Summary
Stage-specifieke isolatie van midden tot late Drosophila follikels is bruikbaar voor verschillende doeleinden. Deze follikels ontwikkelen cultuur, die zorgt voor genetische en / of farmacologische manipulaties worden gecombineerd met in vitro assays en levende ontwikkeling beeldvorming. Bovendien kan follikels worden gebruikt voor moleculaire studies, zoals het isoleren van mRNA en eiwit.
Abstract
Drosophila oögenese of follikel ontwikkeling is op grote schaal gebruikt om het begrip van complexe ontwikkelings-en cel biologische processen te bevorderen. Deze methoden paper beschrijft hoe mid-to-late stadium follikels (Stage 10B-14) te isoleren en ze gebruiken om nieuwe inzichten in de moleculaire en morfologische gebeurtenissen tijdens strakke ramen van ontwikkelingstijd. Geïsoleerde follikels kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van experimentele technieken, zoals in vitro ontwikkeling testen levende beeldvorming mRNA expressie analyse en Western blot analyse van eiwitten. Follikels 10b (S10B) of later voltooiing ervan in cultuur, dit maakt het mogelijk om genetische of farmacologische verstoringen combineren met in vitro ontwikkeling ten gevolgen van deze manipulaties op de processen die optreden tijdens bepaalde perioden van ontwikkeling definiëren. Bovendien, omdat deze follikels zich in kweek, ze zijn ideaal voor levende weergavestudies, Die vaak onthullen nieuwe mechanismen die morfologische gebeurtenissen bemiddelen. Geïsoleerde follikels kan ook worden gebruikt voor moleculaire analyse. Zo kunnen veranderingen in genexpressie als gevolg van genetische storingen worden gedefinieerd voor specifieke ontwikkelingsstoornissen ramen. Daarnaast kunnen eiwit niveau, stabiliteit en / of posttranslationele modificatie toestand tijdens een bepaald stadium van de follikelontwikkeling onderzocht door western blot analyses. Aldus stadium-specifieke isolatie van Drosophila follikels geeft een rijke bron van informatie in sterk geconserveerde ontwikkelingsprocessen en morfogenese.
Introduction
Elke Drosophila eierstok bestaat uit ~ 16 ovarioles of ketens van opeenvolgend rijpende ei kamers of follikels. Elke follikel bestaat uit een oöcyt, 15 kiemlijn afkomstig verpleegkundige of steuncellen en ~ 650 somatische cellen genoemd follikel cellen (Figuur 1A). Drosophila oögenese bestaat uit 14 morfologisch gedefinieerde stadia van ontwikkeling 1. Elke fase van de follikelontwikkeling wordt vaak waargenomen binnen een vlieg, waardoor het relatief eenvoudig om een groot aantal fasespecifieke follikels isoleren.
De mid-to-late stadia van oögenese (Etappes 10B-14) zijn bijzonder goed geschikt voor fase isolatie (figuur 1). In fase 10B (S10B), wordt de follikel volledig verlengd (dat wil zeggen de lengte gelijk is aan die van fase 14 (S14) follikel, zie figuur 1 en figuur 2H) en de halve lengte van de follikel bestaat uit cellen nurseterwijl de andere helft de eicel (figuur 1C). In dit stadium van de verpleegkundige cellen ondergaan dramatische actine verbouwing, het versterken van de corticale actine en het genereren van parallelle bundels van actine filamenten 2. Tegelijkertijd, een populatie van follikel cellen genoemd centripetale cellen migreren tussen de verpleegkundige cellen en de eicel en twee dorsale groepen follikel cellen bepaalde migratie ondergaan om de dorsale aanhangsels buisvormige respiratoire inrichtingen voor het embryo 3 vormen . De verpleegkundige cellen vervolgens contract (S11), knijpen hun cytoplasmatische inhoud in de eicel in een proces genaamd verpleegster cel dumping, die de eicel voorziet van de benodigde factoren voor het naar embryogenese (figuur 1D) te voltooien. De verpleegkundige cellen ondergaan dan celdood (S12-S13) 4, en de follikel cellen scheiden en het patroon van de eierschaal 5 (figuren 1E-G). Aldus eind oögenese is rijk aan een belangrijke ontwikkelingd morfogenetische processen.
Geïsoleerde midden tot late stadium follikels (S10B-S14) kan worden gebruikt voor verschillende doeleinden, waaronder moleculaire analyses. Bijvoorbeeld kan mRNA uit opgevoerd follikels worden geïsoleerd voor RT-PCR, microarray of RNA-seq analyses. Hierdoor kan men kijken genexpressie binnen een kort tijdsinterval ontwikkeling, met slechts enkele celtypen aanwezig, en bepalen hoe genexpressie wordt veranderd door een farmacologische of genetische verstoringen. Isolatie fase kan ook worden gebruikt om te kijken naar eiwitten door Western blotting. Dergelijke analyse is belangrijk omdat het toelaat om het niveau van eiwitexpressie te kwantificeren in wildtype versus mutanten in specifieke fasen. Terwijl men zou kunnen gebruiken immunofluorescentie analyses vergelijkbare resultaten, kwantificering van fluorescentie minder robuust door de strenge eisen dat alle pixels in het lineaire detectiegebied 6. Bovendien kan western blot analyse andere gegevens, zoals eenen indien het proteïne posttranslationeel wordt gewijzigd of wordt tot expressie gebracht vanaf een bepaalde verbinding isovorm. Geïsoleerde fasen kan ook gebruikt worden voor verdere eiwitzuivering, zoals subcellulaire fractionering of co-immunoprecipitatie.
