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Biology

L'utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin Published: December 2, 2013 doi: 10.3791/50493
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa Carver College of Medicine

Summary

L'isolement spécifique du stade de-mi-à la fin de follicules de Drosophila est utile pour une variété de fins. Ces follicules se développent dans la culture, ce qui permet des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour être couplés avec des essais in vitro de développement et de l'imagerie en temps réel. En outre, les follicules peuvent être utilisées pour des études moléculaires, telles que l'isolement de l'ARNm et des protéines.

Abstract

Ovogenèse chez la drosophile ou le développement des follicules a été largement utilisé pour faire avancer la compréhension des processus biologiques de développement et cellulaires complexes. Ce document décrit comment des méthodes pour isoler les follicules de la scène mi-to-fin (étape 10B-14) et de les utiliser pour apporter de nouveaux éclairages sur les événements moléculaires et morphologiques survenant pendant fenêtres étanches de temps de développement. Follicules isolés peuvent être utilisés pour une variété de techniques expérimentales, y compris les essais in vitro de développement, l'imagerie en temps réel, l'analyse de l'expression d'ARNm et l'analyse western blot des protéines. Follicules au stade 10B (S10B) ou plus tard viendront compléter le développement de la culture, ce qui permet de combiner des perturbations génétiques ou pharmacologiques avec le développement in vitro de définir les effets de ces manipulations sur les processus qui se produisent pendant des périodes spécifiques de développement. En outre, parce que ces follicules se développent en culture, elles sont idéales pour les études d'imagerie en direct, Qui révèlent souvent de nouveaux mécanismes qui interviennent dans les événements morphologiques. Follicules isolées peuvent également être utilisées pour les analyses moléculaires. Par exemple, des changements dans l'expression des gènes qui résultent de perturbations génétiques peuvent être définis pour des fenêtres spécifiques du développement. De plus, les taux de protéine, la stabilité et / ou l'état de modification post-traductionnelle de pendant une étape particulière du développement des follicules peuvent être examinées par l'intermédiaire des analyses western blot. Ainsi, l'isolement spécifique au stade de follicules drosophile fournit une riche source d'information dans les processus largement conservées du développement et de la morphogenèse.

Introduction

Chaque ovaire chez la drosophile est composé de ~ 16 ovarioles, ou des chaînes de maturation séquentielle chambres d'oeuf ou de follicules. Chaque follicule est composé d'un seul ovocyte, cellules nourricières ou soutien dérivés 15 lignée germinale, et ~ 650 cellules somatiques appelées cellules folliculaires (figure 1A). Ovogenèse chez la drosophile est divisé en 14 étapes morphologiquement définies de développement 1. Chaque étape du développement folliculaire est observée plusieurs fois dans une seule volée, ce qui rend relativement facile d'isoler un grand nombre de follicules spécifiques de stade.

Les étapes de l'ovogenèse (Etapes 10B-14) à mi-et la fin sont particulièrement bien adaptés pour l'isolement de l'étape (Figure 1). Au stade 10B (S10B), le follicule est complètement allongée (sa longueur est égale à celle d'une étape 14 (S14) follicule, voir la figure 1 et la figure 2H), et la moitié de la longueur du follicule est composé de cellules nourricièrestandis que l'autre moitié est l'ovocyte (Figure 1C). A ce stade, les cellules nourricières sont soumis dramatique remodelage de l'actine, le renforcement de l'actine corticale et générant des faisceaux parallèles de filaments d'actine 2. Dans le même temps, une population de cellules de follicules, dite cellules centripètes, de migrer entre les cellules nourricières et l'ovocyte, et deux groupes dorsales des cellules du follicule devient spécifiée à subir une migration pour former les appendices dorsaux, des appareils respiratoires tubulaires pour l'embryon 3 . Les cellules nourricières puis contrat (S11), en serrant leur contenu cytoplasmique dans l'ovocyte dans un processus appelé infirmière cellule dumping, qui fournit l'ovule avec les facteurs nécessaires pour qu'il puisse compléter l'embryogenèse (figure 1D). Les cellules nourricières sont alors soumis à la mort cellulaire (S12-S13) 4, et les cellules folliculaires sécrètent et modèle la coquille 5 (figures 1E-G). Ainsi, la fin de l'ovogenèse est riche avec un développement important ded processus morphogénétiques.

Follicules isolés mi-à fin-scène (S10B-S14) peuvent être utilisés pour une variété de raisons, y compris des analyses moléculaires. Par exemple, l'ARNm à partir de follicules étagés peut être isolée pour la RT-PCR, puces à ADN, l'ARN ou des analyses-seq. Cela permet de regarder l'expression des gènes au sein d'une fenêtre de développement à court, avec seulement quelques types cellulaires présents, et de déterminer comment l'expression des gènes est modifiée par des perturbations soit pharmacologiques ou génétiques. l'isolement de l'étape peut également être utilisé pour étudier des protéines par transfert de Western. Cette analyse est importante car elle permet de quantifier le niveau d'expression de la protéine dans le type sauvage contre des mutants à des stades spécifiques. Alors que l'on pourrait utiliser immunofluorescence analyse pour obtenir des résultats similaires, la quantification de la fluorescence est moins robuste en raison des exigences strictes que tous les pixels se situer dans la plage linéaire de détection 6. En outre, l'analyse western blot peut fournir d'autres informations, par exemple uns si la protéine est modifiée ou post-traductionnelle est exprimé à partir d'une épissure isoforme spécifique. Étapes isolées peuvent également être utilisées pour une purification supplémentaire de la protéine, y compris fractionnement subcellulaire ou co-immunoprécipitation.

