Nyttan av Stage-specifika Mitten till slutet Published: December 2, 2013 doi: 10.3791/50493

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Andrew J. Spracklen¹, Tina L. Tootle¹

¹Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa Carver College of Medicine

Summary

Stage-specifik isolering av mitten till slutet av Drosophila folliklar är användbar för en rad olika ändamål. Sådana folliklar utvecklas i kultur, vilket gör det möjligt för genetiska och / eller farmakologiska manipulationer som ska tillsammans med in vitro utvecklingsanalyser och levande bilder. Dessutom kan folliklar användas för molekylära studier, till exempel isolering av mRNA och protein.

Abstract

Drosophila oogenes eller follikelutveckling har i stor utsträckning använts för att utveckla förståelsen av komplexa utvecklings-och cell biologiska processerna. Detta metoder papper beskriver hur man isolera mitten till sen utvecklingsfas folliklar (Stage 10B-14) och använda dem för att ge nya insikter i de molekylära och morfologiska händelser som inträffar under snäva fönster av utvecklingstiden. Isolerade folliklar kan användas för en mängd olika experimentella tekniker, inklusive in vitro utvecklingsanalyser, Bildproduktion, mRNA-expressionsanalys och western blot-analys av proteiner. Folliklar vid Stage 10B (S10B) eller senare kommer att slutföra utvecklingen av kultur, vilket gör att man kan kombinera genetiska eller farmakologiska störningar med in vitro-utveckling för att fastställa effekterna av sådana manipulationer på de processer som sker under vissa perioder av utveckling. Dessutom, eftersom dessa folliklar utvecklas i kultur, de är idealiska för live-imaging studier, Vilket ofta avslöjar nya mekanismer som medierar morfologiska händelser. Isolerade folliklar kan också användas för molekylära analyser. Exempelvis kan förändringar i genuttryck som resulterar från genetiska störningar definieras för särskilda utvecklings fönstren. Dessutom kan proteinnivå, stabilitet, och / eller posttranslationell modifiering tillstånd under ett visst skede av utvecklingen av folliklar undersökas genom Western blot analyser. Således scen specifik isolering av Drosophila folliklar ger en rik källa till information i stor utsträckning bevarade utvecklingsprocesser och morfogenes.

Introduction

Varje Drosophila äggstock består av ~ 16 ovarioles eller kedjor av sekventiellt mognar ägg kammare eller folliklar. Varje follikel består av en enda äggcell, 15 bakterielinje härrör sjuksköterska eller stödceller, och ~ 650 somatiska celler kallas follikelstimulerande celler (Figur 1A). Är Drosophila oogenes indelat i 14 morfologiskt definierade utvecklingsstadier ^1. Varje steg av follikelutveckling observeras många gånger inom en enda fluga, vilket gör det relativt lätt att isolera ett stort antal scenspecifika folliklar.

De mitten till slutet stadier av oogenes (Stages 10B-14) är särskilt väl lämpade för steg isolering (Figur 1). I steg 10B (S10B), den follikeln helt utsträckt (dvs dess längd är lika med den för en etapp 14 (S14) follikel, se figur 1 och figur 2H) och halva längden av follikel består av sjuksköterska cellermedan den andra hälften är äggcellen (Figur 1C). I detta skede sjuksköterskan cellerna genomgår dramatiska aktin ombyggnad, stärka den kortikala aktin och skapa parallella buntar av aktin filament ^2. På samma gång, en population av follikelceller, benämnd centripetala celler migrerar in mellan sjuksköterska celler och oocyten, och två dorsala grupper av follikelceller blivit valt att genomgå övergång till bildning av de dorsala bihang, rörformiga luftvägsanordningar för embryot ³ . Sköterskan cellerna sedan kontrakt (S11), pressa deras cytoplasma innehållet i äggcellen i en process som kallas sjuksköterska cell dumpning, vilket ger äggcellen med de faktorer som krävs för att slutföra embryogenes (Figur 1D). Sköterskan cellerna genomgår sedan celldöd (S12-S13) ^4, och follikeln cellerna utsöndrar och mönster äggskal ⁵ (figur 1E-G). Således är rik med viktiga utvecklings ett slut oogenesd morfogenetiska processer.

