Summary
Stadio-specifica isolamento di medio-tardiva follicoli Drosophila è utile per una varietà di scopi. Tali follicoli si sviluppano nella cultura, che permette di manipolazioni genetiche e / o farmacologici per essere accoppiato con saggi in vitro di sviluppo e immagini dal vivo. Inoltre, follicoli possono essere usate per studi molecolari, come isolare mRNA e proteine.
Abstract
Drosophila oogenesi o lo sviluppo del follicolo è stato ampiamente utilizzato per far progredire la comprensione dei complessi processi biologici di sviluppo e cellulari. Questo documento descrive i metodi come isolare medio-tardiva follicoli fase (fase 10B-14) e di utilizzarle per fornire nuove intuizioni gli eventi molecolari e morfologiche che si verificano durante le finestre strette di tempo di sviluppo. Isolato follicoli possono essere utilizzati per una varietà di tecniche sperimentali, inclusi vitro nello sviluppo, l'imaging dal vivo, analisi di espressione di mRNA e analisi western blot di proteine. Follicoli dello Stage 10B (S10B) o poi completare lo sviluppo in coltura, questo permette di coniugare perturbazioni genetiche o farmacologiche con lo sviluppo in vitro per definire gli effetti di tali manipolazioni sui processi che si verificano durante periodi specifici dello sviluppo. Inoltre, poiché questi follicoli si sviluppano nella cultura, sono l'ideale per gli studi di imaging dal vivo, Che spesso rivelare nuovi meccanismi che mediano eventi morfologici. Isolato follicoli possono essere utilizzati anche per analisi molecolari. Per esempio, cambiamenti nell'espressione genica che derivano da perturbazioni genetiche possono essere definiti per specifiche finestre di sviluppo. Inoltre, livello di proteine, stabilità, e / o stato modificazione post-traslazionale durante una particolare fase di sviluppo del follicolo possono essere esaminati mediante analisi Western blot. Pertanto, l'isolamento specifico stadio di follicoli Drosophila fornisce una ricca fonte di informazioni in processi ampiamente conservate di sviluppo e morfogenesi.
Introduction
Ogni ovaio Drosophila è composto di ~ 16 ovarioli, o catene di sequenza maturazione camere di uova o follicoli. Ogni follicolo è costituito da un unico ovocita, derivate cellule nutrici o di sostegno 15 della linea germinale, e ~ 650 cellule somatiche chiamati cellule follicolari (Figura 1A). Drosophila oogenesi è diviso in 14 tappe morfologicamente definiti di sviluppo 1. Ogni stadio di sviluppo follicolare è osservato più volte all'interno di una singola mosca, rendendo relativamente facile isolare un consistente numero di follicoli stadio-specifica.
Medio-tardiva Le tappe di dell'ovogenesi (Tappe 10B-14) sono particolarmente adatti per l'isolamento stadio (Figura 1). Nella Fase 10B (S10B), il follicolo è completamente allungata (cioè la sua lunghezza è pari a quella di uno Stage 14 (S14) follicolo, vedi Figura 1 e Figura 2H) e metà della lunghezza del follicolo è composto da cellule infermierementre l'altra metà è l'ovocita (Figura 1C). In questa fase le cellule nutrici subiscono drammatico rimodellamento actina, il rafforzamento del actina corticale e la generazione di fasci paralleli di filamenti di actina 2. Allo stesso tempo, una popolazione di cellule del follicolo, chiamato cellule centripete, migrare tra le cellule infermiere e l'ovocita, e due gruppi di cellule follicolari dorsali diventa specificato sottoporsi migrazione per formare le appendici dorsali, apparecchi respiratori tubolari per l'embrione 3 . Le cellule nutrici poi contrattuali (S11), spremere il loro contenuto citoplasmatico nell'ovocita in un processo chiamato cella di infermiere dumping, che fornisce l'ovocita con i fattori necessari per poter completare l'embriogenesi (Figura 1D). Le cellule vengono poi sottoposte infermiere morte cellulare (S12-S13) 4, e le cellule follicolari secernono e modello del guscio 5 (Figure 1E-G). Così, alla fine dell'oogenesi è ricca di un importante sviluppod processi morfogenetici.
Isolato follicoli medio-fase recente (S10B-S14) possono essere utilizzati per una varietà di scopi, comprese le analisi molecolari. Ad esempio, mRNA da follicoli in scena può essere isolato per RT-PCR, microarray, o analisi RNA-seq. Questo permette di guardare l'espressione genica in un breve lasso di sviluppo, con solo pochi tipi di cellule presenti, e determinare come l'espressione genica è cambiato da perturbazioni sia farmacologici o genetici. Isolamento fase può anche essere usato per guardare proteine mediante western blotting. Tale analisi è importante perché permette di quantificare il livello di espressione della proteina in wild-type contro mutanti nelle fasi specifiche. Sebbene si possa usare immunofluorescenza analisi per ottenere risultati simili, quantificazione della fluorescenza è meno robusta a causa dei requisiti rigorosi che tutti i pixel essere compresa nell'intervallo lineare di rilevamento 6. Inoltre, l'analisi western blot può fornire altre informazioni, ad uns se la proteina viene posttranslationally modificato o è espressa da una specifica isoforma di splicing. Isolato fasi possono anche essere usati per ulteriore purificazione della proteina, compreso frazionamento subcellulare o coimmunoprecipitation.