L'isolement du follicule spécifique du stade peut également être utilisé pour des essais in vitro de développement 7 et 8 d'imagerie en temps réel. Isolés follicules S10B-S13 continueront à se développer à S14 dans les milieux de culture simples (voir ci-dessous). Il est important de noter que les follicules S10A ne seront pas progresser à travers infirmière cellule dumping en utilisant les conditions de culture abordées dans ce manuscrit. Nous avons utilisé S10B dans des essais in vitro de développement de définir le rôle des prostaglandines, à la fois sur le plan pharmacologique et génétique, dans la régulation de l'actine remodelage en utilisant infirmière cellule le dumping et le développement-outs lire 7,9. De la même façon, les stades ultérieurs de développement peuvent également être isolées pour déterminer les effets des traitements pharmacologiques ou homme génétiqueipulations sur des procédés particuliers tels que la migration centripète de la cellule, la migration dorsale de l'appendice / formation 10, et l'infirmière la mort cellulaire. Ces tests peuvent être utilisés pour effectuer des écrans d'interaction dominants ou les dosages, par exemple, alors que l'hétérozygotie des mutations dans pxt ou fascine seuls n'ont aucun effet sur ​​S10B développement in vitro, les follicules de doubles hétérozygotes exposition infirmière cellule de dumping défauts et un bloc dans le développement 9.

En outre, parce S10B-13 peut se développer dans la culture, l'ensemble des processus qui se produisent pendant cette période peut être observé par live-imagerie. Cette image peut être effectuée simplement en utilisant la lumière transmise (si l'on est seulement intéressé par les variations brutes de la morphologie) ou la microscopie confocale en utilisant des mouches transgéniques exprimant des sondes ou des follicules colorées avec des teintures fluorescentes imagerie en direct. Imagerie en temps réel est utilisé pour faire avancer considérablement notre compréhension des processus de développement. En effet, vivre Imaging de follicules à un stade avancé a élargi la connaissance de la migration dorsale de l'appendice, un exemple de tubulogenèse 10. Nous nous attendons à ce que l'imagerie en direct de processus à un stade avancé supplémentaires, y compris la dynamique de l'actine pendant infirmière cellule de dumping, fournira des informations nouvelles sur ces événements de développement. Il est important de noter que tandis que S10A et les premiers stades du développement du follicule ne va pas continuer à se développer en une S14 dans la culture, en direct-imagerie d'événements survenus au cours de ces stades de développement est possible en utilisant des conditions de culture alternatifs 11-14 (voir discussion plus d'informations).

Ici nous fournissons des protocoles détaillés pour isoler follicules à un stade avancé de développement, soit in vitro et vivons-imagerie, ou des analyses moléculaires (ARNm et isolement des protéines).

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Protocol

Une. Préparation Drosophila avant l'étape d'isolement

  1. Faire de la pâte de levure humide en combinant 50 g de levure sèche active avec 90 ml d'eau distillée. Mélanger avec une spatule pour mélanger. Laissez reposer le mélange pendant 30 min ~ avant d'évaluer la cohérence. La consistance doit être juste assez épaisse pour adhérer au côté d'un flacon de volée mais ne fonctionne pas sur le côté. Pour obtenir la consistance désirée, il peut être nécessaire d'ajouter à 10 ml d'eau supplémentaire ou d'une petite quantité de levure sèche. Conserver dans un récipient couvert à 4 ° C. La levure stockée peut être utilisée pour ~ 1-2 semaines.
  2. Recueillir <24 h vieilles mouches adultes (deux mâles et femelles) des génotypes souhaités et de les mettre dans un flacon avec de la nourriture à la mouche ainsi que la pâte de levure humide étalé sur le côté du flacon. La température à laquelle les mouches sont maintenues variera en fonction de l'expérience. Pour les expériences de routine, les mouches sont maintenus à la température ambiante. Attendu que des expériences dans lesquelles un gène estest surexprimé en utilisant le système UAS/GAL4 15 mai exiger le maintien de vol à 25 ° C ou plus, le cas échéant.
  3. Fournir les mouches avec un nouveau frottis de pâte de levure par jour pendant 2 jours. NOTE: Comme le développement des follicules est étroitement régulée par l'état nutritionnel de la mouche femelle, il est essentiel de fournir à la volée avec la pâte riche en éléments nutritifs de la levure pendant au moins 36 heures avant la dissection.