Isolerade mitten till sen utvecklingsfas folliklar (S10B-S14) kan användas för en mängd olika syften, inklusive molekylära analyser. Till exempel kan mRNA från staged folliklar isoleras för RT-PCR, microarray, eller RNA-seq analyser. Detta gör att man kan titta på genuttryck inom en kort utvecklings fönster, med endast några celltyper som finns och bestämma hur genuttrycket förändras genom antingen farmakologiska eller genetiska störningar. Stage isolering kan också användas för att titta på proteiner med western blotting. En sådan analys är viktigt eftersom det gör att man kan kvantifiera nivån av proteinuttryck i vildtyp kontra mutanter i vissa stadier. Medan man kan använda immunofluorescerande analyser för att uppnå liknande resultat, kvantifiering av fluorescens är mindre robust på grund av de stränga krav som alla de pixlar ligga inom det linjära intervallet för detektering ^6. Dessutom kan Western blot-analys ge annan information, till exempel ens om proteinet är posttranslationellt modifierade eller uttrycks från en specifik splits isoformen. Isolerat stadier kan också användas för ytterligare rening av proteiner, inklusive subcellulär fraktionering eller coimmunoprecipitation.

Stage specifika follikelstimulerande isolering kan också användas för in vitro utvecklingsanalyser ⁷ och levande avbildning ^8. Isolerade S10B-S13 folliklar kommer att fortsätta utvecklas till S14 i enkla odlingsmedia (se nedan). Det är viktigt att notera att S10A folliklar inte kommer att fortskrida genom sjuksköterska cell dumpning användning av betingelserna kultur som diskuteras i detta manuskript. Vi har använt S10B in vitro utvecklingsanalyser för att definiera rollen av prostaglandiner, både farmakologiskt och genetiskt, i regleringen av aktin ombyggnad med sjuksköterskan cell dumpning och utveckling avläsning ^7,9. På samma sätt kan de senare stadierna av utveckling också isoleras för att avgöra effekterna av farmakologiska behandlingar eller genetisk manipulations på särskilda processer som centripetal cell migration, rygg bihang migration / formation ^10, och sjuksköterska celldöd. Sådana analyser kan användas för att utföra dominanta interaktions skärmar eller analyser, till exempel, medan heterozygositet för mutationer i PXT eller Fascin enbart har ingen effekt på S10B in vitro-utveckling, folliklar från dubbel heterozygoter uppvisar sjuksköterska cell dumpnings fel och ett block i utveckling ^9.

Dessutom, eftersom S10B-13 kan utvecklas i kultur, alla de processer som sker under denna tid kan observeras i levande bilder. En sådan avbildning kan utföras helt enkelt genomfallande ljus (om man är bara intresserad av stora förändringar i morfologi) eller med konfokalmikroskopi med hjälp av transgena flugor som uttrycker fluorescerande prober eller folliklar färgade med levande avbildning färgämnen. Live avbildning används för att avsevärt förbättra vår förståelse av utvecklingsprocesser. Indeed, levande imaging sent skede folliklar har utökat kunskapen om rygg bihang migration, ett exempel på tubulogenesis ^10. Vi räknar med att live-avbildning av ytterligare sena scenprocesser, inklusive aktin dynamik under sjuksköterska cell dumpning, kommer att ge nya insikter i dessa utvecklings händelser. Det är viktigt att notera att medan S10A och tidiga stadier av follikelutveckling inte kommer att fortsätta att utvecklas till en S14 i kultur, kan levande avbildning av händelser som inträffar under dessa stadier av utveckling med hjälp av alternativa odlingsbetingelser ^11-14 (se Diskussion mer information).

Här ger vi detaljerade protokoll för att isolera sent skede folliklar för antingen in vitro utveckling och live-avbildning, eller molekylära analyser (mRNA och protein isolering).