Fasespecifieke follikel isolatie kan ook worden gebruikt voor in vitro ontwikkeling assays 7 en live imaging 8. Geïsoleerde S10B-S13 follikels zal blijven ontwikkelen tot S14 in eenvoudige cultuur media (zie hieronder). Het is belangrijk op te merken dat S10A follikels niet verder komt verpleegkundige cel dumpen met behulp van de kweekomstandigheden besproken in dit manuscript. We hebben S10B in vitro ontwikkeling assays gebruikt om de rol van prostaglandines definiëren, zowel farmacologisch en genetisch, reguleren actine remodeling met verpleegkundige cel dumping en ontwikkeling uitlezingen 7,9. Evenzo kan de latere ontwikkelingsstadia ook worden geïsoleerd om de effecten van farmacologische behandelingen of genetische mens bepalenipulations op specifieke processen zoals middelpuntzoekende cel migratie, dorsale aanhangsel migratie / vorming 10, en verpleegkundige celdood. Dergelijke testen kunnen worden gebruikt om dominante interactie schermen of assays te voeren, bijvoorbeeld, terwijl heterozygotie voor mutaties in pxt of fascin alleen hebben geen effect op S10B in vitro ontwikkeling, follikels van dubbele heterozygoten vertonen verpleegkundige cel dumpen gebreken en een blok in ontwikkeling 9.
Bovendien, omdat S10B-13 kunnen ontwikkelen in kweek, alle processen die optreden tijdens deze tijd worden waargenomen live-beeldvorming. Dergelijke beeldvorming kan gebeuren door simpelweg met behulp van doorvallend licht (als men in de bruto veranderingen in morfologie alleen geïnteresseerd) of met confocale microscopie met behulp van transgene vliegen uiten fluorescerende probes of follikels gekleurd met live-imaging kleurstoffen. Live-beeldvorming wordt gebruikt om ons begrip van ontwikkelingsprocessen aanzienlijk vooruit. Inderdaad, wonen imaging laat stadium follikels heeft uitgebreid de kennis van dorsale aanhangsel migratie, een voorbeeld van tubulogenesis 10. We verwachten dat levende beeldvorming van extra laat stadium processen, waaronder actine dynamiek tijdens verpleegster cel dumping, nieuwe inzichten zal geven in deze ontwikkeling gebeurtenissen. Het is belangrijk op te merken dat terwijl S10A en vroege stadia van de ontwikkeling van de follikel niet zal blijven ontwikkelen tot een S14 in cultuur, live beeldvorming van gebeurtenissen tijdens de fasen van ontwikkeling is mogelijk met behulp van alternatieve kweekomstandigheden 11-14 (zie Overleg voor meer informatie).
Hier bieden wij gedetailleerde protocollen voor het isoleren laat stadium follikels voor zowel in vitro ontwikkeling en live-imaging, of moleculaire analyses (mRNA en eiwit isolatie).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. De voorbereiding van Drosophila Voorafgaand aan Isolatie Stage
- Maak natte gistpasta door het combineren van 50 g actieve droge gist met 90 ml gedestilleerd water. Meng met een spatel te combineren. Laat het mengsel staan voor ~ 30 minuten voor het beoordelen van de consistentie. De consistentie moet gewoon dik genoeg zijn om zich te houden aan de zijkant van een vlieg flacon maar niet lopen langs de zijkant zijn. Om de gewenste dikte te verkrijgen kan het nodig zijn om toe te voegen aan 10 ml extra water of een kleine hoeveelheid droge gist. Opslaan in een overdekte container bij 4 ° C. De opgeslagen gist kan worden gebruikt voor ~ 1-2 weken.
- Verzamel <24 uur oud volwassen vliegen (zowel mannen als vrouwen) van de gewenste genotypen en leg ze in een flacon met vlieg voedsel plus natte gistpasta gesmeerd op de zijkant van de flacon. De temperatuur waarbij de vliegen gehandhaafd zal variëren afhankelijk van het experiment. Voor routine-experimenten worden vliegen op kamertemperatuur gehouden. Overwegende experimenten waarbij genoverexpressie gebracht met het UAS/GAL4 systeem mei 15 vereist het handhaven van de vliegen bij 25 ° C of hoger zijn gebleken.
- Voorzie de vliegen met een frisse uitstrijkje van gistpasta daags gedurende 2 dagen. OPMERKING: follikelontwikkeling strak gereguleerd door de voedingstoestand van de vrouwelijke vlieg, is het essentieel om de vliegen te voorzien van de voedselrijke gistpasta ten minste 36 uur vóór dissectie.
2. Isoleren van Mid-to-late Staged Drosophila Follikels
- Laat de media op kamertemperatuur (~ 30 min) komen. Als de gefaseerde follikels zullen worden gebruikt voor in vitro ontwikkeling assays, vers bereid IVEM media (media insect Grace, 10% hitte geïnactiveerd foetaal runderserum en 1 x penicilline / streptomycine). Als de geënsceneerde follikels zullen worden gebruikt voor het mRNA of eiwit isolatie gebruikt u een insect Grace of IVEM media. BELANGRIJK: Media temperatuur is van cruciaal belang. Als de media is koud het zal veranderenzowel de actine en microtubuli cytoskelet en blok ontwikkeling.
