping, vil gi ny innsikt i disse utviklings hendelser. Det er viktig å merke seg at mens S10A og tidlige stadier av follikkelutvikling ikke vil fortsette å utvikle seg til en S14 i kultur, er mulig leve-avbildning av hendelser som skjer i løpet av de stadier av utviklingen ved hjelp av alternative kulturforhold 11-14 (se diskusjon for mer informasjon).
Her gir vi detaljerte protokoller for å isolere sent stadium follikler for enten in vitro utvikling og leve-bildebehandling, eller molekylære analyser (mRNA og protein isolasjon).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Forbereder Drosophila Før Stage Isolation
- Lag våte gjærpasta ved å kombinere 50 g av aktiv tørrgjær med 90 ml destillert vann. Bland med en slikkepott til å kombinere. La blandingen stå i ~ 30 minutter før måling konsistens. Konsistensen skal være like tykk nok til å følge den siden av en flue hetteglass, men ikke kjøre ned på siden. For å oppnå den ønskede konsistens kan det være nødvendig å tilsette opp til 10 ml med ytterligere vann eller en liten mengde av tørrgjær. Oppbevar i en dekket beholder ved 4 ° C. Den lagrede gjær kan anvendes for ~ 1-2 uker.
- Samle <24 hr gamle voksne fluer (både menn og kvinner) av de ønskede genotyper og sette dem inn i en ampulle med flue mat pluss våt gjær lim smurt på siden av hetteglasset. Den temperatur ved hvilken fluene opprettholdes, vil variere avhengig av eksperimentet. For rutinemessige eksperimenter, blir fluene holdt ved romtemperatur. Mens eksperimenter hvor et gen som erblir overuttrykt ved hjelp av UAS/GAL4 system 15.5 kreve opprettholdelse av fluer ved 25 ° C eller mer, etter behov.
- Gi fluer med en frisk smøre av gjærpasta daglig i 2 dager. MERK: Som follikkelutvikling er strengt regulert av ernæringsstatus av den kvinnelige fly, er det viktig å gi flua med næringsrikt gjær lime i minst 36 timer før disseksjon.
2. Isolere Mid-to-sen Iscenesatt Drosophila Follicles
- Tillat media for å komme til romtemperatur (~ 30 min). Hvis de iscenesatte follikler kommer til å bli brukt til in vitro utviklings analyser, tilbereder IVEM media (Grace insekt medier, 10% varmeinaktivert fetal bovine serum, og 1x penicillin / streptomycin). Hvis de iscenesatte follikler kommer til å bli brukt for mRNA eller protein isolasjon bruke enten Grace insekt eller IVEM media. VIKTIG: Media temperatur er avgjørende. Hvis media er kaldt vil det endrebåde aktin og microtubule cytoskeletons og blokk utvikling.
- Anesthetize flyr i yeasted hetteglasset ved å injisere CO 2-gassen og plassere 3-5 kvinnelige fluer på et fluematte under CO 2. VIKTIG: Ikke la flere hunner enn kan bli dissekert i en 10 min periode på fly pad som forlenget eksponering for CO 2 kan føre til sterilitet og død.
- Fyll ett godt av en 9-spot plate med media og plassere den på toppen av en mørk overflate (et stykke svart plexiglass fungerer bra). Fokuser dissekere omfang på bunnen av brønnen.
- Bruke # 5 Dumont tang plukke opp en singel kvinne med en hånd (dette gjøres best ved hjelp av den dominerende hånden). Det er ofte lettest å plukke opp den kvinnelige av vinger, ben, eller thorax til magen overgang. Senk den kvinnelige i media fylt godt. Juster fokus på mikroskop som nødvendig.
- Ved hjelp av et andre par tenger holdt i nondominant hånd, ta tak i hunn ved den bakre enden av bukhulenslik at den bakre ende er plassert mot den dominerende hånden (fig. 2A). Sørg for å holde flua neddykket i media.
- Med den dominerende hånden, bruke pinsett for å ta tak i hårstråene på andre mest posterior pigmentert segment og rive den bort fra resten av magen (Tall 2B-C).
