Summary
中旬至下旬果蝇卵泡舞台专用的隔离是用于各种用途。这类卵泡发育中培养，其允许基因和/或药理学操作成与体外测定法的开发和实时成像。此外，毛囊，可用于分子生物学研究，如分离mRNA和蛋白。
Abstract
果蝇卵子或卵泡发育已被广泛用于促进复杂的发育和细胞生物学过程的理解。此方法主要介绍如何隔离中期到晚期滤泡（舞台10B-14），并利用它们来提供新的见解时的发育时间紧窗户发生的分子和形态学的事件。分离的毛囊可用于各种实验技术，包括在体外发育分析，实时成像，基因表达分析和蛋白质印迹分析。在卵泡期10B（S10B）或更高版本将完成发展文化，这使得一个基因或药物扰动结合体外发育定义这样的操作对开发过程中的特定时期发生的过程的影响。此外，由于这些卵泡发育，在文化，它们非常适合于实时成像研究，这往往表明调解形态事件的新机制。分离的毛囊也可用于分子分析。例如，在基因表达的变化所导致的遗传扰动可以被定义为特定的发育窗户。此外，在卵泡发育的特定阶段的蛋白质水平，稳定性和/或翻译后修饰状态可以通过蛋白印迹分析检查的分析。因此， 果蝇卵泡阶段特异性的隔离提供了一个丰富 的信息源纳入发展和形态的广泛保守的进程。
Introduction
每个果蝇卵巢由〜16卵巢管，或依次成熟卵室或滤泡链。每个毛囊是由一个单一的卵母细胞，15种系衍生的护士或支持细胞，称为卵泡细胞（ 图1A）〜650体细胞。 果蝇卵子发生划分为14个形态学定义开发1阶段。卵泡发育的各个阶段是在一个苍蝇看到了很多次，使它相对容易隔离的特定阶段的卵泡有相当数量。
卵子发生（阶段10B-14）的中期到晚期是特别适合于隔离阶段（ 图1）。在第一阶段10B（S10B），卵泡完全伸长（ 即其长度等于一个阶段14（S14）卵泡，参见图1和图2H）和毛囊的长度的一半是由护士细胞而另一半是卵母细胞（ 图1C）。在这个阶段，护士细胞发生戏剧性的肌动蛋白重塑，加强皮层肌动蛋白和产生微丝2的平行束。在同一时间，卵泡细胞群，称为心细胞，在迁移护士细胞和卵母细胞之间，和卵泡细胞2背团成为指定接受迁移以形成背侧附属物，管状呼吸装置的胚胎3 。护士细胞，然后合同（S11），其细胞质内容挤进卵母细胞在一个叫护士细胞倾销过程中，它提供了与卵母细胞所必需的因素，它完成胚胎发育（ 图1D）。护士细胞，然后经历细胞死亡（S12-S13）4，和卵泡细胞分泌和图案蛋壳5（ 图1E-G）。因此，卵子发生的到底是富有重要的发展ð形态发生过程。
分离的中期到后期阶段的卵泡（S10B-S14），可以用于各种用途，包括分子分析。例如，mRNA的上演卵泡可以分离用于RT-PCR，微阵列，或RNA定序分析。这使得一看基因表达在短期内发展的窗口，与目前只有少数细胞类型，并确定如何基因表达受任何药物或遗传扰动改变。级分离，也可用于通过Western印迹来看待蛋白质。这种分析是很重要的，因为它允许一个量化蛋白表达水平与野生型相对于在特定阶段的突变体。虽然人们可以使用免疫荧光分析，以达到类似的结果，荧光定量是由于严格的要求，所有的像素被检测6的线性范围内较不稳健。此外，免疫印迹分析可以提供其它信息，例如一个s如果蛋白质被翻译后修饰，或者被从一个特定的剪接同种型表达。分离的阶段，也可以用于进一步的纯化蛋白，包括亚细胞分级或免疫共沉淀。