- Verdoven de vliegen in de yeasted flacon door het injecteren van CO 2-gas en zet 3-5 vrouwtjes op een vlieg pad onder CO 2. BELANGRIJK: Laat meer vrouwtjes dan kan worden ontleed in 10 minuten tijd op de vlieg pad zoals uitgebreid blootstelling aan CO 2 kan leiden tot steriliteit en de dood.
- Vul een putje van een 9-spot plaat met media en plaats het op de top van een donker oppervlak (een stuk zwart plexiglas werkt goed). Focus het ontleden scope op de bodem van de put.
- Met behulp van # 5 Dumont tang halen een enkele vrouwelijke met een hand (dit is best gedaan met behulp van de dominante hand). Het is vaak het gemakkelijkst te halen de vrouw door de vleugels, poten, of borstkas naar de buik overgang. Dompel de vrouw in de media goed gevuld. Pas de focus van de microscoop nodig.
- Met een tweede tang gehouden in de niet-dominante hand grijpen de vrouwelijke aan het voorste uiteinde van de buikzodat het achterste uiteinde gepositioneerd naar de dominante hand (Figuur 2A). Zorg ervoor dat de vlieg ondergedompeld in de media te houden.
- Met de dominante hand, gebruik de tang om de cuticula te grijpen bij de 2e meest achterste gepigmenteerde segment en rip het weg van de rest van de buik (figuren 2B-C).
- De tang in de dominante hand, knijp het voorste uiteinde van de buik tot de eierstokken ontstaan (fig. 2D-E). Indien nodig, plaats de tang tussen de twee eierstokken en trek ze uit het karkas.
- Ofwel gaan de eierstokken om een nieuwe put met vers medium (figuur 2F) of verwijder het karkas naar een Kimwipe of papieren handdoek. Dit is vooral belangrijk als follikels worden geïsoleerd in vitro ontwikkeling.
- Herhaal dit tot 3-5 paren van eierstokken zijn geïsoleerd. OPMERKING: Elke eierstok bestaat uit ~ 16 ovarioles of kettingen van opeenvolgend rijpende follikels. Elke ovarioleis opgenomen in een spier schede.
- Met behulp van pin vises en de met hen geleverde naalden voorzichtig uit elkaar trekken van de eierstok door het uitvoeren van de naalden tussen de ovarioles (figuur 2G). Dit wordt soms de individuele follikels eveneens vrij.
- Individuele ovarioles en de gemakkelijk te onderscheiden morfologische stadia van de ontwikkeling van de follikel moet nu zichtbaar (figuur 2G, plaagde elkaar eierstok). Zie figuren 1 en 2 H morfologische verschillen die kunnen worden gebruikt om de verschillende fasen te onderscheiden. Om follikels die binnen intact ovarioles en toch binnen een spier mantel te isoleren, gebruikt een naald in de ovariole te snijden bij de voorste van de voorgaande follikel en aan de achterkant van de follikel onmiddellijk na de follikel van belang. Dit zal de spier schede te breken en de follikel van belang weg kan nu weg van de naburige follikels worden gesneden zonder het te beschadigen. Als individuele fasen gescheiden zijn, verhuizen de follikels van belang, met een glazen pipet, een nieuwe put met vers medium. Dit is vooral belangrijk bij het isoleren follikels in vitro ontwikkeling. Opmerking: Het is belangrijk om de pipet lamp persen alvorens het medium te voorkomen dat de luchtbellen uit de herverdeling follikels plaats gedurende de put. Bovendien, als de follikels vasthouden aan de glazen pipet, de pipet kan worden vooraf bekleed met 3% runderserumalbumine (BSA) door pipetteren de BSA-oplossing en neer meerdere malen en spoelen met ontleden media.
- Zodra er voldoende follikels zijn geïsoleerd, verder met de volgende experimenten.
3. In vitro ontwikkeling van S10B Follikels
- Isoleer S10B follikels met het stadium isolatieprotocol (stap 2) in IVEM media. Zorg ervoor dat de follikels snel weg van puin worden verplaatst. Aangezien deze follikels blijven rijpen, is important dat S10Bs worden verzameld gedurende 30-60 minuten en vervolgens geplaatst in de rijping media keuze. OPMERKING: S10B zorgvuldig moeten worden onderscheiden van S10A follikels (figuur 1C tegenover 1B), zoals S10A follikels niet vervallen in IVEM kweekmedium. Zowel S10A en S10B follikels, wordt de helft van de lengte uit verpleegkundige cellen en de helft van de eicel, maar S10B de lengte van de follikel gelijk is aan die van de S14 follikels.
- Met behulp van een glazen pipet, bewegen ~ 30 S10B follikels in een putje van een 24-well weefselkweek plaat. OPMERKING: Zorg ervoor om te controleren of alle van de follikels wordt overgedragen zijn S10B en hebben niet gerijpt tot S11.
- Bereid 1 ul van rijping media per goed, dwz IVEM media plus farmacologische reagentia.
- Met behulp van een getrokken glazen pipet *, verwijder zoveel media uit de put (stap 3.2) mogelijk, en snel toe te voegen rijping media keuze. OPMERKING: Het is essentieel om een getrokken glas pip gebruikenette als geënsceneerde follikels kan gemakkelijk worden opgenomen met ofwel glazen pipetten of pipet tips met een Pipetman.