- Ved hjelp av pinsett i den dominerende hånden, forsiktig klem fremre enden av magen til eggstokkene dukke (Tall 2D-E). Om nødvendig, legg tang i mellom de to eggstokkene og trekke dem ut av kadaveret.
- Enten flytte eggstokkene til en ny brønn med friskt media (figur 2F) eller fjerne kadaveret til en Kimwipe eller papirhåndkle. Dette er spesielt viktig dersom follikler blir isolert for in vitro utvikling.
- Gjenta til 3-5 par av eggstokkene har vært isolert. MERK: Hver eggstokk er sammensatt av ~ 16 ovarioles eller kjeder av sekvensielt modning follikler. Hver ovarioleer inneholdt i en muskel kappe.
- Ved hjelp av pinneskrustikke og nålene som følger med dem, dra forsiktig fra hverandre eggstokken ved å kjøre nålene mellom ovarioles (Figur 2G). Dette vil noen ganger frigjøre de enkelte follikler i tillegg.
- Individuelle ovarioles og lett skjelnes morfologiske stadier av follikkelutvikling skal nå være synlig (figur 2G, ertet hverandre eggstokk). Se figurene 1 og 2 H for morfologiske forskjeller som kan brukes til å skille de forskjellige stadier. Å isolere follikler som er innenfor intakte ovarioles og fortsatt finnes en muskel slire, bruker en nål til å skjære over ovariole på fremre av foregående hårsekken og på bakre av hårsekken umiddelbart etter hårsekken av interesse. Dette vil bryte muskel skjede og hårsekken av interesse bort kan nå bli kuttet vekk fra nabolandet follikler uten å skade det. Som enkelte trinn er separert, flytte follikler av interesse, ved hjelp av et glass pipette, til en ny brønn med ferske media. Dette er spesielt viktig når isolere follikler for in vitro utvikling. MERK: Det er viktig å presse pipetten pære før vi går i media for å hindre at luftbobler omfordele follicles av interesse i hele godt. I tillegg, hvis follikler er fast til glasset pipette pipetten kan være forhåndsbelagt med 3% bovint serum-albumin (BSA) ved å pipettere BSA-løsningen opp og ned flere ganger og skylling med dissekere media.
- Når nok follikler har vært isolert, fortsett med påfølgende eksperimenter.
Tre. In vitro Utvikling av S10B Follicles
- Isoler S10B follikler hjelp scenen isolasjon protokollen (trinn 2) i IVEM media. Sørg for at folliklene er raskt flyttet bort fra rusk. Som disse folliklene vil fortsette å modnes, er det important at S10Bs oppsamles i 30-60 min og deretter plassert inn i modningen materiale av valget. MERK: S10B må nøye skilles fra S10A follikler (Figur 1C forhold til 1B), som S10A follikler ikke vil modnes i IVEM kultur media. I både S10A og S10B follikler, er halvparten av lengden består av sykepleier celler og den andre halvparten er eggcelle, men i S10B lengden av hårsekken er lik som i de S14 follikler.
- Ved hjelp av et glass pipette, flytter ~ 30 S10B follikler i en brønn av en 24-brønns vev kultur plate. MERK: Sørg for å kontrollere at alt av folliklene blir overført er S10B og har ikke modnet til S11.
- Forbered en mL av modning media per brønn, dvs. IVEM media pluss farmakologiske reagenser.
- Ved hjelp av en trakk glass pipette *, fjerne så mye media fra brønnen (trinn 3.2) som mulig, og raskt legge til modning media av valget. MERK: Det er viktig å bruke en trakk glass pipette som iscenesatte follikler kan lett tas opp med enten glass pipetter eller pipetter med en Pipetman.
* For å gjøre trukket pipetter: 1) varme den tynne delen av lange, glass pipetter i flammen av en Bunsen brenner like før glasset begynner å mykne, 2) umiddelbart flytte pipette ut av flammen og trekke horisontalt for å trekke pipetten inn en finere rør, 3) bryter for å generere en fin spiss. FORSIKTIG: Bruk øyebeskyttelse som fragmenter av glass kan fly av gårde. - Gjenta trinn 3.1 til 3.4 for så mange brønner som forsøket krever.