阶段特异性毛囊分离，也可用于在体外测定法的发展7和实时成像8。隔离S10B-S13卵泡会继续发展到S14在简单的培养基（见下文）。要注意，S10A毛囊不会通过护士细胞进度使用本手稿讨论的培养条件下倾倒是很重要的。我们已经使用S10B 体外发育检测，以确定前列腺素的作用，既药理学和基因，在通过护士细胞倾销与发展为已读奏7,9调节肌动蛋白重塑。同样，开发的后期阶段也可以被分离，以确定药物治疗或基因的人的影响ipulations在特定的过程，如心细胞迁移，背附属物迁移/ 10的形成，和护士细胞死亡。此类测定法可用于执行显性交互屏幕或测定，例如，在杂合子的PXT或中fascin单独突变对S10B 体外发育没有任何效果，从双重杂合子展览护士细胞倾倒缺陷和在发展9块卵泡。
此外，由于S10B-13能在文化发展，都在这段时间发生的过程中，可以通过实时成像观测。这种成像可以简单地使用透射光（如果有一个只关心总的变化形态）或共聚焦显微镜利用转基因果蝇表达的荧光探针或滤泡沾上实时成像染料进行。实时成像被用来大大促进我们的发展过程的理解。事实上，住IMAGIN克的晚期阶段的卵泡不断扩大背侧附属物迁移的知识，小管10的一个例子。我们预计，额外的后期处理，包括护士细胞倾销过程中肌动蛋白动力学，实时成像将提供新的见解这些发育事件。需要注意的是，虽然S10A和卵泡发育的早期阶段就不会继续发展成S14的文化，活在成像过程中发展的阶段发生的事件有可能使用的替代培养条件11-14（见讨论更重要的是信息）。
在这里，我们提供详细的协议进行隔离晚期毛囊无论是在体外发育和生活成像，或分子分析（mRNA和蛋白分离）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。准备果蝇在此之前隔振
- 通过合并将50g活性干酵母用90毫升蒸馏水使湿酵母膏。混合用锅铲结合。让混合物静置约30分钟评估一致性之前。一致性应该是刚刚够厚坚持苍蝇小瓶的一面，但还没办下来的一面。以达到预期的一致性，可能需要添加最多加入10ml额外的水或少量干酵母。存放在有盖的容器中，在4°C。所存储的酵母可用于〜1-2周。
- 收集<24小时旧成蝇所需的基因型（男性和女性），并把它们与飞食品加湿酵母膏涂抹在小瓶的侧面小瓶。在该蝇维持温度将取决于实验的不同而不同。对于常规的实验，苍蝇都保持在室温。而实验，其中一个基因是使用UAS/GAL4系统15被过度表达可能需要维持蝇，在25℃或更高，适当的。
- 每天提供苍蝇与酵母膏的涂抹新鲜的2天。注意：由于卵泡发育是由雌蝇的营养状况紧密调节，它是必不可少的，以提供即时的营养丰富的酵母膏为至少36小时之前剥离。
2。隔离中旬至下旬上演果蝇卵泡
- 允许介质来至室温（〜30分钟）。如果上演卵泡将要被用于在体外测定法的发展，新鲜制备IVEM媒体（Grace的昆虫媒介，10％热灭活的胎牛血清和1x青霉素/链霉素）。如果上演卵泡将要用于mRNA或蛋白分离使用任Grace的昆虫或IVEM媒体。重要提示：介质温度是至关重要的。如果媒体是冷的它会改变无论是肌动蛋白和微管细胞骨架和块的发展。
- 通过注入CO 2气体麻醉苍蝇在yeasted小瓶中，并放置3-5雌性果蝇到飞垫CO 2条件下。重要提示：不要让更多的女性比可以在10分钟时间内被解剖上飞垫作为长期暴露在二氧化碳可引起不育和死亡。
- 填补9点板与媒体之一好，把它放在一个黑暗的表面上（一块黑色有机玻璃效果很好）。专注于井底的解剖范围。
- 使用＃5杜蒙钳拿起用一只手一个单身女性（这最好是通过使用惯用手）。它往往是最容易拿起女性的翅膀，腿，胸部或腹部来过渡。淹没女性在一个充满良好的媒体。调节显微镜的焦距是必要的。
- 使用第二钳子在非优势手持，抓住女性在腹部的前端使后端被定位朝向优势手（ 图2A）。一定要保持淹没在媒体苍蝇。