Specifica fase di isolamento follicolo può essere utilizzato anche per saggi in vitro per lo sviluppo 7 e dal vivo-imaging 8. Isolato follicoli S10B-S13 continuerà a sviluppare per S14 in semplice terreni di coltura (vedi sotto). È importante notare che i follicoli S10A non progredire attraverso cella infermiera scarico utilizzando le condizioni di coltura discusse in questo manoscritto. Abbiamo usato S10B vitro di sviluppo nel definire il ruolo delle prostaglandine, sia farmacologicamente e geneticamente, nella regolazione actina rimodellamento utilizzando cellule infermiere dumping e di sviluppo che il read-out 7,9. Analogamente, le successive fasi di sviluppo possono essere isolati per determinare gli effetti dei trattamenti farmacologici o uomo geneticaipulations su particolari processi come la migrazione centripeta delle cellule, la migrazione appendice dorsale / 10 la formazione, e la morte cellulare infermiere. Tali saggi possono essere utilizzati per eseguire le schermate di interazione dominanti o saggi, ad esempio, mentre eterozigosi per mutazioni nel pxt o fascina da soli non hanno alcun effetto sulla S10B sviluppo in vitro, follicoli dei doppi eterozigoti cella infermiera mostra il dumping difetti e un blocco nello sviluppo 9.
Inoltre, poiché S10B-13 può svilupparsi nella cultura, tutti i processi che si verificano durante questo periodo può essere osservato da live-imaging. Tale rappresentazione può essere eseguita semplicemente utilizzando luce trasmessa (se si è interessati solo a cambiamenti lordi in morfologia) o con la microscopia confocale utilizzando mosche transgeniche esprimenti sonde fluorescenti o follicoli colorati con coloranti di imaging dal vivo. L'imaging dal vivo viene utilizzato per far avanzare notevolmente la nostra comprensione dei processi di sviluppo. Infatti, vivere imaging di follicoli in fase avanzata ha ampliato la conoscenza della migrazione appendice dorsale, un esempio di tubulogenesi 10. Ci aspettiamo che l'imaging dal vivo di ulteriori processi tardivamente, comprese le dinamiche di actina durante la cella infermiere di dumping, fornirà nuove intuizioni in questi eventi evolutivi. E 'importante notare che mentre S10A e prime fasi di sviluppo del follicolo non continueranno a svilupparsi in un S14 in cultura, live-imaging di eventi che si verificano durante queste fasi di sviluppo è possibile utilizzando condizioni di coltura alternativi 11-14 (vedi la discussione per ulteriori informazioni).
Qui forniamo protocolli dettagliati per isolare i follicoli in fase avanzata sia per lo sviluppo in vitro e viviamo-imaging, o analisi molecolari (mRNA e isolamento proteine).
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Protocol
1. Preparazione Drosophila Prima di stage isolamento
- Rendere lievito in pasta umida combinando 50 g di lievito secco con 90 ml di acqua distillata. Mescolare con una spatola per unire. Lasciare riposare l'impasto per ~ 30 minuti prima di valutare la coerenza. La consistenza dovrebbe essere abbastanza spesso per aderire al lato di un flaconcino mosca ma non correre lungo il lato. Per ottenere la consistenza desiderata può essere necessario aggiungere fino a 10 ml di acqua aggiuntiva o una piccola quantità di lievito secco. Conservare in un contenitore coperto a 4 ° C. Il lievito memorizzate possono essere utilizzate per ~ 1-2 settimane.
- Raccogliere <24 hr vecchie mosche adulti (maschi e femmine) dei genotipi desiderate e metterli in un flaconcino con la mosca oltre al cibo umido lievito in pasta spalmato sul lato del flaconcino. La temperatura alla quale linea sono mantenuti varierà secondo l'esperimento. Per gli esperimenti di routine, mosche sono mantenute a temperatura ambiente. Considerando esperimenti in cui un gene èessendo iperespresso utilizzando il sistema UAS/GAL4 15 maggio richiedere mantenendo linea a 25 ° C o più, a seconda dei casi.
- Fornire linea con striscio di lievito in pasta giornaliero per 2 giorni. NOTA: Dato che lo sviluppo del follicolo è strettamente regolata dallo stato nutrizionale della mosca femminile, è essenziale per fornire al volo con la sostanza nutritiva ricca lievito in pasta per almeno 36 ore prima della dissezione.
2. Isolamento di Mid-fine Staged Drosophila follicoli
- Lasciare i media a temperatura ambiente (~ 30 min). Se i follicoli in scena stanno per essere utilizzati per test di sviluppo in vitro, fresco preparare IVEM supporto (supporti di Grace insetti, calore inattivato siero fetale bovino al 10%, e 1x penicillina / streptomicina). Se i follicoli in scena stanno per essere utilizzati per mRNA o isolamento delle proteine utilizzano o insetti di Grace o IVEM media. IMPORTANTE: la temperatura media è fondamentale. Se il supporto è freddo si alterasia il citoscheletro actina e microtubuli e sviluppo blocco.
- Anestetizzare le mosche in flaconcino yeasted iniettando gas CO 2 e collocare 3-5 mosche di sesso femminile su un pad mosca sotto CO 2. IMPORTANTE: Non lasciare più femmine che può essere sezionato in un periodo di tempo di 10 min sul pad volo come l'esposizione estesa a CO 2 può causare la sterilità e morte.