Protocol

1. Förbereda Drosophila Före Stage Isolering

1. Gör våt jäst pasta genom att kombinera 50 g av aktiv torrjäst med 90 ml destillerat vatten. Blanda med en spatel för att kombinera. Låt blandningen stå i ~ 30 minuter innan en bedömning konsistens. Konsistensen ska vara precis tillräckligt tjock för att hålla sig till sidan av en fluga flaska men inte kör ner sidan. För att uppnå den önskade konsistensen kan det vara nödvändigt att lägga till upp till 10 ml av ytterligare vatten eller en liten mängd torr jäst. Förvara i en täckt behållare vid 4 ° C. Den lagrade jästen kan användas under ~ 1-2 veckor.
2. Samla <24 tim gammalt vuxna flugor (både män och kvinnor) av de önskade genotyper och sätta dem i en injektionsflaska med fluga mat plus våt jäst pasta smetat på sidan av flaskan. Den temperatur vid vilken flugorna hålls kommer att variera beroende på experimentet. För rutinmässiga experiment, är flugor som hölls vid rumstemperatur. Med beaktande av följande experiment i vilka en gen som ärär överuttryckt med hjälp av UAS/GAL4 systemet ¹⁵ kan kräva att behålla flugorna vid 25 ° C eller högre, beroende på omständigheterna.
3. Ge flugor med en fräsch utstryk av jäst pasta dagligen i 2 dagar. OBS: Eftersom follikelutveckling är hårt reglerad av näringstillståndet hos den kvinnliga fluga, är det viktigt att ge flugan med den näringsrika jäst pasta i minst 36 timmar före dissekering.

2. Isolera Mitten till slutet Iscensatt Drosophila folliklar

1. Tillåt media att komma till rumstemperatur (~ 30 min). Om de iscensatta folliklar kommer att användas för in vitro utvecklingsanalyser, nyligen förbereda IVEM media (Graces insekts medier, 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum, och 1x penicillin / streptomycin). Om det steg folliklar kommer att användas för mRNA-eller proteinisolering använda antingen Grace insekt eller IVEM medier. VIKTIGT: Mediatemperatur är kritisk. Om materialet är kallt det kommer att förändrabåde aktin och mikrotubuli cytoskeletons och blockera utveckling.
2. Söva flugor i yeasted flaskan genom att injicera _CO2 gas och placera 3-5 kvinnliga flugor på en fluga pad under _CO2. VIKTIGT: Lämna inte fler honor än vad som kan dissekeras i en 10 min period i farten pad förlängd exponering för _CO2 kan orsaka sterilitet och död.
3. Fyll en brunn på en 9 plats platta med media och placera den på toppen av en mörk yta (en bit svart plexiglas fungerar bra). Fokusera dissekera omfattning på botten av brunnen.
4. Använda # 5 Dumont pincett plocka upp en enda kvinnlig med en hand (detta görs bäst genom att använda den dominerande handen). Det är ofta enklast att plocka upp den kvinnliga av vingar, ben, eller bröstkorgen till buken övergång. Sänk den kvinnliga i media fylls väl. Justera mikroskopets fokus efter behov.
5. Med hjälp av en andra pincett hålls i icke-dominanta handen, greppa honan vid den främre änden av bukenså att den bakre änden är placerad i riktning mot den dominerande handen (Figur 2A). Se till att hålla farten nedsänkt i media.
6. Med den dominerande handen, använd pincett för att ta tag i nagelbanden på den 2: a mest bakre pigmenterad segmentet och slita bort den från resten av buken (figur 2B-C).
7. Med hjälp av pincetten i den dominanta handen, försiktigt pressa den främre änden av buken tills äggstockarna fram (figur 2D-E). Om det behövs, placera tången i mellan de två äggstockarna och dra dem ur stommen.
8. Antingen flyttar äggstockarna att en ny brunn med färskt medium (Figur 2F) eller ta bort kadavret till en Kimwipe eller pappershandduk. Detta är särskilt viktigt om folliklar att isoleras för in vitro-utveckling.
9. Upprepa tills 3-5 par av äggstockar har isolerats. OBS: Varje äggstock består av ~ 16 ovarioles eller kedjor av sekventiellt mognande folliklar. Varje ovarioleär innesluten i en muskel slida.
10. Med hjälp av stiftskruvstycken och nålar medföljer dem, försiktigt dra isär äggstocken genom att köra nålar mellan ovarioles (figur 2G). Detta kommer ibland släppa enskilda folliklar också.
11. Individuella ovarioles och lätt urskiljbara morfologiska stadier av follikelutveckling bör nu vara synlig (Figur 2G, retad isär äggstock). Se figur 1 och 2H för morfologiska skillnader som kan användas för att särskilja de olika stegen. Att isolera folliklar som är inom intakta ovarioles och fortfarande finns i en muskel slida, använd en nål för att skära över ovariole vid främre av den föregående hårsäcken och vid den bakre delen av hårsäcken omedelbart efter follikeln av intresse. Detta kommer att bryta muskeln manteln och follikel av intresse bort kan nu skäras bort från de angränsande hårsäckarna utan att skada den. Som enskilda stegen separeras, flytta folliklar av intresse, med hjälp av ett glas pipett, till en ny brunn med färskt medium. Detta är särskilt viktigt när man isolerar folliklar för in vitro-utveckling. OBS: Det är viktigt att klämma på pipetten glödlampa innan media att förhindra luftbubblor från att omfördela folliklar av intresse i hela väl. Dessutom, om de folliklar är fast vid glaset pipett pipetten kan förbelagd med 3% bovint serumalbumin (BSA) genom pipettering av BSA-lösningen upp och ner flera gånger och sköljning med dissekera media.
12. När tillräckligt många folliklar har isolerats, fortsätt med efterföljande experiment.