2. Isoler la mi et la fin de la drosophile par étapes follicules

  1. Autoriser les médias à venir à la température ambiante (~ 30 minutes). Si les follicules organisées vont être utilisés pour essais in vitro de développement, fraîchement préparer IVEM médias (insectes médias de Grace, 10% de sérum fœtal bovin inactivé à la chaleur, et 1x pénicilline / streptomycine). Si les follicules organisées vont être utilisés pour l'ARNm ou l'isolement de protéines utilisent soit des insectes de Grace ou IVEM médias. IMPORTANT: la température des médias est essentiel. Si le support est froid, il va modifierà la fois de l'actine et le cytosquelette de microtubules et de développement de bloc.
  2. Anesthésier les mouches dans le flacon à la levure par injection de CO 2 gaz et placez 3-5 mouches femelles sur un bloc de mouche sous CO 2. IMPORTANT: Ne laissez pas plus de femmes que peuvent être disséqués dans une période de temps de 10 min sur le pavé de la mouche que l'exposition prolongée au CO 2 peut provoquer la stérilité et la mort.
  3. Remplir un puits d'une plaque 9 place avec les médias et le placer sur une surface sombre (un morceau de plexiglas noir fonctionne bien). Focaliser le microscope à dissection sur le fond du puits.
  4. Utilisation # 5 pince Dumont ramasser une seule femelle avec une seule main (ce qui est le mieux fait en utilisant la main dominante). Il est souvent plus facile de ramasser la femelle par les ailes, les jambes ou le thorax de l'abdomen transition. Immerger la femelle dans les médias bien remplis. Ajuster le foyer du microscope selon les besoins.
  5. En utilisant une deuxième paire de pince dans la main non dominante, saisir la femelle à l'extrémité antérieure de l'abdomende sorte que l'extrémité postérieure est positionné vers la main dominante (Figure 2A). Assurez-vous de garder la volée immergée dans les médias.
  6. Avec la main dominante, utilisez la pince pour saisir la cuticule à la 2e secteur pigmentée la plus postérieure et déchirer l'écart du reste de l'abdomen (figures 2B-C).
  7. Utilisation de la pince dans la main dominante, presser doucement l'extrémité antérieure de l'abdomen jusqu'à ce que les ovaires émergent (figures 2D-E). Si nécessaire, placez la pince entre les deux ovaires et les sortir de la carcasse.
  8. Soit déplacer les ovaires à un nouveau puits avec du milieu frais (figure 2F) ou retirer la carcasse à une serviette Kimwipe ou papier. Ceci est particulièrement important si les follicules sont isolés pour le développement in vitro.
  9. Répétez l'opération jusqu'à 3-5 paires d'ovaires ont été isolés. REMARQUE: Chaque ovaire est composé de ~ 16 ovarioles ou des chaînes de manière séquentielle maturation des follicules. Chaque ovarioleest contenu dans une gaine de muscle.
  10. Utilisation étaux de broches et les aiguilles fournies avec eux, tirer doucement à l'ovaire en exécutant les aiguilles entre les ovarioles (figure 2G). Ce sera parfois libérer les follicules individuels.
  11. Ovarioles individuels et les étapes morphologiques faciles à distinguer de développement des follicules doivent maintenant être visible (figure 2G, taquiné dehors de l'ovaire). Se reporter aux figures 1 et 2H des différences morphologiques qui peuvent être utilisés pour distinguer les différentes étapes. Pour isoler les follicules qui sont dans ovarioles intactes et encore contenus à l'intérieur d'une gaine du muscle, en utilisant une aiguille de couper à travers la ovariole à la partie antérieure du follicule précédente et à la partie postérieure du follicule qui suit immédiatement le follicule d'intérêt. Ceci brisera la gaine du muscle et le follicule d'intérêt distance peut maintenant être coupé à partir des follicules voisins sans l'endommager. Comme les stades individuels sont séparés, déplacer les follicules présentant un intérêt, en utilisant une pipette en verre, d'un nouveau puits avec du milieu frais. Ceci est particulièrement important lors de l'isolation pour le développement des follicules in vitro. NOTE: Il est important de presser la poire de la pipette avant d'entrer dans les médias pour empêcher les bulles d'air de la redistribution des follicules d'intérêt à travers le puits. En outre, si les follicules sont collés à la pipette en verre, la pipette peut être pré-revêtue avec 3% d'albumine de sérum bovin (BSA) par pipetage de la solution de BSA de haut en bas plusieurs fois avec des milieux de rinçage et de dissection.
  12. Une fois que suffisamment de follicules ont été isolés, procéder à des expériences ultérieures.

3. Développement in vitro de follicules S10B

  1. Isoler les follicules S10B en utilisant le protocole d'isolement de l'étape (étape 2) dans des milieux IVEM. Assurez-vous que les follicules sont rapidement éloignés de débris. Comme ces follicules vont continuer à mûrir, il est important que S10Bs sont collectées pendant 30-60 min, puis placé dans le milieu de maturation de choix. REMARQUE: S10B convient de distinguer soigneusement de follicules S10A (figure 1C par rapport à 1B), que les follicules S10A ne mûriront pas dans le milieu de culture IVEM. Dans les deux S10A et S10B follicules, la moitié de la longueur est composée de cellules nourricières et que l'autre moitié est l'ovocyte, mais dans S10B la longueur du follicule est égale à celle des follicules S14.
  2. En utilisant une pipette en verre, déplacer ~ 30 follicules S10B dans un puits d'une plaque de culture tissulaire à 24 puits. REMARQUE: Assurez-vous de vérifier que tous les follicules en cours de transfert sont S10B et n'ont pas évolué au S11.
  3. Préparer une pi de milieu de maturation par puits, à savoir les médias IVEM ainsi que réactifs pharmacologiques.
  4. En utilisant une pipette en verre tiré *, supprimer autant les médias du bien (étape 3.2) que possible, et rapidement ajouter médias de maturation des choix. NOTE: Il est essentiel d'utiliser un pépin de verre tiréette que les follicules mise en scène peut être facilement repris soit avec des pipettes en verre ou des embouts de pipette avec un Pipetman.
    * Pour pipettes tirés: 1) chauffer la partie mince de long, des pipettes en verre dans la flamme d'un brûleur Bunsen jusqu'à ce que le verre commence à se ramollir; 2) passer immédiatement la pipette de la flamme et tirez horizontalement pour tirer la pipette dans un tube plus fin; 3) casser pour générer une pointe fine. ATTENTION: Utilisez des lunettes de protection comme des fragments de verre peuvent s'envoler.
  5. Répétez les étapes 3.1 à 3.4 pour autant de puits de l'expérience nécessite.
  6. Permettent de développer les follicules pour> 10 h et marquer la progression du développement sous un microscope à dissection. REMARQUE: Les expériences sont généralement marqué le lendemain pour laisser suffisamment de temps pour les follicules se développent. S10B est ~ 5 h, S11 est ~ 30 min, S12 est ~ 2 heures, et S13 est ~ 1 h dans la durée à 25 ° C 1 et du développement à la température ambiante prendra légèrement plus. Des expériences similaires à celle décrite pour les follicules peuvent être S10Beffectuée à l'aide follicules S11-S13.