* Om getrokken pipetten te maken: 1) Verwarm het dunne gedeelte van de lange, glazen pipetten in de vlam van een bunsenbrander enkel tot het glas zacht begint te worden, 2) onmiddellijk naar de pipet uit de vlam en trek horizontaal om de pipet te trekken in een fijnere buis; 3) te breken tot een fijne punt te genereren. LET OP: Gebruik oogbescherming als glasscherven kunnen vliegen. - Herhaal stappen 3,1-3,4 voor zoveel putten als het experiment vereist.
- Laat follikels te ontwikkelen voor> 10 uur en de score van de ontwikkeling progressie onder een dissectie scope. OPMERKING: Experimenten zijn meestal scoorde de volgende dag om voldoende tijd voor de follikels te ontwikkelen mogelijk te maken. S10B is ~ 5 uur, S11 ~ 30 min, S12 ~ 2 uur en S13 is ~ 1 uur duren bij 25 ° C 1 en ontwikkeling bij kamertemperatuur duurt iets langer. Soortgelijke experimenten als beschreven voor S10B follikels kanuitgevoerd met S11-S13 follikels.
4. Stage Isolatie voor Live Imaging
- Isoleer laat stadium follikels (S10B-14) die het fluorescerende marker van keuze met behulp van de fase isolatie protocol (stap 2) in IVEM media, snel bewegende follikels weg van puin.
- Verplaats follikels van belang in nieuwe media en breng met de glazen pipet een dekglaasje bodem Petri plaat. Zorg ervoor dat de media toe te voegen, zodat het borrelt in het dekglaasje onderste gebied, maar niet overlopen.
- Voor langere time-lapse filmpjes, is het soms nodig om de luchtvochtigheid te handhaven binnen de Petri plaat door het toevoegen van een opgerolde Kimwipe, bevochtigd met water, aan de binnenrand van de Petri plaat. Plaats het deksel op de top.
- Beeld op een omgekeerde microscoop. Gedetailleerde resolutie zal confocale microscopie vereisen. Het is noodzakelijk om de frequentie van beeldvorming sterkte van verlichting, en de lengte van beeldvormende evenwicht, zal afzonderlijk moeten worden uitgewerkt voor elke lAbeling gereedschap en ontwikkelingsproces.
5. Stage Isolatie van mRNA Voorbereiding
- Isoleer afzonderlijke fase follikels met het stadium isolatieprotocol (stap 2) met ofwel Grace of IVEM media.
- Met een glazen pipet, verplaats de verschillende fasen plaats naar nieuwe putjes met media, is het mogelijk om meerdere trappen verzamelen tegelijk.
- Houd collectie tijden tot 1 uur. Verplaats de follikels met een glazen pipet, 1,5 ml microfuge buizen.
- Draai de buis even in een mini-microcentrifuge om alle follikels pellet. Met behulp van een getrokken glazen pipet (zie stap 3.4) zorgvuldig alle media te verwijderen. OPMERKING: Als u een full size microcentrifuge, spin down de follikels op lage snelheid.
- Voeg 100 ul van Trizol en maal met de hand voor ~ 20 seconden met behulp van een plastic stamper. Spin down op volle snelheid in een microcentrifuge en bewegen Trizol naar een nieuwe 1,5 ml microfugebuisje voorzichtig elke afgedraaid d niet te verstorenebris. Bewaren bij -80 ° C.
- Herhaal stap 5,1-5,5 totdat voldoende follikels zijn verkregen voor experiment. Routinematig ~ 75 S10B, ~ 75 S12 en S14 ~ 100 follikels verkregen ~ 10 ug RNA.
- Ontdooi de monsters op ijs. Combineer monsters, in voorkomend geval, in een microfugebuis en breng het Trizol volume tot 800 pl. Ga verder met RNA-isolatie zoals voorgeschreven door de fabrikant. BELANGRIJK: Vergeet niet om DNase behandeling van het geïsoleerde RNA met RNase vrij DNase.
6. Stage Isolatie van de Western Blot
- Verwarm een warmte-blok tot 100 ° C.
- Isoleer afzonderlijke fase follikels met het stadium isolatieprotocol (stap 2) met ofwel Grace of IVEM media. OPMERKING: Het is noodzakelijk om empirisch te bepalen hoeveel van een bepaalde fase follikel zijn nodig om elk specifiek eiwit te observeren. Voor sterk uitgedrukt eiwitten 1-3 S10B follikels / goed is genoeg om een sterk signaal op een western blot zien. Het is echter belangrijk om eenrepresentatieve steekproef, waarbij follikels van meerdere vrouwtjes. Aldus worden 15-20 follikels van een bepaalde fase meestal verzameld.
- Verplaats follikels met een glazen pipet naar een 1,5 ml microcentrifugebuis. Spin kort in een mini-microcentrifugepuls de follikels pellet (zie stap 5.4). Verwijder voorzichtig al het materiaal met behulp van een getrokken glazen pipet (zie stap 3.4) en voeg 50 ul van 1x PBS en 50 ul van 2x Laemmli buffer.
- Malen met de hand voor ~ 20 sec met een plastic stamper. OPMERKING: Plastic stampers kunnen worden hergebruikt voor het slijpen western monsters door wassen en ze te autoclaveren.
- Kook de monsters gedurende 10 minuten in de hitte blok.