3. In vitro Utveckling av S10B folliklar

1. Isolera S10B folliklar använda scenen isoleringsprotokoll (steg 2) i IVEM medier. Se till att hårsäckarna snabbt flyttas bort från skräp. Eftersom dessa folliklar fortsätter att mogna, är det important att S10Bs uppsamlas efter 30 till 60 min och placerades sedan i mognadsmedier av valet. OBS: S10B måste noga skiljas från S10A folliklar (Figur 1C jämfört med 1B), eftersom S10A folliklar inte förfaller i IVEM odlingsmedier. I både S10A och S10B folliklar är hälften av längden består av sjuksköterska celler och den andra hälften är i äggcellen, men i S10B längden av follikel är lika med den hos S14 folliklar.
2. Med hjälp av en glaspipett, flytta ~ 30 S10B folliklar in i en brunn på en 24-brunnars vävnadsodlingsplatta. OBS: Se till att kontrollera att alla folliklar som överförs är S10B och har inte mognat till S11.
3. Förbered 1 l av mognadsmedier per brunn, dvs IVEM media plus farmakologiska reagenser.
4. Med hjälp av en drog glas pipett *, ta bort så mycket media från brunnen (steg 3.2) som möjligt, och snabbt lägga till mognad media val. OBS: Det är viktigt att använda en drog glas pipette som staged folliklar lätt kan tas upp antingen med glaspipetter eller pipettspetsar med en Pipetman.
   * För att göra drog pipetter: 1) värma den tunna delen av långa glaspipetter i lågan av en bunsenbrännare bara tills glaset börjar mjukna, 2) omedelbart flytta pipetten ur lågan och dra horisontellt för att dra pipetten i en finare rör; 3) bryta för att generera en fin spets. VARNING: Använd ögonskydd som glassplitter kan flyga av.
5. Upprepa steg 3,1-3,4 för så många brunnar som försöket kräver.
6. Låt folliklar utvecklas för> 10 timmar och gör det utvecklande progression under ett dissekera omfattning. OBS: Experiment brukar gjorde nästa dag för att ge tillräcklig tid för hårsäckarna att utvecklas. S10B är ~ 5 timmar, är S11 ~ 30 min, är S12 ~ 2 tim, och S13 är ~ 1 timme i längd vid 25 ° C ¹ och utveckling i rumstemperatur kommer att ta något längre tid. Liknande experiment som beskrivits för S10B folliklar kan varautfördes med användning av S11-S13 folliklar.

4. Steg Isolering för Live avbildning

1. Isolera sent stadium folliklar (S10B-14) som uttrycker fluorescerande markör för val med hjälp av scen isolering protokollet (steg 2) i IVEM medier, som rör sig snabbt folliklar från skräp.
2. Flytta folliklar av intresse i nya medier, och sedan överföra genom glas pipett till en täck botten petriplatta. Var noga med att lägga till media så att det bubblar upp i täckglaset nedre området men inte spilla över.
3. För längre time-lapse filmer, är det ibland nödvändigt att behålla fuktigheten i Petri plattan genom att lägga en hoprullad Kimwipe, fuktad med vatten, för att den inre kanten av Petri plattan. Placera locket på toppen.
4. Bild på ett inverterat mikroskop. Detaljerad upplösning kräver konfokalmikroskopi. Det är nödvändigt att balansera frekvens av avbildning, styrka belysning, och längden på bildbehandling, detta måste självständigt utarbetas för varje lAbeling verktyget och utvecklingsprocess.