- 与惯用手，用钳子抓住角质层在第二最后色素段和撕离腹部（ 图2B-C）的其余部分。
- 使用优势手的镊子，轻轻挤压腹部的前端，直到出现卵巢（图2D-E）。如果有必要，将镊子在两个卵巢之间以及拉出来的胴体。
- 无论是移动卵巢一口新井用新鲜培养基（图2F）或取出尸体到的Kimwipe或纸巾。这是如果毛囊被隔离在体外发育尤为重要。
- 重复，直到3-5对卵巢已被隔离。注：每个卵巢由〜16卵巢管或顺序成熟卵泡链。每个卵巢管包含在一个肌鞘。
- 用针虎钳，并与他们提供的针，轻轻拉开卵巢通过运行卵巢管（ 图2G）的针。这有时会释放出单个毛囊为好。
- 个别卵巢管和卵泡发育的很容易分辨形态的阶段现在应该是可见的（ 图2G，取笑除了卵巢）。参阅图1和图2H为可用于区分不同的阶段的形态差异。以分离的毛囊是完好卵巢管内，但仍包含在肌鞘，用针穿过卵巢管切割的前卵泡的前部，并在卵泡的后即刻感兴趣的卵泡以下。这将打破肌鞘和感兴趣的卵泡了，现在可以切离相邻的毛囊不会造成损坏。 作为单独的阶段是分开的，将所感兴趣的卵泡，用玻璃移液管，以一个新的井用新鲜培养基。分离毛囊的体外发育时，这一点尤为重要。注意：在进入媒体，以防止气泡从再分配感兴趣的卵泡整个井前挤移液器灯泡是很重要的。此外，如果毛囊附着在玻璃吸管，该吸管可以通过吸取的BSA溶液上下数次并用解剖介质漂洗预涂用3％牛血清白蛋白（BSA）。
- 一旦有足够的卵泡已被隔离，进行后续实验。
3， 在体外发育S10B卵泡
- 使用阶段隔离协议（步骤2）在IVEM介质隔离S10B卵泡。确保毛囊迅速远离碎片。由于这些毛囊会不断成熟，它的IMPOrtant该S10Bs收集30-60分钟，然后放置到所选择的成熟媒体。注：S10B需要被小心地从S10A卵泡（ 图1C相比，1B）区分开来，因为S10A卵泡不会在IVEM培养基成熟。在这两个S10A和S10B卵泡，一半长度的由护士细胞，而另一半是在卵母细胞，但在S10B毛囊的长度是等于该S14的卵泡。
- 使用玻璃移液管中，将约30 S10B卵泡到24孔组织培养板的孔中。注意：请务必确认所有正在传输的卵泡是S10B，并没有成熟到S11。
- 准备1微升成熟的媒体，每孔， 即 IVEM媒体加药理学试剂。
- 使用拉玻璃移液管*，从油井（步骤3.2）中删除尽可能多的媒体的可能，并迅速补充选择成熟的媒体。注：必须使用一个拉玻璃点子ETTE作为阶段性的卵泡可以很容易地采取了两种玻璃吸管或移液器吸头用的Pipetman。
*为了使拉移液管：1）加热的长，玻璃移液管在本生灯的火焰中的薄的部分只是直到玻璃开始软化; 2）紧接在使移液管出来的火焰和拉水平地画出吸管进更细管; 3）打破生成一个细点。注意：使用保护眼睛的玻璃碎片可能飞了出去。 - 尽可能多井重复步骤3.1-3.4的实验需要。
- 让卵泡制定> 10小时，根据得分解剖范围的发育进程。注：实验通常打进第二天，以便有足够的时间使卵泡发育。 S10B是〜5小时，S11是〜30分钟，S12是〜2小时，和S13是〜1小时，持续时间在25°C 1和发展在室温下需时稍长。类似的实验，以对于S10B卵泡描述可使用S11-S13毛囊进行。
4。舞台隔离实时成像
- 隔离后期阶段的卵泡（S10B-14）表示所选择的荧光标记物使用阶段隔离协议（步骤2）在IVEM媒体，快速移动的卵泡远离碎屑。
- 移动感兴趣的毛囊进入新媒体，然后通过玻璃吸管转移到盖玻片底培养皿。小心，这样它泡在盖玻片底部区域，但不会波及添加介质。