- Chill kort op ijs en draaien op volle snelheid gedurende 15 seconden in een microcentrifuge. Ofwel direct laden op een SDS-PAGE gel of bewaar bij -20 ° C. OPMERKING: Als de monsters worden bewaard, vergeet niet om de monsters reboil vóór het laden op de gel.
- Voer western blot analyse volgens standaard protocollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bij het isoleren van specifieke stadia in Drosophila follikel ontwikkeling is essentieel om nauwkeurig onderscheiden de verschillende morfologische stadia. Dit is enigszins uitdaging voor S10A en S10B, de verpleegster cellen en de eicel elk nemen halve lengte van de follikel in deze fasen (figuur 1B tegenover 1C). Echter, S10A follikels korter dan S10B follikels, de S10B follikels volledig verlengd en derhalve even lang als een S14 follikel (figuur 1C tegenover 1G). Daarnaast werd een subset van de follikel of somatische cellen via oöcyt genoemd centripetale follikel cellen beginnen in migreren tussen de verpleegkundige cellen en de eicel bij S10B. Tijdens S10B, die ~ 5 uur duurt, de verpleegkundige cellen ondergaan dynamische actine verbouwen zodat op S11 de verpleegkundige cellen contract, knijpen hun cytoplasmatische inhoud in de eicel. Dus bij S11, de verpleegkundige cel regiosignificant af, terwijl de eicel heeft uitgebreid (figuur 1D). Bij S12, de verpleegkundige cellen beginnen te dood te ondergaan en neem het op een meer ondoorzichtige uiterlijk (figuur 1E), interessant, in de cultuur, verpleegkundige celrestanten krul dorsaal in S12 follikels (zie S12S in de figuren 3C'-D '). Tijdens S13, de verpleegkundige cel regio is transparant celdood wordt voltooid, en dorsale aanhangsel vorming optreedt (Figuur 1F). Door S14 alleen de eicel en de follikel cellen blijven, en dorsale aanhangsel formatie compleet is (figuur 1G).
De in vitro ontwikkeling test kan worden gebruikt om de gevolgen van verschillende farmacologische behandelingen en genetische mutaties op S10B ontwikkeling en verpleegkundige cellen dumping (figuur 3) te beoordelen. De ontwikkeling van S10Bs in kweek is robuust, maar een aantal factoren kan leiden tot slechte experimentele resultaten. In figuur 3A,experimentele gegevens uit zowel een succesvolle en mislukte experiment zijn aanwezig. Een geslaagd experiment is er een waarin 80-100% van de wild-type follikels in control media volledige verpleegkundige cel dumping en vooruitgang S12-14 (Figuur 3A, wt 1). Soms wildtype controles mislukt, betekent dat minder dan 80% van de follikels ontwikkelen (Figuur 3A, 2 gew). Dit falen kan worden veroorzaakt door een aantal zaken, waaronder: 1.) Onmogelijkheid om S10A onderscheiden van S10B follikels (zie figuren 1 en 2), 2) mediaproblemen (temperatuur, enz.), en / of 3) follikels waren blootgesteld aan vuil te lang.
In vitro ontwikkeling van S10Bs kan worden gebruikt in combinatie met farmacologische behandeling. Voor deze experimenten is het belangrijk dat de drug controles dwz behandeling van wildtype follikels met het geneesmiddel, worden uitgevoerd met elk experiment omdat farmacologische behandeling en / of CONCENTRATion kan veranderen met de tijd. Voor farmacologische experimenten, is het handig om de verhouding van het percentage follikels ontwikkelen in de medicamenteuze behandeling die controle media te analyseren; deze bedieningsorganen voor kleine genetische achtergrond verschillen. Het is vaak nuttig om te behandelen met de IC50 concentratie van het geneesmiddel, dit is de concentratie die blokkeert 50% van de wild-type (YW) follikels van het ondergaan van verpleegkundige cel dumping en verdere ontwikkeling. . Aldus is de verhouding van wildtype follikels verwachting 0,5 (Figuur 3B, drug 1) Figuur 3B is een voorbeeld van hoe een geneesmiddel (aspirine) te geconcentreerd kan worden (geneesmiddel 2, waarschijnlijk door verdamping van oplosmiddelen) en blokkeren meer dan 50% van het wildtype follikels uit ontwikkelingslanden. Ter verdere illustratie van de in vitro ontwikkeling assay worden de beelden van twee putjes van ontwikkeling S10B follikels ontvangen. Figuren 3C en D illustreren de S10B follikels aan het begin van detest, controle of aspirine behandeld (~ 2 mM) media. Figuren 3C en D illustreren het einde van de test onthulde dat de meerderheid van de controle behandelde follikels ontwikkeld S14, terwijl de meerderheid van de aspirine behandelde follikels hebben niet voltooide verpleegkundige cel dumpen.
De in vitro ontwikkeling test kan ook worden gebruikt om te screenen op genetische achtergronden die gevoeliger zijn voor een bepaald geneesmiddel. Figuur 3E bevat twee voorbeelden. In het eerste voorbeeld, de genetische achtergrond (expt1, blauwe balk) niet om met aspirine als de verhouding blijft -0,5, omgekeerd, in het tweede voorbeeld, de genetische achtergrond (expt2, rode balk) versterkt het effect van aspirine. Aldus kan de in vitro ontwikkeling assay worden gebruikt om de gevolgen van mutaties en farmacologische reagentia voor de ontwikkeling en morfologische gebeurtenissen tijdens late oögenese definiëren, daarnaast de assay kunnen worden gebruikt om zowel farmacologische en genetische-interacties (zie 9).