- Riempire un pozzetto di una piastra 9 posto con i media e posizionarlo sulla cima di una superficie scura (un pezzo di plexiglass nero funziona bene). Focalizzare l'ambito dissezione sul fondo del pozzo.
- Uso # 5 pinze Dumont raccogliere una donna sola con una sola mano (questo è meglio farlo con la mano dominante). Spesso è più facile prendere il femminile dalle ali, gambe e torace per la transizione addome. Immergere la femmina nei media riempite bene. Regolare la messa a fuoco del microscopio, se necessario.
- Utilizzo di una seconda coppia di pinze tenuto in mano non dominante, afferrare la femmina alla fine anteriore dell'addomein modo che l'estremità posteriore è posizionata verso la mano dominante (Figura 2A). Assicurarsi di mantenere la mosca sommersa nei media.
- Con la mano dominante, utilizzare la pinza per afferrare la cuticola al segmento pigmentata più posteriore secondo e strappare via dal resto dell'addome (Figure 2B-C).
- Utilizzando la pinza in mano dominante, premere delicatamente l'estremità anteriore dell'addome fino a quando le ovaie emergono (figure 2D-E). Se necessario, posizionare la pinza tra le due ovaie e tirarli fuori dalla carcassa.
- O spostare le ovaie a un nuovo pozzo con mezzi freschi (Figura 2F) o rimuovere la carcassa di un tovagliolo Kimwipe o carta. Questo è particolarmente importante se follicoli sono stati isolati per lo sviluppo in vitro.
- Ripetere l'operazione finché non sono stati isolati 3-5 paia di ovaie. NOTA: Ogni ovaio è composta da ~ 16 ovarioli o catene di sequenza maturazione follicoli. Ogni ovarioleè contenuta all'interno di una guaina muscolare.
- Utilizzando morse pin e gli aghi in dotazione con loro, tirare delicatamente a parte l'ovaio eseguendo gli aghi tra i ovarioli (Figura 2G). Ciò a volte sbloccare i singoli follicoli pure.
- Ovarioli individuali e le fasi morfologiche facilmente distinguibili di sviluppo del follicolo dovrebbero essere visibili (Figura 2G, preso in giro a parte dell'ovaio). Fare riferimento alle figure 1 e 2H per differenze morfologiche che possono essere utilizzati per distinguere le diverse fasi. Per isolare follicoli che sono all'interno ovarioli intatti e ancora contenuti in una guaina muscolare, utilizzare un ago per tagliare tutti i ovariole al anteriore del follicolo precedente e al posteriore del follicolo immediatamente successivo follicolo di interesse. Questo romperà la guaina muscolare e follicolo di interesse distanza può essere tagliato via dai follicoli limitrofi senza danneggiarlo. Come singoli stadi sono separati, spostare i follicoli di interesse, utilizzando una pipetta di vetro, di un nuovo pozzo con mezzi freschi. Ciò è particolarmente importante quando isolando follicoli per lo sviluppo in vitro. NOTA: È importante schiacciare il bulbo della pipetta prima di entrare media per evitare le bolle d'aria dalla ridistribuzione dei follicoli di interesse in tutto il pozzetto. Inoltre, se i follicoli stanno attaccando la pipetta di vetro, la pipetta può essere una fase solida con 3% albumina di siero bovino (BSA) pipettando la soluzione BSA su e giù diverse volte e risciacquare con i media dissezione.
- Una volta abbastanza follicoli sono stati isolati, procedere con esperimenti successivi.
3. In vitro per lo sviluppo di follicoli S10B
- Isolare follicoli S10B utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) in mezzi IVEM. Assicurarsi che i follicoli sono rapidamente allontanati dai detriti. Poiché questi follicoli continueranno a maturare, è imponella documentazione, che S10Bs sono raccolti per 30-60 min e poi inserito nel supporto maturazione di scelta. NOTA: S10B devono essere accuratamente distinto dai follicoli S10A (Figura 1C rispetto al 1B), in quanto i follicoli S10A non matureranno nella cultura dei media IVEM. In entrambi S10A e S10B follicoli, metà della lunghezza è composto da cellule infermiere e l'altra metà è l'ovocita, ma in S10B la lunghezza del follicolo è uguale a quella dei follicoli S14.
- Usando una pipetta di vetro, spostare ~ 30 follicoli S10B in un pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 24 pozzetti. NOTA: Assicurarsi di verificare che tutti i follicoli in fase di trasferimento sono S10B e non hanno maturato alla S11.
- Preparare 1 ml di media stagionatura per bene, cioè supporti IVEM più reattivi farmacologici.
- Usando una pipetta di vetro tirato *, rimuovere il più supporti dal pozzo (passo 3.2) come possibile, e rapidamente aggiungi maturazione di supporto desiderato. NOTA: è indispensabile utilizzare un pip di vetro tiratoette come follicoli in scena può essere facilmente assimilato sia con pipette in vetro o punte di pipette con Pipetman.