- 对于较长的时间推移的电影，有时需要通过增加一个卷起的Kimwipe，用水润湿，向培养皿的内侧边缘，以保持培养皿内的湿度。将盖在上面。
- 图像上的倒置显微镜。详细解析将需要共聚焦显微镜。这是必要的，以平衡成像，照明的强度，并且成像的长度的频率，这将需要被独立地计算出每个升abeling工具和发育过程。
5。舞台隔离的mRNA的制备
- 使用阶段隔离协议（步骤2）无论是Grace的或IVEM介质隔离各个阶段的卵泡。
- 用玻璃吸管，将兴趣变成新井与媒体的各个阶段，它可以收集多个阶段一次。
- 继续收集时间在1小时。移动卵泡，用玻璃移液管，1.5 ml离心管中。
- 简要地旋管在微型离心沉淀所有的卵泡。使用拉玻璃移液管（见步骤3.4），小心地取出所有介质。注意：如果使用的是全尺寸的离心，离心卵泡在低速。
- 加入100μlTrizol法和手工研磨的〜20秒使用塑料杵。在微量降速全速移动的Trizol到一个新的1.5 ml离心管中，小心不要打扰任何沉淀ðebris。储存在-80℃。
- 直到有足够的卵泡已为实验获得重复步骤5.1-5.5。通常，〜75 S10B，〜75 S12，和100〜S14的毛囊产生〜10微克的RNA。
- 在冰上解冻样品。结合样品（如适用），成一个离心管中，并把Trizol试剂量高达800微升。与RNA分离进行所指示的制造商。重要提示：请记住，DNA酶处理分离的RNA与RNA酶的DNA酶自由。
6。隔离阶段免疫印迹
- 预热的加热块到100℃。
- 使用阶段隔离协议（步骤2）无论是Grace的或IVEM介质隔离各个阶段的卵泡。注：这是必要的，以经验判断需要多少的特定阶段的卵泡，观察每一个特定的蛋白质。对于高表达的蛋白质1-3 S10B卵泡/孔也足以看出在免疫印迹的强烈信号。但是，它提出的是一个重要的代表性的样本，同时从多个女性卵泡。因此，毛囊15-20特定阶段的通常收集。
- 移动卵泡，用玻璃移液管，到1.5ml微量离心管中。在微型离心旋转简要沉淀的卵泡（参见步骤5.4）。小心使用拉玻璃移液管取出所有介质的（见步骤3.4），并加入50微升的1×PBS和50微升的2倍Laemmli缓冲液。
- 手工研磨的〜20秒用塑料杵。注：塑料杵可以重复用于磨削西方样品洗涤和热高压消毒。
- 在热块煮沸样品10分钟。
- 简要地对冰和旋全速15秒，微寒意。无论是立即加载到-20°C的SDS-PAGE凝胶或商店注意：如果样本存储，记得再沸样品装载到凝胶前。
- 下列标准协议进行免疫印迹分析。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
当分离果蝇卵泡发育的特定阶段，必须能够准确地分辨出不同的形态阶段。这是S10A和S10B颇具挑战性，因为护士细胞和卵母细胞的每个占用毛囊长度的一半在这几个阶段（ 图1B相比， 图1C）。然而，S10A毛囊长度短于S10B卵泡，作为S10B毛囊充分拉长，从而在长至S14毛囊（ 图1C相比1G）相等。此外，毛囊或体细胞在所谓向心力毛囊细胞的卵母细胞的一个子集开始迁移护士细胞和卵母细胞在S10B之间。在S10B，这需要〜5小时，护士细胞进行动态肌动蛋白重塑，使在S11护士细胞收缩，挤压他们的细胞质内容物进入卵母细胞。因此，在S11中，护士的细胞区域有显著下降，而卵母细胞已经扩大（ 图1D）。在S12中，滋养细胞开始发生死亡和采取更不透明的外观（ 图1E），有趣的是，在文化，在S12中的卵泡细胞护士残存背部卷曲（见S12S 图3C'-D'）。在S13中，护士单元区域是透明的，因为细胞死亡被完成，背附肢的形成发生（ 图1F）。由S14仅卵母细胞和卵泡细胞仍然存在，背附肢完全形成（ 图1G）。