4. Etape isolement pour l'imagerie en direct

  1. Isoler les follicules en phase avancée (S10B-14) exprimant le marqueur fluorescent de choix en utilisant le protocole d'isolement de l'étape (étape 2) dans des milieux IVEM, se déplaçant rapidement à une distance de follicules de débris.
  2. Déplacez follicules d'intérêt dans les nouveaux médias et les transférer à la pipette de verre à un fond de couvre-boîte de Pétri. Prenez soin d'ajouter les médias de sorte qu'il bouillonne dans la zone de fond de la lamelle, mais ne pas faire déborder.
  3. Pour plus de films time-lapse, il est parfois nécessaire pour maintenir l'humidité dans la boîte de Pétri en ajoutant un roulé Kimwipe, humidifié avec de l'eau, au bord intérieur de la boîte de Pétri. Placer le couvercle sur le dessus.
  4. L'image sur un microscope inversé. Résolution détaillée, il faudra la microscopie confocale. Il est nécessaire pour équilibrer la fréquence de formation d'image, la force d'éclairement, et la longueur de formation d'image, ce qui devra être mis au point de manière indépendante pour chaque loutil de Abeling et processus de développement.

5. Etape isolement pour l'ARNm Préparation

  1. Isoler follicules scène individuels en utilisant le protocole d'isolement de l'étape (étape 2) soit avec des médias de Grace ou IVEM.
  2. En utilisant une pipette en verre, déplacer les étages individuels d'intérêt dans de nouveaux puits avec des supports, il est possible de collecter à la fois des étages multiples.
  3. Gardez les temps de collecte sous 1 heure. Déplacer les follicules, en utilisant une pipette en verre, à 1,5 ml des tubes de microcentrifugation.
  4. Spin brièvement le tube dans un mini-centrifuger pour sédimenter tous les follicules. En utilisant une pipette en verre tiré (voir l'étape 3.4) retirez soigneusement tous les médias. NOTE: Si vous utilisez une micro en taille, centrifuger les follicules à basse vitesse.
  5. Ajouter 100 pi de Trizol et broyer la main pour ~ 20 secondes en utilisant un pilon en plastique. Isoler à pleine vitesse dans une micro et déplacer Trizol dans un nouveau tube de 1,5 ml en faisant attention à ne pas gêner d granulésebris. Conserver à -80 ° C.
  6. Répétez les étapes 5.1 à 5.5 jusqu'à ce que suffisamment de follicules ont été obtenus pour l'expérience. En routine, S10B ~ 75, ~ 75 S12, et S14 ~ 100 follicules donner ~ 10 pg d'ARN.
  7. Décongeler les échantillons sur la glace. Combiner les échantillons, le cas échéant, dans un tube de centrifugeuse et porter le volume Trizol jusqu'à 800 pi. Procéder à l'isolement de l'ARN comme indiqué par le fabricant. IMPORTANT: N'oubliez pas de DNase traiter l'ARN isolé avec de la RNase DNase.

6. Etape isolation pour Western Blot

  1. Préchauffer un bloc chauffant à 100 ° C.
  2. Isoler follicules scène individuels en utilisant le protocole d'isolement de l'étape (étape 2) soit avec des médias de Grace ou IVEM. NOTE: Il est nécessaire de déterminer de façon empirique le nombre d'un follicule étape particulière sont nécessaires pour observer chaque protéine spécifique. Pour les protéines fortement exprimés 1-3 S10B follicules / puits est suffisant pour voir un signal fort sur un western blot. Cependant, il est important de faire uneéchantillon représentatif, en follicules de plusieurs femelles. Ainsi, 15-20 follicules d'un stade particulier sont généralement collectées.
  3. Déplacer follicules, en utilisant une pipette en verre, d'un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger brièvement dans une mini-centrifuger pour sédimenter les follicules (voir l'étape 5.4). Retirez soigneusement tous les médias à l'aide d'une pipette de verre tiré (voir l'étape 3.4) et ajouter 50 ul de PBS 1x et 50 pi de tampon Laemmli 2x.
  4. Broyer à la main pour ~ 20 secondes avec un pilon en plastique. REMARQUE: pilons en plastique peuvent être réutilisés pour le broyage des échantillons de l'Ouest par lavage et les autoclavage.
  5. Faire bouillir les échantillons pendant 10 minutes dans le bloc chauffant.
  6. Réfrigérer brièvement sur la glace et de spin à pleine vitesse pendant 15 secondes dans une microcentrifugeuse. Soit immédiatement chargé sur un gel SDS-PAGE ou conserver à -20 ° C. NOTE: Si les échantillons sont conservés, n'oubliez pas de rebouillir les échantillons avant de les charger sur le gel.
  7. Effectuer une analyse Western blot selon des protocoles standards.