- Tillat follikler til å utvikle for> 10 timer og scorer utviklings progresjon under en dissekere omfang. MERK: Eksperimenter er vanligvis scoret neste dag for å gi tilstrekkelig tid for folliklene å utvikle. S10B er ~ 5 time, er S11 ~ 30 min, er S12 ~ 2 timer, og S13 er ~ 1 t i varighet ved 25 ° C 1 og utvikling ved romtemperatur vil ta litt lenger tid. Lignende forsøk til det som er beskrevet for S10B follikler kan væreutføres ved hjelp av S11-S13 follikler.
4. Stage Isolasjon for Live Imaging
- Isoler sent stadium follikler (S10B-14) uttrykker det fluoriserende fargestoff av valg med scenen isolasjon protokollen (trinn 2) i IVEM media, raskt bevegelige follikler unna rusk.
- Flytt follikler av interesse i nye medier, og deretter overføre med glass pipette til et dekk bunn Petri plate. Vær nøye med å legge til media slik at det bobler opp i dekk bunnen området, men renner ikke over.
- For lengre tidsintervall filmer, er det noen ganger nødvendig for å opprettholde fuktigheten i Petri-plate ved å legge til en opprullet Kimwipe, fuktet med vann, til den indre kanten av Petri-plate. Sett lokket på toppen.
- Bildet på et invertert mikroskop. Detaljert oppløsning vil kreve konfokalmikroskopi. Det er nødvendig å balansere frekvensen for avbildning, styrken av lys, og lengden av avbildning, og dette må bli uavhengig utarbeidet for hver labeling verktøy og utviklingsprosess.
5. Stage Isolasjon for mRNA Forberedelse
- Isolere enkelte scene follikler hjelp scenen isolasjon protokollen (trinn 2) med enten Grace eller IVEM media.
- Ved hjelp av en glass-pipette, beveger de enkelte stadier av interesse i nye brønner med mediet, er det mulig å samle flere trinn på en gang.
- Hold samling ganger underkant av 1 time. Beveg folliklene, ved hjelp av en glass-pipette, til 1,5 ml mikrofugerør.
- Spin røret kort i en mini-mikrosentrifuge for å klumpe alt av follikler. Ved hjelp av en trakk glass pipette (se trinn 3.4) forsiktig fjerne alt av media. MERK: Hvis du bruker en full størrelse mikrosentrifuge, spinne ned follikler ved lav hastighet.
- Tilsett 100 ul av Trizol og maler for hånd for ~ 20 sekunder ved hjelp av en plast støter. Spinn ned på full hastighet i en mikro og flytte Trizol til en ny 1,5 ml mikrosentrifugerør være forsiktig for ikke å forstyrre noen pelletert debris. Oppbevares ved -80 ° C.
- Gjenta trinn 05.01 til 05.05 fram til nok follikler er innhentet for forsøket. Rutinemessig, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, og ~ 100 S14 follikler gi ~ 10 mikrogram av RNA.
- Tine prøvene på is. Kombiner prøvene, som hensiktsmessig, i en micro rør og bringe Trizol volum opp til 800 mL. Fortsett med RNA isolering som anvist av produsenten. VIKTIG: Husk å DNase behandle isolert RNA med RNase gratis DNase.
6. Stage Isolasjon for Western Blotting
- Forvarm en varmeblokk til 100 ° C.
- Isolere enkelte scene follikler hjelp scenen isolasjon protokollen (trinn 2) med enten Grace eller IVEM media. MERK: Det er nødvendig å empirisk bestemme hvor mange av en bestemt scene hårsekken for å observere hver bestemt protein. For høyt uttrykte proteiner 1-3 S10B follikler / brønn er nok til å se et sterkt signal på en western blot. Imidlertid er det viktig å foreta enrepresentativt utvalg, tar follikler fra flere hunner. Således er 15-20 follikler av en bestemt scene vanligvis oppsamlet.
- Beveg follikler, ved hjelp av en glass-pipette, til et 1,5 ml mikro-sentrifugerør. Spin kort i en mini-mikrosentrifuge for å klumpe follikler (se trinn 5.4). Fjern forsiktig all media du bruker en trakk glass pipette (se trinn 3.4) og tilsett 50 mL 1x PBS og 50 mL av 2x Laemmli buffer.