在体外测定法的发展可以用来评估对S10B发展和护士细胞倾倒（ 图3）的各种药物治疗和基因突变的后果。 S10Bs在文化的发展是健壮的，但是一些因素可以导致差的实验结果。在图3A中，提供无论从成功和失败的实验的实验数据。一个成功的实验是在控制媒体野生型卵泡80-100％完成护士细胞倾销和进步到S12-14（ 图3A，重量1）。偶尔野生型对照将失败，也就是说，只有少于80％的卵泡发育（ 图3A，重量2）。这种故障可通过许多问题，其中包括下列原因引起：1）不能从S10B卵泡区分S10A（参照图1和图2），2）媒体的问题（温度，年龄等 ），和/或3）滤泡暴露在碎片时间过长。
在体外发育S10Bs的可与药物治疗结合使用。对于这样的试验，它是重要的药物的控制， 即治疗的野生型毛囊的药物，都与每个实验进行，因为药物的有效性和/或concentrat离子可以随时间变化。用于药物实验，可以很方便地分析卵泡在药物治疗，在控制媒体的发展之比的百分数，这控制在微小的遗传背景的差异。这是非常有用的治疗与IC 50浓度的药物，这是块野生型（YW）50％由护士进行细胞倾销和进一步发展卵泡的浓度。因此，该比例为野生型毛囊预期为0.5（ 图3B，药物1） 图3B是怎样的药物（阿司匹林）可以变得过于集中（药物2;可能是由于溶剂的蒸发），例如，与块大于50％来自发展中国家的野生型卵泡。为了进一步说明， 在体外测定法的发展，提供了两个孔显影S10B卵泡的图像。 图3C和D示出了S10B卵泡在的开头测定中，在控制或阿司匹林（〜2毫米）的介质。 图3C'和D'示出了在测定结束时，揭示了多数发展到S14，而大多数的阿司匹林治疗毛囊没有控制处理的毛囊完成护士细胞倾销。
在体外测定法的发展，也可以用于筛选遗传背景是一个特定的药物更敏感。 图3E中包含的这两个例子。在第一个例子中，该遗传背景（expt1，蓝色条）没有与阿司匹林相互作用的比率保持〜0.5，相反，在第二个例子中，该遗传背景（expt2，红色条）增强了阿司匹林的效果。因此， 在体外培养法可用于定义在晚卵子发生的发育和形态的事件突变和药理学试剂的后果;另外，该测定可以用来评估在药理学和遗传相互作用（见9）。
级分离，也可用于对发育过程的实时成像， 图4是S10B卵泡表达的utrophin-GFP，从人的utrophin的肌动蛋白结合结构域融合到绿色荧光蛋白的一个定时影片的一个例子。使用这种成像工具，肌动蛋白束的形成和凝结可视化。许多工具可用于实时成像，包括蛋白质陷阱转基因株系16,17，UAS驱动的荧光标记的细胞器标记（线粒体，高尔基体，内质网等 ），UAS驱动的荧光标记的细胞骨架标记物（肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白，微管和微管结合蛋白），表示任何转基因株系的荧光标记蛋白的利益，至关重要的染料（尼罗红标签中性脂肪，埃杜标签复制的DNA，FM4-64标签膜）。
ove_content“>分子分析可以使用果蝇毛囊分离的阶段中进行，对于通过蛋白质印迹分析的蛋白质，它以经验确定发展的特定阶段的多少卵泡，必须遵守的目的蛋白质是必要的。 图5是如何依次稀释浓缩的蛋白裂解物，以确定需要观察特定的蛋白质，Fascin的S10B卵泡的数量，例如，在这种情况下1 S10B卵泡是足以通过Western印迹观察到这种蛋白质。