Isolatie stadium ook worden gebruikt voor beeldvorming van levende ontwikkelingsprocessen. Figuur 4 is een voorbeeld van een time-lapse film van S10B follikel expressie Utrophin-GFP, de actine-bindende domein van humaan Utrophin gefuseerd met groen fluorescent eiwit. Met behulp van deze imaging tool, actine bundel vorming en condensatie kunnen worden gevisualiseerd. Veel tools zijn beschikbaar voor live-imaging, met inbegrip van eiwitten val transgene lijnen 16,17, UAS gedreven fluorescent gelabeld organel markers (mitochondriën, golgi, endoplasmatisch reticulum, enz.), UAS gedreven fluorescent gelabeld cytoskelet markers (actine en actine-bindende eiwitten, microtubuli en microtubuli bindende eiwitten), transgene lijnen uitdrukken elke fluorescent gelabeld eiwit van belang, en vitale kleurstoffen (Nile Red labels neutrale lipiden, Edu labels repliceren DNA, FM4-64 labels membranen).
ove_content "> Moleculaire analyses kunnen worden uitgevoerd met geïsoleerde stadia van Drosophila follikels. Voor eiwitanalyse door Western blotting, moet worden empirisch bepalen hoeveel follikels van een bepaald ontwikkelingsstadium, moeten het eiwit van belang acht. Figuur 5 is een voorbeeld van hoe opeenvolgend verdunnen van een geconcentreerde proteïneoplossing lysaat het aantal follikels S10B nodig is om een bepaald eiwit, fascin observeren bepalen. In dit geval een S10B follikel volstaat om dit eiwit te observeren door Western blotting.
Figuur 1. Diagram beschrijft de cellulaire samenstelling van Drosophila follikels en afbeeldingen ter illustratie van de morfologische verschil van mid-to-late stadium Drosophila follicles. A. Diagram die de cellulaire samenstelling van een S10A follikel. BG. Vertegenwoordiger beelden van S10A-S14 Drosophila follikels genomen met een stereo ontleden scope. De Drosophila follikel bestaat uit 16-kiembaan afgeleide cellen: 1 eicel (rood, A) en 15 verpleegkundige of steuncellen (geel, A), die worden omgeven door ~ 650 somatisch-afgeleide epitheelcellen (wit, magenta en cyaan, A ). Bij S10A, wordt de helft van de lengte van de follikel uit de verpleegkundige cellen (gele beugel, B), die onder het traject follikel cellen (magenta in A) en de andere helft uit de eicel (rode asterisk , B), die onder het hoofdlichaam follikel cellen (wit in A). Op S10B, de verpleegkundige cellen (gele beugel, C) en eicel (rood sterretje, C) elk componeren helft van de length van de follikel, maar de totale lengte van de follikel is nu gelijk aan die van een S14 follikel (vergelijk C tot G). Tijdens S11, de verpleegkundige cellen (gele beugel, D) snel knijpen hun cytoplasma inhoud in het verlengen van eicel (rood sterretje, D) in een actine / myosine-afhankelijk proces genoemd verpleegkundige cel dumpen. Door S12, heeft de eicel (rood sterretje, E) volledig langwerpige als verpleegkundige cel dumping is volledig en alleen verpleegkundige celrestanten blijven (gele beugel, E). De verpleegkundige celrestanten (gele beugel, F) volledig celdood bij S13. S14 staat voor het volgroeid follikel, die bestaat uit de eicel (rode asterisk, G), somatische cellen en eierschaal, waaronder de dorsale aanhangsels (witte pijlen G). B. Schaalbalk = 0,1 mm.
Figuur 2. Beelden met een overzicht van eierstok dissectie en follikel isolatie. A. Dompel de vlieg in het ontleden media en oriënteren het zo dat het wordt gehouden, door tang, in de nondominant de hand. B. Met behulp van de dominante hand, pak de cuticula op de achterkant van de buik. C. Trek de cuticula af, blootstellen van de eierstokken (gele pijl). D. Werken vanuit de voorste van de buik in de richting van de achterste, knijp de buik loslaten van de eierstokken (gele pijl). E. Scheid de eierstokken (gele pijl) van alle resterende cuticula (rode pijl) en / of inwendige organen (witte pijlpunten). F. Breng de geïsoleerde eierstokken om een frisse putje met het ontleden van de media. G. plagen elkaar de eierstokken, met behulp ontleden naalden, om indi blootindividuele follikels (vergelijk intact eierstok (boven) om gescheiden ovarium (onderaan). White pijlpunt wijst naar een gestoken S10B follikel, een voorbeeld van een follikel die niet mogen worden gebruikt voor verdere experimenten. H. Selecteer de morfologische stadia van belang (Stadia 10A -14 (S10A-S14) weergegeven).