* Per fare pipette tirato: 1) riscaldare la parte sottile di lunghi, pipette di vetro nella fiamma di un becco Bunsen solo fino a quando il vetro comincia ad ammorbidirsi, 2) spostare immediatamente la pipetta dalla fiamma e tirare orizzontalmente per disegnare la pipetta in un tubo sottile, 3) rompere per generare un punto di fine. ATTENZIONE: Usare protezioni per gli occhi come frammenti di vetro possono volare via. - Ripetere i passaggi 3,1-3,4 per il numero di pozzi come l'esperimento richiede.
- Consentire follicoli di sviluppare per> 10 ore e segnare la progressione evolutiva in un ambito di dissezione. NOTA: Gli esperimenti sono in genere segnati il giorno successivo per consentire un tempo sufficiente per i follicoli a sviluppare. S10B è ~ 5 ore, S11 è ~ 30 minuti, S12 è ~ 2 ore, e la S13 è ~ 1 ora di durata a 25 ° C 1 e sviluppo a temperatura ambiente prenderà leggermente più lungo. Esperimenti simili a quello descritto per i follicoli S10B possono essereeseguita utilizzando follicoli S11-S13.
4. Isolamento palco per Live Imaging
- Isolare follicoli fase tardiva (S10B-14) che esprime il marcatore fluorescente di scelta utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) in mezzi IVEM, muovendosi rapidamente i follicoli lontano dai detriti.
- Spostare follicoli di interesse in nuovi media e poi il trasferimento da pipetta di vetro per una Petri piastra inferiore vetrino. Abbiate cura di aggiungere supporti in modo che bolle nella zona inferiore vetrino, ma non trabocchi.
- Per lunghi film intervallati, a volte è necessario mantenere l'umidità all'interno della piastra Petri aggiungendo un arrotolata Kimwipe inumidito con acqua, al bordo interno della piastra Petri. Mettere il coperchio sulla parte superiore.
- Immagine su un microscopio invertito. Risoluzione dettagliata richiederà microscopia confocale. È necessario bilanciare frequenza di immagini, la forza di illuminazione, e la lunghezza di immagini; questo dovrà essere lavorato in modo indipendente per ogni lstrumento Abeling e processo di sviluppo.
5. Isolamento Palco per mRNA Preparazione
- Isolare i singoli follicoli stadio utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) sia con i media di Grace o IVEM.
- Usando una pipetta di vetro, spostare le singole fasi di interesse in nuovi pozzetti con media; è possibile raccogliere più fasi contemporaneamente.
- Mantenere tempi di recupero in 1 ora. Spostare i follicoli, utilizzando una pipetta di vetro, provette da 1,5 ml microcentrifuga.
- Centrifugare brevemente la provetta in un mini-microcentrifuga per far sedimentare tutti i follicoli. Usando una pipetta di vetro tirato (vedi punto 3.4), rimuovere con attenzione tutti i mezzi di comunicazione. NOTA: Se si utilizza una microcentrifuga full size, centrifugare i follicoli a bassa velocità.
- Aggiungere 100 ml di Trizol e macinare a mano per ~ 20 secondi usando un pestello in plastica. Spin giù a tutta velocità in una microcentrifuga e passare Trizol in una nuova provetta da 1,5 ml microcentrifuga facendo attenzione a non disturbare alcun d pellettatoebris. Conservare a -80 ° C.
- Ripetere i passaggi 5,1-5,5 fino a quando sono stati ottenuti abbastanza follicoli per l'esperimento. Ordinariamente, ~ 75 S10B, ~ 75 S12 e S14 ~ 100 follicoli cedere ~ 10 mg di RNA.
- Scongelare i campioni sul ghiaccio. Combina campioni, a seconda dei casi, in una provetta per microcentrifuga e portare il volume Trizol fino a 800 ml. Procedere con isolamento di RNA come indicato dal costruttore. IMPORTANTE: Ricordarsi di DNasi trattare l'RNA isolato con RNasi libero DNasi.
6. Isolamento Palco per Western Blotting
- Preriscaldare un blocco di calore a 100 ° C.
- Isolare i singoli follicoli stadio utilizzando il protocollo di isolamento fase (fase 2) sia con i media di Grace o IVEM. NOTA: È necessario determinare empiricamente quanti di un particolare follicolo fase sono necessarie per osservare ogni specifica proteina. Per le proteine altamente espresse 1-3 S10B follicoli / e è sufficiente per vedere un segnale forte su una macchia occidentale. Tuttavia, è importante fare unacampione rappresentativo, tenendo follicoli da più femmine. Così, 15-20 follicoli di una fase particolare sono di solito raccolti.
- Spostare follicoli, usando una pipetta di vetro, una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Spin brevemente in un mini-microcentrifuga per far sedimentare i follicoli (vedi punto 5.4). Rimuovere con attenzione tutti i media utilizzando una pipetta di vetro tirato (vedi punto 3.4) e aggiungere 50 ml di PBS 1x e 50 ml di tampone 2x Laemmli.
- Macinare a mano per ~ 20 sec con un pestello in plastica. NOTA: pestelli di plastica possono essere riutilizzati per la macinazione di campioni occidentali con il lavaggio e la sterilizzazione in autoclave.
- Bollire i campioni per 10 minuti nel blocco termico.
- Raffreddare brevemente su ghiaccio e far girare a piena velocità per 15 secondi in una microcentrifuga. O caricare immediatamente su un gel SDS-PAGE o conservare a -20 ° C. NOTA: Se vengono memorizzati i campioni, ricordatevi di reboil i campioni prima di caricare sul gel.