图1图描述果蝇卵泡和图像说明中到晚期果蝇 FOL的形态差异的细胞组成licles。A.图描绘了S10A卵泡。BG的细胞组成。的使用立体声解剖范围采取S10A-S14 果蝇卵泡代表性图像。 果蝇卵泡由16种系来源的细胞：1卵母细胞（红，A）和15护士或支持细胞（黄色，A），它是由〜650体细胞来源的上皮细胞（白色，品红色和青色，A围住 ）。在S10A，一半的毛囊的长度是由护士细胞（黄色托架，B），这是包括在伸展毛囊细胞（品红A）中所述的，而另一半是由卵母细胞（红色星号的，B），该部分在主体毛囊细胞（白中的A）。在S10B，护士细胞（黄色支架，C）和卵母细胞（红色星号，C），每个组成一半的乐毛囊NGTH然而卵泡的总长度是现在等于一个S14卵泡（比较C至G）的。在S11中，滋养细胞（黄色支架，D），他们迅速细胞质内容物挤入延长卵母细胞（红色星号，D）中的肌动蛋白/肌球蛋白依赖的过程被称为细胞的护士倾倒。由S12中，卵母细胞（红色星号，E），充分拉长为护士细胞倾销是完整的，只有护士细胞残余留（黄色支架，E）。护士残余细胞（黄色架，F）的完整的细胞死亡在S13中。 S14表示完全成熟的卵泡，它是由卵母细胞（红色星号，G），体细胞，和蛋壳，包括背侧附属物（白色箭头所示，G）。B.比例尺= 0.1毫米。
图2。图像提供卵巢切除和毛囊分离的概述。 A.淹没飞在解剖媒体和定位，使其持有，产钳，在非优势手。B.使用惯用手，抓住角质层在腹部的后部。C.拉角质层过，暴露卵巢（黄色箭头）。D.从腹部的前部工作朝向后方，轻轻挤压腹释放卵巢（黄色箭头）。E.从任何剩余的角质层分离卵巢（黄色箭头）（红色箭头）和/或内部器官（白色箭头）。F.转移分离的卵巢到新鲜的孔含有解剖介质。G.取笑除了卵巢，用解剖针，以暴露悠维杜阿尔卵泡（完整卵巢（顶部）进行比较，以分离卵巢（底部）。白色箭头指向一个捅S10B毛囊，不应该被用于后续的实验。H.选择感兴趣的形态阶段（阶段10A卵泡的一个例子-14（S10A-S14）中所示）。
图3： 在体外发育测定的实例。的S10B的百分比A.图表卵泡文化全面发展。重量1是野生型S10B卵泡（96％发展）预期发展的一个例子，而重量2是在文化发展不佳（68％发展）的一个例子。我们通常会放弃整个实验，如果野生型S10B卵泡在控制媒体的发展是在80％以下。B. 50为阿司匹林的比例发展中控制媒体媒体发展（dev.）的百分比率的图表。该集成电路50是浓度，阻止50％，由开发S10B卵泡的，这意味着与野生型的值应为〜0.5。药物1是预期的野生型比（0.52）的一个例子，而药物2是当药物浓度过强（0.37）。CD会发生什么，例如，'。 体外开发井排量图像。'控制处理。DD'。阿司匹林治疗的S10Bs在该测定。C'-D的开始（〜2毫摩尔）。 光盘。图像'的滤泡。图像在该测定的终点。控制处理S10B卵泡发育到S14s文化（C'），而大多数的阿司匹林治疗毛囊无法完成护士细胞倾销（D'）。
图4。示例显示了使用隔离S10B的毛囊实时成像。自动对焦，3片从时间推移的z栈一个S10B从毛囊中分离的utrophin的最大预测：绿色荧光蛋白表达的转基因果蝇（SQH-的utrophin :: GFP）。A'-F'。放大的插图突出一个护士从细胞A- F.自动对焦'F-肌动蛋白（肌营养相关蛋白:: GFP），白A，A'。时间（t）= 0分钟B，B'，T = 20分钟，C，C'，T = 40分钟。 D，D'，T = 60分钟，E，E'，T = 80分钟，F，F'，T = 100分钟。在最初的时间点，短肌动蛋白细丝可以观察到从护士细胞膜（A，A'）向内延伸。这些微丝拉长整个（'相比，A，A'BC）的早期时间点，直到他们完全拉长（D，D'）。在稍后的时间点，这充分拉长肌动蛋白丝再缩短，凝聚整个护士细胞倾销（EF'）A.比例尺= 50微米。A“。比例尺= 10微米。