Figuur 3. Voorbeelden van in vitro assays ontwikkeling. A. Grafiek van het percentage van de S10B follikels die volledige ontwikkeling in de cultuur. wt 1 is een voorbeeld van verwachte ontwikkeling van wildtype S10B follikels (96% ontwikkeling), terwijl wt 2 is een voorbeeld van slechte ontwikkeling in kweek (68% ontwikkeling). We zouden kenmerkend het hele experiment Mocht de ontwikkeling van wildtype S10B follikels in controlemedia is dan 80%. B. IC50 voor aspirine percentage ontwikkeling in controlemedia. De IC50 is de concentratie die blokken 50% van de follikels S10B van ontwikkeling, dit betekent het wildtype waarde moet ~ 0,5 zijn. Drug 1 is een voorbeeld van de verwachte wildtype ratio (0,52), terwijl geneesmiddel 2 is een voorbeeld van wat gebeurt wanneer de geneesmiddelconcentratie te sterk (0,37). CD '.'s Van in vitro ontwikkeling putjes. CC'. Controle behandeld. DD. Aspirine behandeld (~ 2 mM). CD. Afbeelding van de S10Bs bij de start van de analyse. C'-D '. Afbeelding van de follikels op het eindpunt van de test. Controle behandelde S10B follikels ontwikkelen om S14s in cultuur (C '), terwijl de meerderheid van aspirine behandeld follikels niet verpleegkundige cel dumping (D voltooien').
Figuur 4. Voorbeeld voor het gebruik van geïsoleerde S10B follikels voor live-imaging. AF. Maximale projecties van 3 segmenten van time-lapse-z-stapels van een S10B follikel geïsoleerd van Utrophin :: GFP tot expressie transgene vliegen (SQH-Utrophin :: GFP). A'-F '. Overdreven inzetstukken markeert een enkele verpleegster cel A- F. AF '. F-actine (Utrophin :: GFP), wit. A, A'. Tijd (t) = 0 min.. B, B '. T = 20 min. C, C'. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min.. F, F '. t = 100 minuten. Op het eerste tijdstip, kan korte actine filamenten worden waargenomen die zich uitstrekt van de verpleegkundige celmembranen (A, A '). Deze actine filamenten langwerpig in de vroege tijdstippen (BC 'vergeleken met A, A') tot ze volledig langwerpig (D, D '). In latere tijdstippen Deze volledig langwerpige actinefilamenten dan verkorten en condenseren hele verpleegkundige cel dumping (EF) A. Schaal bar = 50 micrometer. A '. Schaal bar = 10 micrometer.
_upload/50493/50493fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg "/>
.. Figuur 5 illustreert hoe het aantal follikels nodig is om een bepaald eiwit door Western blot analyse onderzocht bepalen Dit is een western blot kijken fascin expressie in S10B follikels (01:20, sn 7C, Cooley, L.; Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), ontwikkeld onder auspiciën van de NICHD en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Departement Biologie, Iowa City, IA, 52242). De cijfers over de top vertegenwoordigen bij benadering het aantal S10B follikels geladen per baan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De Drosophila follikel bestaat uit slechts een klein aantal celtypen, waardoor het ideaal is voor zowel morfologische en moleculaire analyses. Bovendien, door de structuur van de eierstok, is het relatief eenvoudig om grote aantallen specifieke stadia van de follikelontwikkeling te verkrijgen met een gemeenschappelijke ontleden reikwijdte en minimale training. Elke fase is een korte temporele venster kunt stadium isolatie significante moleculaire inzichten in de ontwikkelingsprocessen die tijdens die fase bieden. Zo hebben wij midden tot late stadium follikel isolatie gebruikt om genexpressie veranderingen tijdens S10B, S12 en S14 18 karakteriseren. Deze analyse suggereert een aantal eerder niet gekenmerkte genen die kunnen bijdragen tot follikel ontwikkeling en in het bijzonder, eierschaal vorming.
Isolatie stadium kan dramatisch inzicht in morfologische evenementen bieden via live beeldvorming. Dergelijke beeldvorming kan worden uitgevoerd op al l stadia van Drosophila follikel ontwikkeling. Hoewel de focus van dit werk is S10B-14, wordt de lezer verwezen naar de volgende artikelen voor live beeldvorming van eerdere stadia: germarium 13, follikel rek 19 en fase 9 11,12,14. De kweekomstandigheden gebruikt in deze studies verschillen van die besproken in dit werk. Specifiek deze studies gebruikte Schneider Insect media met variabele niveaus van FBS (2,5-15%) en de toevoeging van insuline 11-13,19 en in sommige gevallen, de verdere toevoeging van trehalose, methopreen, 20-hydroxyecdyson en adenosine deamidase 14. Het is belangrijk erop te wijzen dat deze live-imaging studies aanzienlijk hebben ons begrip van de gebeurtenissen tijdens deze eerdere stadia van ontwikkeling. Toch kunnen deze vroeg stadium follikels niet verder helemaal naar de laatste fase van ontwikkeling van de follikel, S14. Omgekeerd zal S10B-13 ontwikkelen S14 in kweek.