- Eseguire l'analisi Western Blot seguenti protocolli standard.
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Representative Results
Quando si isola specifici stadi di sviluppo del follicolo Drosophila è essenziale essere in grado di distinguere con precisione le diverse fasi morfologiche. Questo è piuttosto impegnativa per S10A e S10B, come le cellule infermiere e l'ovocita ognuna metà della lunghezza del follicolo in queste fasi (Figura 1B rispetto a 1C). Tuttavia, follicoli S10A sono più corta follicoli S10B, come i follicoli S10B sono completamente allungati e quindi di lunghezza pari ad un follicolo S14 (Figura 1C rispetto a 1G). Inoltre, un sottoinsieme del follicolo o cellule somatiche nel ovocita chiamate cellule follicolari centripete cominciano a migrare tra le cellule infermiere e l'ovocita a S10B. Durante S10B, che prende ~ 5 ore, le cellule nutrici subiscono rimodellamento actina dinamico in modo che alla S11 il contratto cellule nutrici, spremere il loro contenuto citoplasmatico nell'ovocita. Così a S11, la regione cellule infermiere hanotevolmente diminuito, mentre l'ovocita ha ampliato (Figura 1D). Al S12, le cellule infermiere cominciano a subire la morte e ad assumere un aspetto più opaco (Figura 1E), interessante, nella cultura, i resti di cellule infermiera arricciatura dorsale nei follicoli S12 (vedi S12s nelle figure 3C'-D '). Durante S13, la regione cella infermiere è trasparente come morte cellulare sia completato, e la formazione appendice dorsale avviene (Figura 1F). Con S14 solo l'ovocita e le cellule del follicolo rimangono, e la formazione appendice dorsale è completa (Figura 1G).
Il test in vitro sviluppo in può essere utilizzato per valutare le conseguenze di vari trattamenti farmacologici e mutazioni genetiche sullo sviluppo S10B e la cella infermiere dumping (Figura 3). Lo sviluppo di S10Bs in cultura è robusto, tuttavia una serie di fattori può portare a scarsi risultati sperimentali. Nella Figura 3A,vengono forniti dati sperimentali sia da un successo e un esperimento fallito. Un esperimento di successo è quella in cui 80-100% dei follicoli wild-type in mezzi di controllo scarico cella infermiere completa e progressi S12-14 (Figura 3A, wt 1). Di tanto in tanto i controlli wild-type falliranno, il che significa che meno del 80% dei follicoli sviluppare (Figura 3A, peso 2). Questo errore può essere causato da una serie di problemi tra cui:. 1) incapacità di distinguere S10A dai follicoli S10B (fare riferimento alle figure 1 e 2), 2) problemi multimediali (temperatura, età, ecc), e / o 3) follicoli erano esposta a detriti per troppo tempo.
Nello sviluppo vitro di S10Bs può essere utilizzato in combinazione con il trattamento farmacologico. Per tali esperimenti, è importante che i controlli di droga, vale a dire il trattamento di wild-type follicoli con la droga, sono eseguite con ogni esperimento, perché l'efficacia e / o concen drogaione può cambiare con il tempo. Per gli esperimenti farmacologici, è opportuno analizzare il rapporto tra la percentuale dei follicoli in via di sviluppo nel trattamento farmacologico a quello nei mezzi di controllo; questo controlla per leggere differenze background genetico. Spesso è utile per trattare con la concentrazione IC50 del farmaco, questa è la concentrazione che blocca il 50% di wild-type (yw) follicoli dalla fase delle cellule infermiere dumping e di ulteriore sviluppo. . Così, il rapporto di tipo selvatico follicoli dovrebbe essere 0,5 (Figura 3B, farmaco 1) Figura 3B è un esempio di come un farmaco (aspirina) può diventare troppo concentrato (farmaco 2; probabilmente dovuto al solvente evaporazione) e blocco superiore al 50% delle wild-type follicoli da sviluppare. Per illustrare ulteriormente il saggio di sviluppo in vitro, sono ottenute immagini di due pozzi di sviluppo follicoli S10B. Figure 3C e D illustrano i follicoli S10B all'inizio delsaggio, nel controllo o aspirina trattati (~ 2 mm) media. Figure 3C 'e D' illustrare la fine del test, rivelando che la maggioranza dei follicoli trattati controllo sviluppati per S14, mentre la maggior parte dei follicoli trattati aspirina non ha cell infermiera completato dumping.
Lo sviluppo in vitro può anche essere usato per individuare background genetici che sono più sensibili ad un particolare farmaco. Figura 3E contiene due esempi di questo. Nel primo esempio, il background genetico (expt1, barra blu) non riesce a interagire con l'aspirina come rapporto rimane ~ 0,5, per converso, nel secondo esempio, il background genetico (expt2, barra rossa) aumenta l'effetto dell'aspirina. Così, il vitro sviluppo può essere utilizzata per definire le conseguenze di mutazioni e reagenti farmacologici sugli eventi di sviluppo e morfologici che si verificano durante la fine oogenesi, in più, il saggio può essere utilizzato per valutare sia farmacologico e interazioni genetiche (vedi 9).