_upload/50493/50493fig5highres.jpg“SRC =”/ files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg“/>
。图5插图如何确定审查通过免疫印迹分析一种特定的蛋白质所需的毛囊数量 ，这是一个印迹看着Fascin的表达S10B卵泡（1:20，SN 7C，库利，L.;发展研究杂交瘤细胞银行（DSHB），NICHD的主持下开发和爱荷华大学生物系，爱荷华市，爱荷华，52242）维持。在顶部的数字代表每车道加载S10B毛囊的大致数量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
果蝇卵泡是由只有少数细胞类型，使得它非常适合于形态学和分子分析。此外，由于卵巢的结构，它是比较容易获得大量的卵泡发育的特定阶段的一个共同的解剖范围和最少的培训。由于每个阶段代表一个短的时间窗口，舞台隔离可以提供显著分子见解在那个阶段发生的发育过程。例如，我们使用中期到晚期滤泡隔离表征S10B，S12，和S14 18过程中出现的基因表达的变化。此分析显示了一些以前未知的基因是可能有助于卵泡发育，特别是，蛋壳的形成。
舞台隔离可以通过实时成像提供了戏剧性的见解形态的事件。这种成像可以对人进行 果蝇卵泡发育升阶段。虽然这项工作的重点是S10B-14，读者可以参考以下文章为现场成像的早期阶段：germarium 13，卵泡伸长率19，和舞台9 11,12,14。在这些研究中所采用的培养条件与在此讨论的工作截然不同。具体而言，这些研究中使用施耐德的昆虫媒介与FBS（2.5-15％）的可变水平以及增加胰岛素11-13,19的，并且在一些情况下，再加入海藻糖，烯虫酯，20 -羟基，和腺苷脱酰胺14。它指出，这些实时成像研究已经显著提高了我们在开发过程中的这些早期阶段发生的事件的了解是很重要的。然而，这些早期阶段的卵泡不能进步一路卵泡发育，S14的最后阶段。相反，S10B-13将发展到S14的文化。
ove_content“>在S10B-S14许多形态发生的过程，可以通过实时成像来研究。例如，实时成像可以被用来检查护士细胞的过程中倾倒，通过该滋养细胞的胞质内容物挤入卵母细胞的过程向它提供它需要完成胚胎发育。护士倾销细胞可以通过时间推移成像采用透射光7或通过共聚焦成像用表达荧光标记的转基因品系（ 见图4）。续使用实时成像观察一切有望提供新的见解需要护士细胞倾销细胞骨架动力学。实时成像后期阶段，也提高了我们背附肢原基的迁移和小管10的理解。在 S10B-S13卵泡体外发育可以用来产生定义这两个药物试剂和基因操作对过程的影响在这段时间响起。我们已经用在 S10B卵泡体外发育建立在调节细胞护士7倾销前列腺素的作用。随后，我们一直在用这个实验来进行药物相互作用的屏幕，具体而言，我们一直在测试，如果中的肌动蛋白调节一个副本丢失增强或抑制细胞护士倾倒，由于前列腺素的损失的缺陷。此屏幕显示了一些推定下游靶（9 Spracklen，迈耶和废话，未发表资料）。该测定法还可以用于通过评估发育缺陷，如在护士细胞块倾倒，由于杂合性为两个不同的因素（一个这样的例子见9）检查遗传相互作用。