5. Steg Isolering för mRNA Förberedelse

1. Isolera individuella stations folliklar med hjälp av scen isolering protokollet (steg 2) med antingen Graces eller IVEM medier.
2. Med hjälp av en glaspipett, flytta de enskilda stegen av intresse i nya brunnar med media, det är möjligt att samla in flera steg på en gång.
3. Håll insamlingstider i 1 timme. Flytta folliklar med användning av en glaspipett, till 1,5 ml mikrofugrör.
4. Centrifugera röret en kort stund i en mini-mikrocentrifug för att pelletera alla folliklar. Med hjälp av en drog glas pipett (se steg 3.4) försiktigt bort alla medier. OBS: Om du använder en full storlek mikro, spinn ner folliklar vid låg hastighet.
5. Tillsätt 100 l av Trizol och slipa för hand för ~ 20 sekunder med hjälp av en plastmortelstöt. Spinn ner vid full hastighet i en mikrocentrifug och flytta Trizol till en ny 1,5 ml mikrofugrör försiktigt så att inte störa någon pellet debris. Förvara vid -80 ° C.
6. Upprepa steg från 5,1 till 5,5 tills tillräckligt folliklar har erhållits för experimentet. Rutinmässigt ~ 75 S10B, ~ 75 S12, och ~ 100 S14 folliklar erhållande ~ 10 mikrogram av RNA.
7. Tina proverna på is. Kombinera prover, i förekommande fall, i ett mikrofugrör och föra Trizol volymen upp till 800 pl. Fortsätt med RNA-isolering enligt anvisningar från tillverkaren. VIKTIGT: Kom ihåg att DNas behandla isolerade RNA med RNas fritt DNas.

6. Steg Isolering för Western blotting

1. Värm ett värmeblock till 100 ° C.
2. Isolera individuella stations folliklar med hjälp av scen isolering protokollet (steg 2) med antingen Graces eller IVEM medier. OBS: Det är nödvändigt att empiriskt bestämma hur många av en viss scen follikelstimulerande behövs för att observera varje specifikt protein. För högt uttryckta proteiner 1-3 S10B folliklar / brunn är nog att se en stark signal på en western blöt. Emellertid är det viktigt att göra enrepresentativt urval, tar folliklar från flera honor. Således är 15-20 folliklar i ett visst skede brukar samlas.
3. Flytta folliklar med användning av en glaspipett, till ett 1,5 ml mikrofugrör. Snurra kort i en mini-mikrocentrifug för att pelletera folliklar (se steg 5.4). Ta försiktigt bort allt material med hjälp av en drog glas pipett (se steg 3.4) och tillsätt 50 pl 1x PBS och 50 pl 2x Laemmli buffert.
4. Grind för hand under ~ 20 sek med en plastmortelstöt. OBS: Plast pestles kan återanvändas för slipning västerländska prover genom tvättning och autoklavering dem.
5. Koka proverna under 10 minuter i värmeblocket.
6. Chill kortvarigt på is och centrifugering vid full hastighet under 15 sekunder i en mikrocentrifug. Antingen omedelbart lasta på en SDS-PAGE-gel eller förvara vid -20 ° C. OBS: Om proverna förvaras, kom ihåg att återkokning proverna innan du lägger på gelen.
7. Utför western blot-analys genom att följa standardprotokoll.