- Grind for hånd for ~ 20 sek med en plast støter. MERK: Plast pestles kan gjenbrukes for sliping vestlige prøvene ved å vaske og autoklavering dem.
- Kok prøvene i 10 min i varmeblokk.
- Chill kort på is og sentrifugering ved full hastighet i 15 sekunder i en mikrosentrifuge. Enten umiddelbart laste på en SDS-PAGE gel eller oppbevar ved -20 ° C. MERK: Hvis prøvene er lagret, må du huske å reboil prøvene før du legger ut på gel.
- Utfør western blot analyse følgende standard protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når isolere spesifikke stadier av Drosophila follikkelutvikling er det viktig å være i stand til å nøyaktig skille de ulike morfologiske stadier. Det er noe vanskelig for S10A og S10B, som sykepleier celler og oocyte hver tar opp halve lengden av hårsekken på disse stadier (figur 1B i forhold til 1C). Men S10A follikler er kortere i lengden enn S10B follikler, som S10B follikler er fullt langstrakt og dermed lik i lengde til en S14 hårsekken (figur 1C forhold til 1G). I tillegg, en undergruppe av hårsekken eller somatiske celler over eggcelle kalles sentripetale follicle cellene begynner å migrere mellom sykepleier celler og eggcelle på S10B. Under S10B, som tar ~ 5 hr, sykepleier celler gjennomgå dynamisk aktin ombygging slik at på S11 sykepleierens celler kontrakt, klemme sine cytoplasmatiske innholdet i eggcelle. Dermed på S11, har sykepleieren celle regionenbetydelig redusert, mens eggcelle har utvidet (figur 1D). På S12, sykepleier cellene begynner å gjennomgå død og ta på seg en mer ugjennomsiktig utseende (figur 1E), interessant, i kultur, sykepleier cellerester curl dorsally i S12 follikler (se S12s i figurene 3C'-D '). I løpet av S13, er sykepleier celle regionen gjennomsiktig som celledød blir fullført, og dorsal vedheng dannelsen skjer (figur 1F). Av S14 bare eggcelle og hårsekken celler forblir, og dorsal vedheng formasjonen er komplett (figur 1G).
Den in vitro-utvikling av analysen kan brukes til å vurdere konsekvensene av forskjellige farmakologiske behandlinger og genetiske mutasjoner på S10B utvikling og sykepleier celle dumping (figur 3). Utviklingen av S10Bs i kultur er robust, men en rekke faktorer kan føre til dårlig eksperimentelle resultater. I figur 3A,eksperimentelle data fra både en vellykket og et mislykket forsøk er gitt. En vellykket eksperiment er ett hvori 80 til 100% av vill-type follikler i kontrollmedier komp sykepleier celle dumping og videre til S12-14 (figur 3A, wt 1). Av og til vill-type kontroller vil mislykkes, noe som betyr at færre enn 80% av folliklene utvikles (figur 3A, vekt 2). Denne svikt kan forårsakes av en rekke forhold, inkludert: 1). Manglende evne til å skille S10A fra S10B follikler (se figur 1 og 2), 2) medie problemer (temperatur, tid, osv.), og / eller 3) follikler var utsettes for rusk for lenge.
In vitro utvikling av S10Bs kan brukes i kombinasjon med farmakologisk behandling. For slike forsøk, er det viktig at stoffet kontroller, det vil si behandling av villtype follikler med medikamentet, er utført med hvert eksperiment, fordi stoffet effektivitet og / eller konsentrertion kan endre seg med tiden. For farmakologiske forsøk, er det fordelaktig å analysere forholdet mellom den prosentvise utvikling av follikler i stoffet behandling som den i kontrollmateriale, og dette styrer for små genetisk bakgrunn forskjeller. Det er ofte nyttig å behandle med IC50 konsentrasjonen av medikamentet, og dette er den konsentrasjon som blokkerer 50% av villtype-(yw) follicles fra gjennomgår sykepleier celle dumping og videreutvikling. . Således kan forholdet for villtype follikler forventet å være 0.5 (figur 3B, medikament 1) Figur 3B er et eksempel på hvordan et stoff (aspirin) kan bli for konsentrert (stoff 2, sannsynligvis på grunn av oppløsningsmiddel fordamper), og blokken større enn 50% av vill type follikler fra utviklingsland. For ytterligere å illustrere in vitro-utvikling av assay blir bildene av to brønner i utviklings S10B follikler tilgjengelig. Figurene 3C og D illustrerer S10B follikler ved begynnelsen avassay, i kontroll-eller aspirin behandlet (~ 2 mm) medium. figurene 3C 'og D' illustrerer slutten av analysen, avslører at flertallet av styre behandlede follikler utviklet til S14, mens størstedelen av aspirin behandlede follikler har ikke ferdig sykepleier celle dumping.