Isolamento stadio può essere utilizzato anche per l'imaging in tempo reale dei processi di sviluppo. Figura 4 è un esempio di un film accelerato di un follicolo S10B esprimere Utrophin-GFP, il dominio di legame actina da Utrophin umana fusa alla proteina fluorescente verde. Usando questo strumento di imaging, actina formazione di fascio e condensa può essere visualizzato. Molti strumenti sono disponibili per l'imaging dal vivo, tra cui intrappolare proteina linee transgeniche 16,17, UAS guidati fluorescente contrassegnati marcatori organelli (mitocondri, Golgi, il reticolo endoplasmatico, ecc.), UAS guidati fluorescente contrassegnati marcatori del citoscheletro (actina e proteine di legame actina, microtubuli e microtubulo proteine leganti), linee transgeniche esprimenti alcuna fluorescenza tagged proteina di interesse, e di coloranti vitali (Nile Red etichette lipidi neutri, etichette Edu replicare il DNA, FM4-64 etichette membrane).
ove_content "> analisi molecolari possono essere eseguite utilizzando fasi isolate di follicoli Drosophila. Per l'analisi delle proteine mediante western blotting, è necessario determinare empiricamente quanti follicoli, di un particolare stadio di sviluppo, sono tenuti ad osservare la proteina di interesse. Figura 5 è un esempio di come diluire sequenzialmente un lisato proteico concentrato per determinare il numero di follicoli S10B necessari per osservare una particolare proteina, Fascin. In questo caso un follicolo S10B è sufficiente rilevare questa proteina mediante western blotting.
Figura 1. Schema che descrive la composizione cellulare dei follicoli Drosophila e le immagini che illustrano la differenza morfologica di medio-tardiva fase Drosophila follicles. A. Diagramma raffigurante la composizione cellulare di un follicolo S10A. BG. Immagini rappresentative dei follicoli S10A-S14 Drosophila scattate con un impianto stereo dissezione ambito. Il follicolo Drosophila è composto da 16 germinali derivate da cellule: 1 ovocita (rosso, A) e 15 celle infermiere o di supporto (giallo, A), che sono circondato da ~ 650 cellule epiteliali somaticamente-derivati (bianco, magenta e ciano, A ). A S10A, la metà della lunghezza del follicolo è composto di cellule infermiere (staffa gialla, B), che sono coperte dalle cellule follicolari tratto (magenta in A), e l'altra metà è composta dell'oocita (asterisco rosso , B), che è coperto dai principali cellule del corpo follicolari (bianchi in A). A S10B, le cellule nutrici (staffa giallo, C) e ovociti (asterisco rosso, C) ciascuna compongono la metà del length del follicolo, tuttavia la lunghezza complessiva del follicolo è ora uguale a quello di un follicolo S14 (confrontare C a G). Durante S11, le cellule nutrici (staffa giallo, D) rapidamente spremere il loro contenuto citoplasmatico nell'ovocita allungamento (asterisco rosso, D) in un processo / miosina-actina dipendenti chiamati cellule infermiera dumping. Con S12, l'ovocita (asterisco rosso, E) ha pienamente allungata come cellule infermiera di dumping è resti completi e solo cellulari infermieri rimangono (staffa giallo, E). I resti cellulari infermiere (staffa giallo, F) morte cellulare completo a S13. S14 rappresenta il follicolo completamente maturo, che è composto di dell'oocita (asterisco rosso, G), cellule somatiche, e guscio d'uovo, comprese le appendici dorsali (frecce bianche, G). B. Scale bar = 0,1 mm.
Figura 2. Immagini di fornire una panoramica di dissezione ovaie e l'isolamento del follicolo. A. Immergere la mosca nei media sezionare e orientarlo in modo che si tiene, da forcipe, nella mano non dominante. B. Usando la mano dominante, afferrare la cuticola al posteriore dell'addome. C. Tirare la cuticola off, esponendo le ovaie (freccia gialla). D. Lavorando anteriore dell'addome verso la parte posteriore, premere delicatamente l'addome rilasciando le ovaie (freccia gialla). E. Separare le ovaie (freccia gialla) da qualsiasi cuticola rimanente (freccia rossa) e / o organi interni (frecce bianche). F. Trasferire le ovaie isolati a un nuovo supporto dissezione bene che contengono. G. Tease a parte le ovaie, utilizzando aghi dissezione, per esporre indifollicoli individuali (confrontare ovaie intatte (in alto) per ovaio separati (in basso). Bianchi luoghi punta di freccia per un follicolo accoltellato S10B, un esempio di un follicolo che non dovrebbe essere utilizzato per esperimenti successivi. H. Selezionare le fasi morfologiche di interesse (Tappe 10A -14 (S10A-S14) mostrato).
Figura 3. Esempi di test di sviluppo in vitro. A. grafico della percentuale di S10B follicoli che lo sviluppo completo in cultura. wt 1 è un esempio di sviluppo previsto di wild-type follicoli S10B (96% in via di sviluppo), mentre il peso di 2 è un esempio di scarso sviluppo nella cultura (68% in via di sviluppo). Vorremmo solito scartiamo l'intero esperimento se lo sviluppo di wild-type S10B follicoli in mezzi di controllo è inferiore al 80%. B. 50 per l'aspirina alla percentuale di sviluppo nei mezzi di controllo. La IC50 è la concentrazione che blocca il 50% dei follicoli S10B di sviluppo, il che rende il valore wild-type dovrebbe essere ~ 0,5. Drug 1 è un esempio del rapporto wild-type previsto (0,52), mentre farmaco 2 è un esempio di ciò che accade quando la concentrazione del farmaco è troppo forte (0,37). CD '. Immagini di pozzi di sviluppo in vitro. CC'. Controllo trattata. DD '. Aspirina trattati (~ 2 mM). CD. Immagine del S10Bs all'inizio del saggio. C'-D'. immagine di follicoli nel punto finale del dosaggio. Controllo trattati follicoli S10B si sviluppano a S14s nella cultura (C '), mentre la maggioranza dei aspirina trattati follicoli non riescono a completare cella infermiera dumping (D').