Representative Results

När isolera specifika stadier av Drosophila follikelutveckling är det viktigt att kunna exakt urskilja de olika morfologiska stadier. Detta är något utmanande för S10A och S10B, som sjuksköterskan celler och oocyten vardera tar upp halva längden av follikel på dessa stadier (figur 1B jämfört med 1C). Emellertid S10A folliklar är kortare i längd än S10B folliklar, eftersom S10B folliklar är fullt utsträckt och således samma längd som en S14 follikel (Figur 1C jämfört 1G). Dessutom, en delmängd av follikeln eller somatiska celler över äggcellen kallas centripetala follikelceller börjar migrera mellan sjuksköterskan cellerna och äggcellen på S10B. Under S10B, som tar cirka 5 timmar, sjuksköterskan cellerna genomgår dynamisk aktin ombyggnad så att vid S11 sjuksköterskan celler kontrakt, pressa deras cytoplasma innehåll in i äggcellen. Alltså på S11, har sjuksköterskan cellområdetminskade signifikant medan äggcellen har expanderat (figur 1D). På S12, sjuksköterskan cellerna börjar genomgå döden och ta på ett mer ogenomskinligt utseende (figur 1E), intressant nog, i kultur, sjuksköterska cellrester curl dorsalt i S12 folliklar (se S12s i siffror 3C'-D "). Under S13, är sjuksköterskan cellområdet transparent som celldöd slutförs, och rygg bihang bildning sker (Figur 1F). Genom S14 endast äggcellen och follikeln celler kvar, och rygg bihang bildningen är klar (figur 1G).

Den vitro utvecklingstest på kan användas för att bedöma konsekvenserna av olika farmakologiska behandlingar och genetiska mutationer på S10B utveckling och sjuksköterska cell dumpning (Figur 3). Utvecklingen av S10Bs i kultur är robust, emellertid ett antal faktorer som kan leda till dåliga experimentella resultat. I figur 3Aexperimentella data från både ett framgångsrikt och ett misslyckat experiment tillhandahålls. Ett lyckat experiment är en där 80-100% av vildtyp folliklar i kontrollmedia komplett sjuksköterska cell dumpning och framsteg till S12-14 (figur 3A, vikt 1). Lagom vildtyp kontroller kommer att misslyckas, vilket betyder att färre än 80% av de folliklar utvecklas (figur 3A, vikt-2). Detta fel kan orsakas av ett antal frågor bland annat: 1.) Oförmåga att skilja S10A från S10B folliklar (se figur 1 och 2), 2) mediaproblem (temperatur, ålder, etc), och / eller 3) folliklar var utsättas för skräp för länge.

In vitro-utveckling av S10Bs kan användas i kombination med farmakologisk behandling. För sådana experiment, är det viktigt att drogkontroller, det vill säga behandling av vildtyp folliklar med drogen, utförs med varje experiment eftersom drog effektivitet och / eller koncentreradjon kan förändras med tiden. För farmakologiska experiment, är det lämpligt att analysera förhållandet mellan andelen folliklar utvecklas i läkemedelsbehandling som i kontrollmedia, detta styr för små genetiska bakgrundsskillnader. Det är ofta bra att behandla med IC ₅₀ koncentrationen av läkemedlet, vilket är den koncentration som blockerar 50% av vildtyp (yw) folliklar från att genomgå sjuksköterska cell dumpning och vidareutveckling. . Sålunda är förhållandet för vildtyp folliklar förväntas vara 0,5 (Figur 3B, drog 1) Fig. 3B är ett exempel på hur ett läkemedel (aspirin) kan bli för koncentrerade (läkemedel 2, sannolikt på grund av lösningsmedelsavdunstning) och blocket mer än 50% av vildtyp hårsäckarna från att utvecklas. För att ytterligare illustrera utvecklingen analysen in vitro, är bilder av två brunnar i utvecklings S10B folliklar tillhandahålls. Figurer 3C och D illustrerar S10B folliklar i början avanalys, vid kontroll eller acetylsalicylsyra behandlade (~ 2 mM) medier. Figurerna 3C och D 'illustrerar slutet av analysen, vilket avslöjar att en majoritet av kontroll behandlade folliklar utvecklats till S14, medan majoriteten av aspirin behandlade folliklar inte har färdig sjuksköterska cell dumpning.