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Representative Results

Lorsque l'isolement des stades spécifiques du développement folliculaire chez la drosophile, il est essentiel d'être capable de distinguer avec précision les différentes étapes morphologiques. Ceci est quelque peu difficile pour les S10A et S10B, comme les cellules nourricières et l'ovocyte prennent chacun la moitié de la longueur du follicule à ces stades (Figure 1B par rapport à 1C). Cependant, les follicules S10A sont plus courts en longueur que les follicules S10B, S10B comme les follicules sont entièrement allongés et donc de longueur égale à un follicule S14 (figure 1C par rapport à 1G). En outre, un sous-ensemble du follicule ou cellules somatiques sur l'ovocyte appelées cellules folliculaires centripètes commencent à migrer entre les cellules nourricières et l'ovocyte à S10B. Pendant S10B, qui prend environ 5 heures, les cellules nourricières subissent un remodelage de l'actine dynamique de sorte qu'au S11 contrat de cellules nourricières, serrant leur contenu cytoplasmique dans l'ovocyte. Ainsi, à S11, la région de cellule de l'infirmière adiminué de façon significative, tandis que l'ovocyte a élargi (figure 1D). À S12, les cellules nourricières commencent à subir la mort et prendre un aspect plus opaque (figure 1E); intéressant, dans la culture, les restes infirmière cellulaires dorsale boucle dans les follicules S12 (voir S12 figures 3C'-D '). Au cours de S13, la région de cellule de l'infirmière est transparent comme la mort des cellules est en cours d'achèvement, et la formation dorsale des appendices est en cours (figure 1F). S14 seulement par l'ovocyte et les cellules de follicules restent, et formation dorsale des appendices est complète (figure 1G).

L'essai in vitro de développement peut être utilisé pour évaluer les conséquences de différents traitements pharmacologiques et des mutations génétiques sur le développement S10B et infirmière cellule de dumping (Figure 3). Le développement de S10Bs dans la culture est robuste, mais un certain nombre de facteurs peuvent conduire à des résultats expérimentaux pauvres. Sur la figure 3A,données expérimentales à la fois un succès et une expérience ratée sont fournis. Une expérience réussie est celui dans lequel 80-100% des follicules de type sauvage dans les médias de contrôle infirmière cellule complète le dumping et le progrès à S12-14 (figure 3A, poids 1). L'occasion des contrôles de type sauvage échouera, ce qui signifie que moins de 80% des follicules développer (figure 3A, poids 2). Cet échec peut être causé par un certain nombre de questions, notamment: 1.) Incapacité à distinguer S10A de follicules S10B (voir les figures 1 et 2), 2) les problèmes des médias (température, l'âge, etc), et / ou 3) follicules étaient exposé aux débris pendant trop longtemps.

Développement in vitro de S10Bs peut être utilisé en combinaison avec un traitement pharmacologique. Pour ces expériences, il est important que les contrôles de la drogue, à savoir le traitement de type sauvage follicules avec la drogue, sont effectuées avec chaque expérience, car l'efficacité et / ou de concentrat drogueion peut changer avec le temps. Pour les expériences pharmacologiques, il est commode d'analyser le rapport entre le pourcentage de follicules en développement dans le traitement de la toxicomanie à celle dans un milieu de contrôle, ce contrôle pour de légères différences de fond génétique. Il est souvent utile de traiter avec la concentration IC 50 de la drogue, c'est la concentration qui bloque 50% de type sauvage (yw) follicules de subir infirmière cellule dumping et le développement. . Ainsi, le rapport de follicules de type sauvage devrait être de 0,5 (figure 3B, de la drogue 1) La figure 3B est un exemple de la façon dont un médicament (aspirine) peut devenir trop concentré (médicament 2; probablement en raison de l'évaporation du solvant) et le bloc plus de 50% des follicules de type sauvage de développement. Pour illustrer davantage le dosage in vitro de développement, les images des deux puits de développement des follicules S10B sont fournis. Figures 3C et D illustrent les follicules S10B au début de l'essai, de contrôle ou de l'aspirine traités (~ 2 mm) médias. figures 3C 'et D' illustrer la fin de l'essai, révélant que la majorité des follicules traités de contrôle développés à S14, tandis que la majorité des aspirine follicules traités n'ont pas infirmière cellule complété dumping.

L'essai in vitro de développement peut également être utilisé pour le dépistage de fonds génétiques qui sont plus sensibles à un médicament particulier. Figure 3E contient deux exemples. Dans le premier exemple, le fond génétique (expt1, barre bleue) ne parvient pas à interagir avec de l'aspirine comme le rapport reste ~ 0,5, à l'inverse, dans le second exemple, le fond génétique (expt2, barre rouge) renforce l'effet de l'aspirine. Ainsi, l'essai in vitro de développement peut être utilisé pour définir les conséquences des mutations et des réactifs pharmacologiques sur les événements de développement et morphologiques qui se produisent au cours de la fin de l'ovogenèse, en outre, le dosage peut être utilisé pour évaluer à la fois pharmacologique et interactions génétiques (voir 9).