Figura 4. Esempio che mostra l'uso di isolati S10B follicoli per l'imaging dal vivo. AF. Proiezioni massimo di 3 fette di time-lapse z-stack di un follicolo S10B isolato dal Utrophin :: GFP che esprimono mosche transgeniche (SQH-Utrophin :: GFP). À-F '. Inserti ingrandite evidenziano una singola cella infermiera A- F. AF '. F-actina (Utrophin :: GFP), bianco. A, A'. Tempo (t) = 0 min. B, B '. T = 20 min. C, C'. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min. F, F '. t = 100 min. Al punto di tempo iniziale, filamenti di actina brevi possono essere osservati estende all'interno delle membrane cellulari infermiere (A, A '). Questi filamenti di actina si allungano durante i primi punti del tempo (BC 'rispetto a A, A') fino a quando non sono completamente allungata (D, D '). In momenti successivi, questi filamenti di actina completamente allungate poi si accorciano e si condensano in tutto cella infermiera dumping (EF ') A. Scala bar = 50 pm. A'. Bar Scala = 10 micron.
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.. Figura 5 Illustrazione di come determinare il numero di follicoli necessarie per esaminare una particolare proteina mediante analisi western blot Questa è una macchia occidentale, guardando l'espressione fascina nei follicoli S10B (01:20, sn 7C, Cooley, L.; Developmental Studies Ibridoma Bank (DSHB), sviluppato sotto gli auspici del NICHD e mantenuto dalla University of Iowa, Dipartimento di Biologia, Iowa City, IA, 52242). I numeri nella parte superiore rappresentano il numero approssimativo di S10B follicoli caricati per corsia.
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Discussion
Il follicolo Drosophila è composto da un piccolo numero di tipi cellulari, rendendolo ideale sia morfologica e analisi molecolari. Inoltre, a causa della struttura dell'ovaio, è relativamente facile ottenere un gran numero di stadi specifici dello sviluppo del follicolo con un ambito dissezione comune e una formazione minima. Come ogni tappa rappresenta una breve finestra temporale, isolamento stadio può offrire notevoli spunti molecolari nei processi di sviluppo che si verificano durante tale fase. Ad esempio, abbiamo utilizzato l'isolamento fase del follicolo metà-fine di caratterizzare i cambiamenti di espressione genica che si verificano durante S10B, S12 e S14 18. Questa analisi suggerisce un certo numero di geni precedentemente uncharacterized possono contribuire allo sviluppo del follicolo e, in particolare, la formazione di guscio d'uovo.
Isolamento fase può fornire spunti drammatici in eventi morfologici attraverso immagini dal vivo. Tali immagini vengono eseguite su al l stadi di sviluppo del follicolo Drosophila. Mentre l'attenzione di questo lavoro è S10B-14, si rimanda ai seguenti articoli di live-imaging di fasi precedenti: germarium 13, follicolo allungamento 19, e stage 9 11,12,14. Le condizioni di coltura utilizzate in questi studi sono distinti da quelli discussi in questo lavoro. In particolare, questi studi è stato utilizzato di Schneider Insect multimediale con livelli variabili di FBS (2.5-15%) e l'aggiunta di insulina 11-13,19 e, in alcuni casi, l'ulteriore aggiunta di trealosio, methoprene, 20-hydroxyecdysone, e adenosina deamidase 14. È importante sottolineare che questi studi di imaging dal vivo hanno significativamente avanzato la nostra comprensione degli eventi che si verificano durante queste fasi iniziali dello sviluppo. Tuttavia, questi follicoli fase iniziale non possono progredire fino alla fase finale di sviluppo del follicolo, S14. Al contrario, S10B-13 si svilupperà per S14 nella cultura.
ove_content "> Durante S10B-S14 molti processi morfologici verificano che può essere studiato per l'imaging dal vivo. Ad esempio, l'imaging dal vivo può essere utilizzato per esaminare il processo di cellula infermiere dumping, il processo con cui le cellule nutrici spremere il loro contenuto citoplasmatico nell'ovocita di fornire tutto ciò di cui ha bisogno per completare l'embriogenesi. cella Nurse scarico può essere osservato dal time-lapse imaging a luce trasmessa 7 o confocale utilizzando linee transgeniche esprimenti marcatori fluorescenti (vedi Figura 4). L'uso continuato di imaging dal vivo è prevista per fornire nuovi approfondimenti sulle dinamiche del citoscheletro delle cellule necessarie per infermiere dumping. Live-imaging fasi successive ha anche avanzato la nostra comprensione della dorsale appendice migrazione primordi e tubulogenesi 10.In vitro sviluppo di follicoli S10B-S13 può essere utilizzato per definire gli effetti dei due reagenti farmacologici e manipolazioni genetiche sui processi verificarsisuonare durante questo tempo. Abbiamo utilizzato nello sviluppo vitro di follicoli S10B per stabilire il ruolo delle prostaglandine nella regolazione cellulare infermiera scarico 7. Successivamente abbiamo usato questo test per eseguire una schermata farmacologico interazione, in particolare, abbiamo testato se la perdita di una copia di un regolatore actina migliora o sopprime la cella infermiera di dumping difetti dovuti alla perdita di prostaglandine. Questa schermata ha rivelato una serie di obiettivi a valle putativi (9 e Spracklen, Meyer, e Tootle, dati non pubblicati). Il dosaggio può anche essere utilizzato per esaminare le interazioni genetiche valutando difetti di sviluppo, come un blocco nella cella infermiere dumping, causa eterozigosità per due fattori differenti (per un esempio di questo vedere 9).