Den vitro utvecklingstest på kan också användas för att screena för genetiska bakgrunder som är mer känsliga för ett visst läkemedel. Figur 3E innehåller två exempel på detta. I det första exemplet, den genetiska bakgrunden (expt1, blå bar) misslyckas med att interagera med acetylsalicylsyra som förhållandet förblir ~ 0,5, och omvänt, i det andra exemplet, den genetiska bakgrunden (expt2, röd bar) förbättrar effekten av aspirin. Således kan vitro utvecklingstest på att användas för att fastställa konsekvenserna av mutationer och farmakologiska reagens på de utvecklings-och morfologiska händelser som inträffar under sen oogenes, dessutom, analysen kan användas för att bedöma både farmakologiska och genetiska interaktioner (se ^9).

Steg isolering kan också användas för live-avbildning av utvecklingsprocesser. Figur 4 är ett exempel på en time-lapse-film av en S10B follikelstimulerande uttrycker utrophin-GFP, aktin bindande domänen från human utrophin smält till grönt fluorescerande protein. Med hjälp av denna bildhanteringsverktyg, aktin bunt bildning och kondens kan visualiseras. Många verktyg finns tillgängliga för live-avbildning, inklusive protein fälla transgena linjerna ^16,17, UAS drivs fluorescerande taggade organell markörer (mitokondrier, golgi, endoplasmatiska retiklet, etc.), UAS drivs fluorescerande taggade cytoskelettala markörer (aktin och aktin bindande proteiner, mikrotubuli och mikrotubuli bindande proteiner), transgena linjer som uttrycker något fluorescerande taggade protein av intresse, och vitala färgämnen (Nile Red etiketter neutrala lipider, Edu etiketter replikerande DNA, FM4-64 etiketter membran).

ove_content "> Molekylära analyser kan utföras med isolerade stadier av Drosophila folliklar. För proteinanalys genom western blotting, är det nödvändigt att empiriskt bestämma hur många folliklar, i en viss fas i utvecklingen, är skyldiga att iaktta proteinet av intresse Figur. 5 är ett exempel på hur man i tur och ordning späda en koncentrerad protein lysat för att bestämma antalet S10B folliklar som behövs för att iaktta ett visst protein, Fascin. I det här fallet en S10B follikelstimulerande är tillräckligt att konstatera detta protein med Western blotting.

Figur 1. Diagram som beskriver den cellulära sammansättningen av Drosophila folliklar och bilder som illustrerar den morfologiska skillnaden i mitten till sent stadium Drosophila follicles. A. Diagram som visar den cellulära sammansättningen av en S10A follikelstimulerande. BG. Representativa bilder av S10A-S14 Drosophila folliklar som tagits med en stereo dissekera omfattning. Drosophila follikelstimulerande består av 16 könsceller-härledda celler: 1 äggcell (röd, A) och 15 sjuksköterska eller stödceller (gul, A), som är omgivna av ~ 650 somatiskt-härledda epitelceller (vit, magenta och cyan, A ). På S10A, är halva längden av follikeln bestående av sjuksköterska celler (gul fäste, B), som omfattas av den sträcka follikelceller (magenta i A), och den andra halvan består av äggcellen (röd asterisk , B), som omfattas av de viktigaste kropps follikelceller (vita i A). På S10B, sjuksköterskan cellerna (gul fäste, C) och äggcell (röd asterisk, C) var komponera hälften av length av follikel emellertid den totala längden av follikel är nu lika med den för en S14 follikel (jämför C till G). Under S11, sjuksköterskan cellerna (gul fäste, D) pressa snabbt deras cytoplasmiska innehåll i förlängning äggcellen (röd asterisk, D) i ett aktin / myosin beroende process kallas sjuksköterska cell dumpning. Genom S12 har äggcellen (röd asterisk, E) helt långsträckt som sjuksköterska cell dumpning är komplett och bara sjuksköterska cell rester kvar (gul fäste, E). Den sjuksköterska cellrester (gul fäste, F) komplett celldöd på S13. S14 representerar den fullt mogna follikeln, som är sammansatt av oocyten (röd asterisk, G), somatiska celler, och äggskal, däribland de dorsala bihang (vita pilar, G). B. Scale bar = 0,1 mm.