l'isolement de la scène peut également être utilisé pour l'imagerie en temps réel des processus de développement. Figure 4 est un exemple d'un film en time-lapse d'un follicule S10B exprimer utrophine-GFP, le domaine de liaison de l'actine de utrophine humaine fusionnée à la protéine fluorescente verte. Grâce à cet outil d'imagerie, l'actine formation de faisceau et de la condensation peut être visualisée. De nombreux outils sont disponibles pour l'imagerie en direct, y compris les protéines piège lignées transgéniques 16,17, SAMU entraînés par fluorescence marqués marqueurs des organites (mitochondries, appareil de Golgi, réticulum endoplasmique, etc.), SAMU entraînés par fluorescence marqués marqueurs du cytosquelette (protéines de liaison d'actine et de l'actine, microtubules et microtubules protéines de liaison), lignées transgéniques exprimant une fluorescence marqués protéine d'intérêt, et des colorants vitaux (Nil rouge étiquettes lipides neutres, étiquettes Edu réplication de l'ADN, FM4-64 étiquettes membranes).

ove_content "> Des analyses moléculaires peuvent être effectuées en utilisant les étapes isolées de follicules chez la drosophile. Pour l'analyse des protéines par western blot, il est nécessaire de déterminer de façon empirique le nombre de follicules, d'un stade de développement particulier, sont tenus de respecter la protéine d'intérêt. Figure 5 est un exemple de la façon de diluer de manière séquentielle un lysat de protéine concentrée pour déterminer le nombre de follicules S10B nécessaires pour observer une protéine particulière, Fascin. Dans ce cas, un follicule S10B suffit d'observer cette protéine par transfert de Western.

Figure 1
Figure 1. Schéma décrivant la composition cellulaire des follicules et des images illustrant Drosophila la différence morphologique de-mi-à la fin de l'étape Drosophila follicles. A. Diagramme montrant la composition cellulaire d'un follicule S10A. BG. images représentatifs de follicules S10A-S14 Drosophila prises à l'aide d'une chaîne stéréo dissection étendue. Le follicule drosophile se compose de 16 cellules de la lignée germinale dérivés: 1 ovocytes (rouge, A) et 15 cellules nourricières ou de soutien (jaune, A), qui sont entourés par ~ 650 cellules épithéliales somatiques dérivés (blanc, magenta et cyan, A ). Au S10A, une moitié de la longueur du follicule est composé des cellules nourricières (support jaune, B), qui sont couvertes par les cellules tronçon de follicule (magenta dans A), et l'autre moitié est composée de l'ovocyte (astérisque rouge , B), qui est couverte par les principales cellules de follicules de corps (blanc en A). Au S10B, les cellules nourricières (support jaune, C) et ovocytes (astérisque rouge, C) composent chaque moitié de la length du follicule, cependant la longueur totale du follicule est maintenant égale à celle d'un follicule S14 (comparer C à G). Pendant S11, les cellules nourricières (du support jaune, D) serrent rapidement leur contenu cytoplasmique dans l'ovocyte allongement (astérisque rouge, D) / un processus de myosine-actine dépendante appelée infirmière cellule dumping. En S12, l'ovocyte (astérisque rouge, E) a entièrement allongée comme infirmière cellule dumping restes complets et seulement cellulaires infirmières restent (support jaune, E). Les restes infirmière cellulaires (support jaune, F) de la mort cellulaire complète à S13. S14 représente le follicule pleine maturité, qui est composé de l'ovocyte (astérisque rouge, G), les cellules somatiques, et la coquille, y compris les appendices dorsaux (flèches blanches, G). B. barre d'échelle = 0,1 mm.

Figure 2 Figure 2. Images donne un aperçu de la dissection des ovaires et de l'isolement du follicule. A. submerger la volée dans les médias de dissection et l'orienter de sorte qu'il est tenu, par forceps, dans la main non dominante. B. Utilisation de la main dominante, saisir la cuticule à la partie postérieure de l'abdomen. C. Tirez la cuticule off, exposer les ovaires (flèche jaune). D. Travailler de la partie antérieure de l'abdomen vers le postérieur, presser doucement l'abdomen libérer les ovaires (flèche jaune). E. Séparez les ovaires (flèche jaune) de toute cuticule restant (flèche rouge) et / ou des organes internes (pointes de flèche blanche). F. Transfert des ovaires isolés à un milieu frais contenant bien disséquer. G. démêler les ovaires, l'utilisation d'aiguilles de dissection, pour exposer indifollicules individuels (comparer ovaire intact (en haut) de l'ovaire séparés (en bas). points blancs pointe de flèche à un follicule S10B poignardé, un exemple d'un follicule qui ne devrait pas être utilisé pour des expériences ultérieures. H. Sélectionner les stades morphologiques d'intérêt (Etapes 10A -14 (S10A-S14) représenté).

Figure 3
Figure 3. Exemples de tests in vitro dans de développement. A. Tableau du pourcentage de follicules S10B que le développement complet de la culture. poids 1 est un exemple de développement attendu de type sauvage follicules S10B (96% de développement), tout en poids 2 est un exemple de mauvais développement de la culture (68% en développement). Nous serions généralement écartons toute l'expérience si le développement de type sauvage follicules S10B dans les médias de commande est inférieure à 80%. B. CI50 pour l'aspirine pour le développement de pourcentage dans les milieux témoins. La CI 50 est la concentration qui bloque 50% des follicules S10B du développement, ce qui signifie la valeur de type sauvage devrait être ~ 0,5. Médicament 1 est un exemple de rapport de type sauvage attendu (0,52), alors que le médicament 2 est un exemple de ce qui arrive quand la concentration du médicament est trop fort (0,37). CD. Images in vitro puits de développement. CC. Contrôle traitée. DD '. aspirine traitée (~ 2 mM). CD. l'image de la S10Bs au début de l'essai. C'-D'. l'image des follicules au point du dosage final. Contrôle traité follicules S10B développent à S14s dans la culture (C '), alors que la majorité de l'aspirine traités follicules ne parviennent pas à compléter infirmière cellule de dumping (D'). CI50 pour l'aspirine pour le développement de pourcentage dans les milieux témoins. Ceci est un exemple de deux expériences à la recherche de pharmaco-interactions. Le expt1 (barre bleue) mutant ne modifie pas l'effet de la CI 50 de l'aspirine (0,57), tandis que le expt2 (barre rouge) mutant augmente l'effet de l'aspirine (0,16).