Mentre isolare medio-tardiva fase follicoli Drosophila è un processo abbastanza semplice, ci sono una serie di fattori critici di successo ottimale. In primo luogo, la preparazione delle mosche èmolto importante. E 'meglio mantenere diversi genotipi di mosche in quanto simile condizione possibile, cioè il numero di mosche per flaconcino, il rapporto tra femmine ai maschi (rapporto 2:1 è ideale), e fornire lievito fresco, bagnato costantemente. L'alimentazione (lievito bagnato) e il tempo dissezione altereranno la prevalenza delle diverse fasi di sviluppo. Abbiamo scoperto che quando le mosche sono costantemente alimentati al mattino, più S10Bs possono essere isolati al mattino, mentre più S12s sono presenti nel pomeriggio. Un secondo fattore critico è la media. Per lo sviluppo in vitro e in vivo imaging è essenziale per preparare supporti IVEM freschi. Inoltre, i media devono venire a temperatura ambiente come supporti freddi si modificano citoscheletro, sia actina e microtubuli, e quindi interrompere ulteriore sviluppo. E 'anche importante mantenere i follicoli lontano dagli scarti. A volte, durante la dissezione, l'intestino uscirà con le ovaie. Abbiamo trovato che se l'intestino è rottaei follicoli sono conservati nei media contaminati, i follicoli sono improbabili per sviluppare in coltura. Poiché i follicoli continuano a svilupparsi in coltura, è essenziale verificare nuovamente la stadiazione dopo dissezione prima di procedere sia con lo sviluppo in vitro o analisi molecolari. Infine, è importante avere controlli adeguati per gli esperimenti. Per lo sviluppo in vitro, è necessario utilizzare wild-type follicoli per verificare che il supporto permette il normale sviluppo (80-100% cella infermiere scarico completo), e per verificare che i reagenti farmacologici applicati come previsto (vedere la Figura 3).
In conclusione, l'isolamento di medio-tardiva follicoli fase di Drosophila può fornire indicazioni significative nei processi di sviluppo attraverso una varietà di tecniche sperimentali.
Tabella di reagenti specifici ed attrezzature:
| Nome del reagente | Azienda | Gattoalogue numero | Commenti (opzionale) |
|---|---|---|---|
| Lievito secco attivo | Genesee scientifico | 62-103 | Qualsiasi fonte di lievito secco attivo va bene |
| Grace Insect media | Lonza | 04-457F | |
| Inattivato al calore siero fetale bovino | Atlanta Biologicals | S11050H | Qualsiasi inattivato al calore FBS dovrebbe funzionare |
| 10x Pen / Strep | Gibco / Invitrogen | 15140-122 | |
| Morse pin e aghi | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| # 5 pinze Dumont | Strumenti Belle Scienza | 11252-20 | |
| 24 piastre multi-pozzetto | Becton Dickinson | 35 3226 | Qualsiasi 24-ben tessuto piatto cultura dovrebbe funzionare |
| Coprioggetti Piatti inferiori (35 mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Spessore Coverslip dipenderà utilizzato il microscopio / obiettivo |
| Pipette di vetro | Corning | 7095B-5x (per il trasferimento di follicoli) 7095B-9 (per la produzione di pipette tirato) | |
| Pestello del campione (1,5 microlitri; RNasi / DNasi libero) | Prodotti di Ricerca Internazionale | 199.228 | Qualsiasi pestello plastica che si inserisce 1.5 provette per microcentrifuga microlitri può essere utilizzata |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
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Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Thomas Lecuit (SQH-Utrophin :: linea GFP), l'Bloomington Stock Center, e il Developmental Studies Ibridoma Banca dei reagenti. Abbiamo inoltre Ringraziamo tutti i membri del Tootle Lab per utili discussioni e critiche del manoscritto. Finanziamento dal National Science Foundation MCB-1158527, e fondi di start-up del Dipartimento di Anatomia e Biologia Cellulare, Università di Iowa sostenuto questo lavoro. National Institutes of Health Predoctoral formazione di Grant in Scienze Farmacologiche T32GM067795 supportato AJS. Supporto di memorizzazione dei dati sono state fornite dal ICTS, che è finanziato attraverso il CTSA sostenuto dal Centro Nazionale per le Risorse della Ricerca e il Centro Nazionale per l'Avanzamento delle Scienze traslazionale, National Institutes of Health, attraverso di Grant UL1RR024979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
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