Den in vitro-utvikling av analysen kan også bli brukt til å screene for genetiske bakgrunner som er mer følsomme for et bestemt medikament. Figur 3E inneholder to eksempler på dette. I det første eksempel er genetisk bakgrunn (expt1, blå bar) unnlater å interagere med aspirin som forholdet forblir ~ 0,5, omvendt, i det andre eksempel, genetisk bakgrunn (expt2, red bar) forsterker effekten av aspirin. Således kan den in vitro utviklingen assay brukes for å definere de konsekvenser av mutasjoner og farmakologiske reagenser på den utviklingsmessige og morfologiske hendelser som skjer i løpet av sen oogenesen, i tillegg, analysen kan brukes til å vurdere både farmakologisk og genetisk interaksjoner (se 9).
Stage isolasjon kan også brukes til live-avbildning av utviklingsprosesser. Figur 4 er et eksempel på en time-lapse film fra en S10B hårsekken uttrykker Utrophin-GFP, aktin bindende domene fra humant Utrophin smeltet til grønt fluorescerende protein. Ved hjelp av denne imaging verktøy, aktin bunt dannelse og kondens kan visualiseres. Mange verktøy er tilgjengelig for live imaging, inkludert protein felle transgene linjer 16,17, UAS drevet fluorescently tagget organelle markører (mitokondriene, Golgi, endoplasmatisk retikulum, osv..), UAS drevet fluorescently tagget cytoskeletal markører (aktin og aktin bindende proteiner, microtubule og microtubule bindende proteiner), transgene linjer som uttrykker noe fluorescently tagget protein av interesse, og vitale fargestoffer (Nile Red etiketter nøytrale lipider, Edu etiketter replikere DNA, FM4-64 etiketter membraner).
ove_content "> Molekylær analyse kan utføres ved hjelp av isolerte stadier av Drosophila follikler. For proteinanalyse ved western blotting, er det nødvendig empirisk å bestemme hvor mange follikler, av et bestemt utviklingsstadium, er nødvendig for å observere for proteinet av interesse. Figur 5 er et eksempel på hvordan du sekvensielt fortynne en konsentrert protein lysatet å bestemme antall S10B follikler som trengs for å observere et bestemt protein, Fascin. I dette tilfellet en S10B hårsekken er tilstrekkelig til å observere dette proteinet av western blotting.
Figur 1. Diagram som beskriver den cellulære sammensetningen av Drosophila follikler og bilder som illustrerer den morfologiske forskjellen på midten til sent stadium Drosophila follicles. A. Diagram som viser den cellulære sammensetningen av en S10A hårsekken. BG. Representative bilder av S10A-S14 Drosophila follikler som er tatt med en stereo dissekere omfang. Drosophila hårsekken består av 16 germline-avledet celler: 1 oocytten (rød, A) og 15 sykepleier eller støtte celler (gul, A), som er omgitt av ~ 650 somatisk-avledet epitelceller (hvit, magenta og cyan, A ). Ved S10A, er en halvdel av lengden av hårsekken sammensatt av sykepleier celler (gul brakett, B), som er dekket av den strekk follicle celler (magenta i A), og den andre halvdel er sammensatt av oocytten (rød stjerne , B), som er dekket av de viktigste kropps follicle celler (hvite i A). På S10B, sykepleier celler (gul brakett, C) og oocytten (rød stjerne, C) hver komponere halvdel av length av hårsekken, men den totale lengden av hårsekken er nå lik som i en S14 hårsekken (sammenligne C til G). Under S11, sykepleier celler (gul brakett, D) raskt presse sine cytoplasmatiske innholdet i elongating eggcelle (rød stjerne, D) i en aktin / myosin avhengig prosess kalt sykepleier celle dumping. Av S12, har eggcelle (rød stjerne, E) fullt langstrakt som sykepleier celle dumping er komplett og bare sykepleier celle restene igjen (gul brakett, E). De sykepleier cellerester (gul brakett, F) komplett celledød på S13. S14 representerer helt moden hårsekken, som er sammensatt av eggcelle (rød stjerne, G), somatiske celler, og eggeskall, inkludert rygg vedheng (hvite piler, G). B. Scale bar = 0,1 mm.