Figure 4
Figure 4. Exemple montrant l'utilisation de isolé S10B follicules pour l'imagerie en direct. AF. Projections maximum de 3 tranches de time-lapse z-piles d'un follicule S10B isolé de utrophine :: GFP exprimant mouches transgéniques (SQH-utrophine :: GFP). A'-F '. Encarts agrandies soulignent une cellule unique de l'infirmière A- F. AF '. F-actine (utrophine :: GFP), blanc. A, A'. Temps (t) = 0 min. B, B '. T = 20 min. C, C'. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min. F, F '. t = 100 min. Au point de temps initial, courts filaments d'actine peuvent être observées s'étendant vers l'intérieur des membranes cellulaires infirmière (A, A '). Ces filaments d'actine s'allongent à travers les points de début de temps (BC 'par rapport à A, A') jusqu'à ce qu'ils soient complètement allongée (D, D '). Dans des temps plus tardifs, ces filaments d'actine entièrement allongées puis raccourcissent et se condensent dans toute infirmière cellule de dumping (EF ») A. barre d'échelle = 50 um. A 'La barre d'échelle. = 10 um.

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.. Figure 5 Illustration de la façon de déterminer le nombre de follicules nécessaires pour examiner une protéine particulière par analyse Western blot Il s'agit d'un western blot regardant expression Fascin dans les follicules S10B (01h20, sn 7C, Cooley, L.; études sur le développement Hybridoma Banque (DSHB), élaboré sous les auspices de la NICHD et maintenu par l'Université de l'Iowa, Département de biologie, Iowa City, IA, 52242). Les chiffres dans le haut représentent le nombre approximatif de follicules S10B chargés par voie.

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Discussion

Le follicule drosophile est composé de seulement un petit nombre de types de cellules, le rendant idéal pour les analyses moléculaires et morphologiques. En outre, en raison de la structure de l'ovaire, il est relativement facile d'obtenir un grand nombre d'étapes spécifiques du développement des follicules avec un microscope à dissection commune et une formation minimale. Comme chaque étape représente une fenêtre temporelle courte, l'isolement de la scène peut fournir des indications moléculaires importantes dans les processus de développement qui se produisent au cours de cette étape. Par exemple, nous avons utilisé l'isolement mi et la fin de follicule étape pour caractériser les modifications de l'expression des gènes qui se produisent pendant S10B, S12, S14 et 18. Cette analyse suggère un certain nombre de gènes non définies auparavant sont susceptibles de contribuer au développement du follicule et, en particulier, la formation de la coquille.

l'isolement de la scène peut fournir des indications dramatiques dans les événements morphologiques par imagerie en temps réel. Une telle formation d'image peut être effectuée sur al l stades de développement folliculaire chez la drosophile. Alors que l'objectif de ce travail est S10B-14, le lecteur se reportera aux articles suivants pour live-imagerie de stades antérieurs: germarium 13, follicule allongement 19, et la scène 9 11,12,14. Les conditions de culture utilisées dans ces études sont distincts de ceux décrits dans ce travail. Plus précisément, ces études ont utilisé des insectes avec les médias de Schneider avec des niveaux variables de FBS (2,5 à 15%) ainsi que l'addition d'insuline 11-13,19 et, dans certains cas, l'addition supplémentaire du tréhalose, le méthoprène, 20-hydroxyecdysone, et adénosine deamidase 14. Il est important de souligner que ces études vivants d'imagerie ont considérablement fait progresser notre compréhension des événements survenus au cours de ces premiers stades de développement. Cependant, ces follicules en début de carrière ne peuvent pas progresser tout le chemin à l'étape finale du développement folliculaire, S14. Inversement, S10B-13 développera à S14 dans la culture.

ove_content "> Pendant S10B-S14 de nombreux processus morphologiques se produisent qui peuvent être étudiés par imagerie en temps réel. Par exemple, l'imagerie en direct peut être utilisé pour examiner le processus de l'infirmière cellule dumping, le processus par lequel les cellules nourricières presser leur contenu cytoplasmique dans l'ovocyte à lui fournir tout ce qu'il faut pour compléter l'embryogenèse. cellule d'infirmière de dumping peut être observé par imagerie time-lapse en lumière transmise 7 ou par imagerie confocale en utilisant des lignées transgéniques exprimant des marqueurs fluorescents (voir Figure 4). L'utilisation continue de l'imagerie en direct devrait fournir de nouveaux éclairages sur les dynamiques nécessaires pour l'infirmière cellule de dumping du cytosquelette. Live-imagerie de stades a également fait progresser notre compréhension de la dorsale appendice migration de primordia et tubulogenèse 10.