同时隔离中到晚期果蝇卵泡是一个相当简单的过程，有许多关键因素，以达到最佳的成功。首先，苍蝇的准备工作非常重要的。最好是在类似的条件保持不同基因型的苍蝇越好， 即蝇每小瓶的数量，女性与男性（2:1的比例是理想的）的比率，并且始终如一地提供新鲜的湿酵母。进料（湿酵母）和解剖时间会改变发展的不同阶段的患病率。我们已经发现，当苍蝇喂始终在早上，更S10Bs可以隔离在上午，而更多的S12S出现在午后。第二个关键因素是媒体。对于体外发育和实时成像，必须准备新鲜IVEM媒体。此外，该介质必须恢复到室温冷介质将改变细胞骨架，肌动蛋白和微管，因此，扰乱进一步发展。同样重要的是要保持毛囊远离碎屑。有时候，在剥离时，肠道会出来与卵巢。我们已经发现，如果在肠道破裂和卵泡都保持在受污染的介质，卵泡不大可能在培养来培养。作为卵泡继续培养开发，有必要继续进行在体外发育或分子分析前重新验证解剖后的分期。最后，有适当的控制的实验是非常重要的。用于体外发展，有必要使用野生型毛囊来测试该介质允许正常发育（80-100％完整护士细胞倾倒），并测试其药理试剂起到预期的作用（ 见图3）。
总之，为中至后期阶段果蝇卵泡隔离可以通过多种实验技术提供显著洞察发育过程。
表特定的试剂和设备：
| 试剂的名称 | 公司 | 猫alogue号 | 评论（可选） |
|---|---|---|---|
| 活性干酵母 | 杰纳科学 | 62-103 | 活性干酵母的任何来源是细 |
| Grace昆虫媒介 | 龙沙 | 04-457F | |
| 热灭活的胎牛血清 | 亚特兰大生物制品 | S11050H | 任何热灭活FBS应该工作 |
| 10倍笔/链球菌 | GIBCO / Invitrogen公司 | 15140-122 | |
| 针虎钳和针头 | 特德佩拉公司 | 13561-10 | |
| 现货板块方面，九井 | 康宁 | 7220-85 | |
| ＃5杜蒙钳 | 精细的科学工具 | 11252-20 | |
| 24多孔板 | 碧迪 | 35 3226 | 任何24孔组织培养皿应该工作 |
| 盖玻片底菜（35毫米） | MatTek公司 | P35G-1.0-14-C | 盖玻片厚度将取决于所使用的显微镜/目标 |
| 玻璃吸管 | 康宁 | 7095B-5x（用于传输卵泡） 7095B-9（用于生产拉移液器） | |
| 样品杵（1.5微升; RNA酶/ DNA酶） | 研究国际产品 | 199228 | 适合1.5微升微量离心管中任何塑料杵可以使用 |
| 三唑 | Invitrogen公司 | 15596-018 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有什么可以透露。
Acknowledgments
我们要感谢托马斯Lecuit（SQH-的utrophin :: GFP线），布卢明顿库存中心，以及发育研究杂交瘤细胞银行试剂。我们还要感谢废话实验室全体成员的稿件有益的讨论和批评。从资助的美国国家科学基金会MCB-1158527，和启动从解剖学和细胞生物学系基金，爱荷华大学支持这项工作。健康博士前培训格兰特在药理科学T32GM067795国家机构支持AJS。数据存储支持通过信息通信技术，它是通过由国家研究资源中心和国家中心推进转化科学，国立卫生研究院，通过格兰特UL1RR024979支持CTSA提供资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