Figur 2. Images gi en oversikt over eggstokk disseksjon og hårsekken isolasjon. A. Senk fly i dissekere media og innrette den slik at den holdes, etter tang, i nondominant hånd. B. Bruke den dominerende hånd, ta tak i hårstråene på bakre av magen. C. Trekk skjellaget av, utsette eggstokkene (gul pil). D. Arbeide fra fremre av magen mot bakre, forsiktig klem magen slippe eggstokkene (gul pil). E. Separer eggstokkene (gul pil) fra eventuelle gjenværende cuticle (rød pilspiss) og / eller indre organer (hvite pilspisser). F. Overfør de isolerte eggstokkene til en frisk godt inneholder dissekere media. G. Tease hverandre eggstokkene, ved hjelp av dissekere nåler, for å avsløre indiduelle follikler (sammenligne intakt eggstokk (øverst) til skilt eggstokk (nederst). Hvite pilspiss peker på en knivstukket S10B hårsekken, et eksempel på en hårsekken som ikke bør brukes for senere eksperimenter. H. Velg morfologiske stadier av interesse (Stages 10A -14 (S10A-S14) vist).
Figur 3. Eksempler på in vitro utviklings analyser. A. Oversikt over prosentandelen av S10B follikler som komplett utvikling i kultur. wt 1 er et eksempel på en forventet utvikling av villtype S10B follikler (96% u-), mens wt 2 er et eksempel på en svak utvikling i kultur (68% utvikling). Vi ville vanligvis forkaste hele eksperimentet hvis utviklingen av vill type S10B follikler i kontroll media er under 80%. B. 50 for aspirin for den prosentvise utvikling i kontrollmediet. Den IC50 er konsentrasjonen som blokkerer 50% av folliklene S10B fra å utvikle, og dette betyr villtype-verdien bør være ~ 0,5. Drug 1 er et eksempel på den forventede villtype-forhold (0.52), mens stoffet 2 er et eksempel på hva som skjer når legemiddelkonsentrasjonen blir for sterk (0,37). CD '. Bilder av in vitro-utvinningsbrønner. CC'. Styre behandles. DD '. Aspirin behandlet (~ 2 mM). CD. bilde av S10Bs ved starten av analysen. C'-D'. bilde av folliklene i endepunktet av analysen. Kontroll behandlet S10B follikler utvikle til S14s i kultur (C '), mens flertallet av aspirin behandlet follikler ikke klarer å fullføre sykepleier celle dumping (D').
Figur 4. Eksempel som viser bruk av isolerte S10B follicles for live imaging. AF. Maksimale projeksjoner av tre skiver fra time-lapse z-stabler av en S10B hårsekken isolert fra Utrophin :: GFP uttrykker transgene fluer (SQH-Utrophin :: GFP). A'-F '. Forstørrede innfellinger markere en enkelt sykepleier celle fra A- F. AF '. F-aktin (Utrophin :: GFP), hvit. A, A'. Tid (t) = 0 min. B, B '. T = 20 min. C, C'. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min. F, F '. t = 100 min. På det første tidspunkt, kan observeres korte aktin filamenter som strekker seg innover fra den sykepleier cellemembraner (A, A '). Disse aktin langstrakte filamenter gjennom de tidlige tidspunkter (BC 'sammenlignet med A, A') til de er fullt forlenget (D, D '). I senere tidspunkter, disse fullt avlange aktin filamenter deretter forkorte og kondensere hele sykepleier celle dumping (EF ') A. Scale bar = 50 mikrometer. A'. Scale bar = 10 mikrometer.