ove_content "> Tijdens S10B-S14 vele morfologische processen optreden die kunnen worden bestudeerd door live-imaging. kunnen bijvoorbeeld live-imaging worden gebruikt om het proces van de verpleegkundige cel onderzoekt dumping, het proces waarbij de verpleegkundige cellen knijpen hun cytoplasmatische inhoud in de eicel om het te voorzien van alles wat het nodig heeft om embryogenese te voltooien. Nurse cel dumping kan worden waargenomen door de time-lapse imaging met doorvallend licht 7 of door confocale beeldvorming met behulp van transgene lijnen uiten fluorescente markers (zie figuur 4). Voortgezet gebruik van live-imaging zal naar verwachting bieden nieuwe inzichten in het cytoskelet dynamiek nodig is voor verpleegkundige cel dumpen. live-beeldvorming van latere stadia heeft ook geavanceerde ons begrip van dorsale aanhangsel primordia migratie en tubulogenesis 10.In vitro ontwikkeling van S10B-S13 follikels kunnen worden gebruikt om de effecten van zowel farmacologische reagentia en genetische manipulaties op de processen definieert laterring in deze tijd. Wij hebben in vitro ontwikkeling van follikels S10B de rol van prostaglandines vaststellen regelen verpleegster cel dumping 7. Vervolgens hebben we met behulp van deze test om een farmacologische interactie-scherm uit te voeren, in het bijzonder, hebben we getest of verlies van een kopie van een actine regulator versterkt of onderdrukt de verpleegkundige cel dumpen defecten als gevolg van het verlies van prostaglandines. Dit scherm heeft een aantal vermeende downstream targets (9 en Spracklen, Meyer en Tootle, ongepubliceerde gegevens) onthuld. De test kan ook worden gebruikt om genetische interacties onderzocht door het beoordelen ontwikkelingsstoornis, zoals een blok in verpleegster cel dumping door heterozygositeit voor twee verschillende factoren (voor een voorbeeld zie 9).
Terwijl het isoleren van mid-to-late stadium Drosophila follikels is een vrij eenvoudig proces, zijn er een aantal kritische factoren voor een optimale succes. Ten eerste, de voorbereiding van de vliegen iszeer belangrijk. Het beste is om verschillende genotypen van vliegen te houden in zo gelijk mogelijke staat, dat wil zeggen het aantal vliegen per flacon, de verhouding van vrouwen tot mannen (2:1 ratio is ideaal), en voor frisse, natte gist consequent. De voeding (natte gist) en dissectie tijd de prevalentie van de verschillende stadia van ontwikkeling veranderen. We hebben ontdekt dat wanneer de vliegen consequent worden gevoerd in de ochtend, kan meer S10Bs worden geïsoleerd in de ochtend, terwijl meer S12S aanwezig in de middag zijn. Een tweede belangrijke factor is de media. Voor de in vitro ontwikkeling en live imaging is essentieel om nieuwe IVEM media bereiden. Bovendien moet het materiaal op kamertemperatuur komen koud media het cytoskelet veranderen, zowel actine en microtubuli en derhalve verstoren verdere ontwikkeling. Het is ook belangrijk om de follikels weg van puin houden. Soms, tijdens de dissectie, de darm zal komen met de eierstokken. We hebben gevonden dat wanneer de darm is gescheurden de follikels worden bewaard in de vervuilde media, de follikels waarschijnlijk ontwikkelen cultuur. Aangezien de follikels blijven ontwikkelen in kweek, is het essentieel om de staging na sectie opnieuw controleren alvorens ofwel in vitro ontwikkeling en moleculaire analyses. Tenslotte is het belangrijk om goede controles hebben voor de experimenten. Voor in vitro ontwikkeling, is het noodzakelijk wildtype follikels om te testen dat het medium zorgt voor een normale ontwikkeling (80-100% van de verpleegster cel dumping), en testen of farmacologische reagentia fungeren als verwacht (zie figuur 3).
Concluderend kan isolatie van mid-to-late stadium Drosophila follikels significant inzicht geven in ontwikkelingsprocessen door een verscheidenheid van experimentele technieken.
Tabel van specifieke reagentia en apparatuur:
| Naam van het serum | Vennootschap | Katalogue nummer | Opmerkingen (optioneel) |
|---|---|---|---|
| Actieve droge gist | Genesee Wetenschappelijke | 62-103 | Elke bron van actieve gedroogde gist is prima |
| Grace's Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Warmte geïnactiveerd foetaal runderserum | Atlanta Biologicals | S11050H | Elke hitte-geïnactiveerd FBS zou moeten werken |
| 10x Pen / Strep | Gibco / Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises en Naalden | Ted Pella, Inc | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| # 5 Dumont tang | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well platen | Becton Dickinson | 35 3226 | Elke 24-well weefselkweek schotel zou moeten werken |
| Dekglaasje Bottom Gerechten (35 mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Dekglaasje dikte is afhankelijk van de microscoop / doel gebruikt |
| Glazen pipetten | Corning | 7095B-5x (voor het overbrengen follikels) 7095B-9 (voor het vervaardigen getrokken pipetten) | |
| Monster stamper (1,5 pl; RNase / DNase-vrij) | Research Products International | 199228 | Elke kunststof stamper die 1,5 gl microfugebuisjes past kan worden |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er is niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij willen Thomas Lecuit (SQH-Utrophin :: GFP lijn), de Bloomington Stock Center en de Developmental Studies Hybridoma Bank bedanken voor reagentia. Wij bedanken verder alle leden van de Tootle Lab voor nuttige discussies en kritieken van het manuscript. De financiering van de National Science Foundation MCB-1158527, en start-up middelen van de afdeling Anatomie en Celbiologie van de Universiteit van Iowa dit werk ondersteund. National Institutes of Health predoctorale Training Grant in Farmacologische Wetenschappen T32GM067795 ondersteund AJS. Gegevensopslag ondersteuning werd verleend door de ICTS, dat wordt gefinancierd door de CTSA ondersteund door het National Center for Research Resources en het National Center for Translational Voortschrijdende Sciences, National Institutes of Health, door Grant UL1RR024979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