Dans le développement in vitro de follicules S10B-S13 peut être utilisé pour définir les effets des deux réactifs pharmacologiques et des manipulations génétiques sur les procédés se produirel'anneau pendant ce temps. Nous avons utilisé dans le développement in vitro de follicules S10B d'établir le rôle des prostaglandines dans la régulation infirmière cellule de dumping 7. Par la suite nous avons utilisé ce test pour effectuer un écran pharmacologique interaction, plus précisément, nous avons testé si la perte d'une copie d'un régulateur d'actine augmente ou supprime la cellule infirmière le dumping des défauts dus à la perte de prostaglandines. Cet écran a révélé un certain nombre de cibles en aval putatifs (9 et Spracklen, Meyer, et Tootle, données non publiées). Le test peut également être utilisé pour examiner les interactions génétiques en évaluant les défauts de développement, comme un bloc en infirmière cellule dumping, en raison de l'hétérozygotie pour deux facteurs différents (pour un exemple de ce voir 9).

Tout en isolant-mi-à la fin de l'étape follicules chez la drosophile est un processus assez simple, il ya un certain nombre de facteurs critiques de succès optimal. Tout d'abord, la préparation du vol esttrès important. Il est préférable de maintenir les différents génotypes de mouches dans un état ​​aussi proche que possible, c'est à dire le nombre de mouches par flacon, le ratio femmes-hommes (ratio de 2:1 est idéal), et de fournir de la levure fraîche, humide constamment. L'alimentation (levure humide) et le temps de dissection vont modifier la prévalence des différents stades de développement. Nous avons constaté que lorsque les mouches sont toujours nourris le matin, plus S10Bs peuvent être isolés dans la matinée, tandis que plus de S12 sont présents dans l'après-midi. Un deuxième facteur critique est le média. Pour le développement in vitro et l'imagerie en direct, il est essentiel de préparer les médias IVEM frais. En outre, les médias doivent venir à la température ambiante que les médias froids modifier les cytosquelette, actine et microtubules fois, et donc perturber le développement. Il est également important de maintenir les follicules loin de débris. Parfois, lors de la dissection, l'intestin va sortir avec les ovaires. Nous avons trouvé que si l'intestin est rompueet les follicules sont maintenus dans les milieux contaminés, les follicules sont peu susceptibles de se développer en culture. Comme les follicules continuent à se développer dans la culture, il est essentiel de revérifier la mise en scène après dissection avant de procéder à un taux de développement in vitro ou des analyses moléculaires. Enfin, il est important d'avoir des contrôles appropriés pour les expériences. Pour le développement in vitro, il est nécessaire d'utiliser des follicules de type sauvage pour tester que les médias permet un développement normal (80-100% infirmière cellule complète immersion), et à vérifier que les réactifs pharmacologiques agissent comme prévu (voir la figure 3).

En conclusion, l'isolement de-mi-à la fin de follicules stade drosophile peut donner un aperçu significatif dans les processus de développement à travers une variété de techniques expérimentales.

Tableau des réactifs et des équipements spécifiques:

Nom du réactif Entreprise Chatlogue nombre Commentaires (optionnel)
La levure sèche active Genesee scientifique 62-103 Toute source de levure sèche active est bien
Insecte médias de Grace Lonza 04-457F
Inactivé par la chaleur de sérum bovin fœtal Atlanta Biologicals S11050H Toute la chaleur de FBS inactivé devrait fonctionner
10x Pen / Strep Gibco / Invitrogen 15140-122
Étaux broches et aiguilles Ted Pella, Inc. 13561-10
Coin Plate, Nine bien Corning 7220-85
# 5 pince Dumont Outils Fine Sciences 11252-20
24 plaques multi-puits Becton Dickinson 35 3226 Pas de préférence 24 puits tissu boîte de culture doit travailler
Lamelle Plats Bas (35 mm) MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Coverslip épaisseur dépendra du microscope / objectif utilisé
Pipettes en verre Corning 7095B-5x (pour transférer des follicules)
7095B-9 (pour la production de pipettes tirés)
pilon de l'échantillon (1,5 pi; RNase / DNase) Produits internationaux de recherche 199228 Toute pilon en plastique qui s'adapte microtubes de 1,5 pi peut être utilisé
Trizol Invitrogen 15596-018

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Disclosures

Il n'y a rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier Thomas Lecuit (la ligne de GFP de SQH-utrophine), Bloomington Stock Center, et le développement des études Hybridoma Banque des réactifs. Nous remercions en outre tous les membres de la Tootle Lab pour des discussions utiles et des critiques du manuscrit. Le financement de la National Science Foundation MCB-1158527, et des fonds de démarrage de l'anatomie et de département de biologie cellulaire de l'Université de l'Iowa ont soutenu ce travail. National Institutes of Health des subventions de formation pré-doctorale en sciences pharmacologiques T32GM067795 soutenu SJA. support de stockage de données ont été fournies par l'ICTS, qui est financé par le CSTC soutenue par le National Center for Research Resources et le Centre national pour l'avancement des sciences translationnelle, National Institutes of Health, par Grant UL1RR024979.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Genesee Scientific 62-103 Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media Lonza 04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11050H Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep Gibco/Invitrogen 15140-122
Pin Vises and Needles Ted Pella, Inc. 13561-10
Spot Plate, Nine Well Corning 7220-85
#5 Dumont forceps Fine Science Tools 11252-20
24 multi-well plates Becton Dickinson 35 3226 Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm) MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes Corning 7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes - long Corning 7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) Research Products International 199228 Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol Invitrogen 15596-018

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References

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  19. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).

Tags

Biologie du Développement numéro 82, profil d'expression génique la microscopie microscopie confocale la biologie cellulaire la recherche génétique biologie moléculaire pharmacologie, Ovogenèse follicule live-imagerie l'expression des gènes le développement
L&#39;utilitaire de la phase spécifique-mi-à la fin<em&gt; Drosophila</em&gt; Folliculo Isolation
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