_upload/50493/50493fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg "/>
.. Figur 5 Illustrasjon av hvordan å bestemme antall follikler som trengs for å undersøke en bestemt protein ved Western blot analyse Dette er en western blot ser på Fascin uttrykk i S10B follikler (01:20, sn 7C, Cooley, L., utviklingsstudier hvbridom Bank (DSHB), utviklet i regi av NICHD og vedlikeholdes av University of Iowa, Institutt for biologi, Iowa City, IA, 52242). Tallene øverst representerer omtrentlig antall S10B follikler lastet per kjørefelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den Drosophila follicle består av bare et lite antall av celletyper, noe som gjør den ideell for både morfologiske og molekylære analyser. Videre, på grunn av strukturen av eggstokk, er det relativt enkelt å få tak i store mengder spesifikke faser av follikkelutvikling med en felles dissekere omfang og minimal opplæring. Som hvert trinn representerer et kort tidsmessig vindu, kan scenen isolasjon gi betydelige molekylære innsikt i utviklingsprosesser som oppstår under det stadiet. For eksempel har vi brukt mid-til-sent stadium hårsekken isolasjon å karakter genuttrykket endringene som skjer i løpet av S10B, S12 og S14 18. Denne analyse antyder en rekke tidligere uncharacterized gener er sannsynlig å bidra til follikkelutvikling og, i særdeleshet, eggeskall formasjonen.
Stage isolasjon kan gi dramatiske innsikt i morfologiske hendelser gjennom live bildebehandling. En slik avbildning kan utføres på al l stadier av Drosophila follikkelutvikling. Mens fokuset i dette arbeidet er S10B-14, blir leserne henvist til følgende artikler for live-avbildning av tidligere stadier: germarium 13, hårsekken tøyelighet 19, og scene 9 11,12,14. De nordiske kulturforhold benyttes i disse studiene er forskjellig fra de som er omtalt i dette arbeidet. Spesielt anvendes disse studiene Schneider Insect medier med varierende nivåer av FBS (2,5 til 15%), så vel som tilsetningen av insulin 11-13,19 og, i noen tilfeller, den ytterligere tilsetning av trehalose, metopren, 20-hydroksyekdyson og adenosin deamidase 14. Det er viktig å påpeke at disse live imaging studier har betydelig utvidet vår forståelse av hendelsene som oppstår under disse tidligere stadier av utviklingen. Men disse tidlige stadium folliklene ikke fremgang hele veien til den siste fasen av follikkelutvikling, S14. Motsatt vil S10B-13 utvikle til S14 i kultur.
ove_content "> Under S10B-S14 mange morfologiske prosesser oppstår som kan studeres av levende avbildning. For eksempel kan direkte avbildning brukes til å undersøke prosessen med sykepleier celle dumping, prosessen der sykepleier celler presse sine cytoplasmatiske innholdet i eggcelle å gi den alt den trenger for å fullføre embryogenesen. Sykepleier celle dumping kan bli observert av time-lapse avbildning ved hjelp overført lys 7 eller ved confocal imaging bruke transgene linjer uttrykker fluorescerende markører (se figur 4). Fortsatt bruk av levende avbildning er forventet å gi ny innsikt i de cytoskeletal dynamikk nødvendige for sykepleier celle dumping. Leve-avbildning av senere stadier har også utvidet vår forståelse av rygg vedheng primordia migrasjon og tubulogenesis 10.In vitro utvikling av S10B-S13 follikler kan benyttes for å definere de farmakologiske virkninger av begge reagenser og genetiske manipulasjoner på de prosesser som forekommerring i løpet av denne tiden. Vi har benyttet in vitro-utvikling av follikler S10B å etablere rollen til prostaglandiner i å regulere celle sykepleier dumping 7. Senere har vi brukt denne analysen for å utføre en farmakologisk-interaksjon skjermen, spesielt, har vi testet om tap av en kopi av en aktin regulator forsterker eller undertrykker sykepleier celle dumping feil på grunn av tap av prostaglandiner. Denne skjermen har avdekket en rekke antatte nedstrøms mål (ni og Spracklen, Meyer, og Tootle, upubliserte data). Målingen kan også brukes til å undersøke genetiske interaksjoner ved å vurdere utviklingsdefekter, slik som en blokk i sykepleier celle dumping, på grunn av heterozygositet i to forskjellige forhold (for et eksempel på dette se 9).
Mens isolere midten til sent stadium Drosophila follikler er en ganske enkel prosess, er det en rekke kritiske faktorer for optimal suksess. Først, er utarbeidelsen av fluersvært viktig. Det er best å opprettholde ulike genotyper av fluer i så lik en tilstand som mulig, det vil si antall fluer per hetteglass, forholdet mellom kvinner til menn (2:1 er ideelt), og sørg for frisk, våt gjær konsekvent. Fôring (våt gjær) og disseksjon tid vil endre utbredelsen av de ulike stadier av utviklingen. Vi har funnet ut at når fluene er konsekvent matet om morgenen, kan flere S10Bs bli isolert i morgen, mens flere S12s er til stede i ettermiddag. En annen kritisk faktor er mediet. For in vitro utvikling og direkte avbildning er det viktig å forberede ferske IVEM media. I tillegg, må mediet komme til romtemperatur så kalde medier vil forandre cytoskeletons, både actin og mikrotubuli, og derfor forstyrrer videre utvikling. Det er også viktig å holde follicles unna rusk. Noen ganger under disseksjonen, blir gut komme ut med eggstokkene. Vi har funnet at dersom tarmen er sprukketog folliklene er holdt i forurenset media, follicles er usannsynlig å utvikle seg i kulturen. Ettersom follikler fortsette å utvikle seg i kultur, er det viktig å bekrefte på nytt iscenesettelsen etter disseksjon før du fortsetter med enten in vitro utvikling eller molekylære analyser. Endelig er det viktig å ha riktig kontroller for eksperimentene. For in vitro-utvikling, er det nødvendig å bruke villtype follikler å teste at mediet kan for normal utvikling (80-100% fullstendige sykepleier celle dumping), og for å teste den farmakologiske reagenser opptrer som forventet (se figur 3).
I konklusjonen, kan isolering av midten til sent stadium Drosophila follikler gi betydelig innsikt i utviklingsprosesser gjennom en rekke eksperimentelle teknikker.
Tabell over spesifikke reagenser og utstyr:
| Navn på reagens | Selskapet | Catalogue nummer | Kommentarer (valgfritt) |
|---|---|---|---|
| Tørrgjær | Genesee Scientific | 62-103 | Noen kilde til tørrgjær er greit |
| Grace Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Varme-inaktivert føtalt bovint serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Enhver varmeinaktivert FBS bør arbeide |
| 10x Pen / Strep | Gibco / Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises og Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Vel | Corning | 7220-85 | |
| # 5 Dumont tang | Fin Science Verktøy | 11252-20 | |
| 24 multi-brønn plater | Becton Dickinson | 35 3226 | Enhver 24-brønnen vevskultur retten skal arbeide |
| Dekk Bottom Retter (35 mm) | Mattek Corporation | P35G-1.0-14-C | Dekkglass tykkelse vil avhenge av mikroskopet / objektiv som benyttes |
| Glass pipetter | Corning | 7095B-5x (for overføring av follikler) 7095B-9 (for fremstilling av trukket pipetter) | |
| Sample stampe (1,5 mL; RNase / DNase gratis) | Forskning Products International | 199228 | Enhver plast stampe som passer 1,5 mL mikrofugerør kan benyttes |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Thomas Lecuit (SQH-Utrophin :: GFP linje), den Bloomington Stock Center, og utviklingsstudier hvbridom Bank for reagenser. Vi videre takke alle medlemmer av Tootle Lab for nyttige diskusjoner og kritikk av manuskriptet. Midler fra National Science Foundation MCB-1158527, og oppstart midler fra anatomi og cellebiologi Institutt, Universitetet i Iowa støttet dette arbeidet. National Institutes of Health Predoctoral Training Grant i Farmakologisk Sciences T32GM067795 støttet AJS. Datalagring støtte ble gitt av ICTS, som er finansiert gjennom CTSA støttet av National Center for Research Resources og Nasjonalt Senter for Advancing Translasjonsforskerne Sciences, National Institutes of Health, gjennom Grant UL1RR024979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