Figur 2. Bilder som ger en överblick av äggstocken dissektion och follikelstimulerande isolering. A. Sänk farten i dissekera media och rikta den så att den hålls, med tång, i den icke-dominanta handen. B. Använda den dominerande handen, ta tag i nagelbanden på den bakre delen av buken. C. Dra nagelbanden av, utsätta äggstockarna (gul pil). D. Arbeta från den främre av buken mot bakre, försiktigt pressa buken släpper äggstockarna (gul pil). E. Separera äggstockarna (gul pil) från eventuellt kvarvarande nagelband (röd pilspets) och / eller inre organ (vita pilspetsar). F. Överför isolerade äggstockarna till en färsk väl innehåller dissekera media. G. Tease isär äggstockarna, med hjälp dissekera nålar, att utsätta enskildaella folliklar (jämför intakt äggstock (överst) till separerade äggstock (botten). Vita pilspets pekar på en knivhuggen S10B follikelstimulerande, ett exempel på en follikel som inte bör användas för efterföljande experiment. H. Välj de morfologiska stadier av intresse (Scener 10A -14 (S10A-S14) visas).

Figur 3. Exempel på in vitro-utveckling av analyser. A. Diagram över andelen S10B folliklar som fullständig utveckling i kultur. wt 1 är ett exempel på förväntad utveckling av vildtyp S10B folliklar (96% utvecklas), medan wt 2 är ett exempel på dålig utveckling i kultur (68% utveckla). Vi skulle normalt kassera hela experimentet om utvecklingen av vildtyp S10B folliklar i kontroll medier är under 80%. B. 50 för aspirin till procent utveckla i kontrollmedier. _IC50 är den koncentration som blockerar 50% av de S10B folliklar från att utveckla, vilket innebär vildtyp värdet bör vara ~ 0,5. Drug 1 är ett exempel på den förväntade vildtyp-förhållande (0,52), medan drogen 2 är ett exempel på vad som händer när läkemedelskoncentrationen är för stark (0,37). CD ". Bilder av utveckling in vitro brunnar. CC '. Kontroll behandlad. DD '. Aspirin behandlad (~ 2 mM). CD. Bild av S10Bs i början av analysen. C'-D ". Bild av folliklar vid slutpunkten av analysen. Kontroll behandlad S10B folliklar utvecklas till S14s i kultur (C), medan majoriteten av aspirin behandlade folliklar misslyckas med att slutföra sjuksköterska cell dumpning (D '). 50 för aspirin till procent utveckla i kontrollmedier. Det här är ett exempel på två försök söker farmako-interaktioner. Den expt1 (blå stapel) mutant förändrar inte effekten av IC ₅₀ för acetylsalicylsyra (0,57), medan den expt2 (röd stapel) mutant förstärker effekten av acetylsalicylsyra (0,16).

Figur 4. Exempel som visar användningen av isolerade S10B folliklar för live-avbildning. AF. Maximala projektioner av 3 skivor från tidsförlopp z-stackar av en S10B follikelstimulerande isolerats från utrophin :: GFP som uttrycker transgena flugor (sqh-utrophin :: GFP). A'-F ". Förstorade inläggningar markera en enskild sjuksköterska cell från A- F. AF ". F-aktin (utrophin :: GFP), vit. A, A '. Tid (t) = 0 min B, B.'. T = 20 min. C, C '. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min. F, F '. t = 100 min. Vid den initiala tidspunkt kan korta aktinfilament observeras som sträcker sig inåt från sjuksköterska cellmembranen (A, A '). Dessa aktin filament avlånga under de tidiga tidpunkter (BC "jämfört med A, A ') tills de är helt utsträckt (D, D'). Vid senare tidpunkter, är dessa fullständigt långsträckta aktinfilament förkorta sedan och kondensera hela sjuksköterska cell dumpning (EF) A. Scale bar = 50 | im. A '. Scale bar = 10 | im.

_upload/50493/50493fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg "/>
.. Figur 5 Illustration av hur man bestämmer antalet folliklar som behövs för att undersöka ett speciellt protein med western blot-analys Detta är en western blöt som ser Fascin expression i S10B folliklar (01:20, sn 7C Cooley, L.; utvecklingsstudier Hybridoma Bank (DSHB), som utvecklats under ledning av NICHDEN och underhålls av University of Iowa, Biologiska institutionen, Iowa City, IA, 52242). Siffrorna längst upp representerar det ungefärliga antalet S10B folliklar laddade per körfält.

Discussion

The Drosophila follikeln är sammansatt av endast ett fåtal celltyper, vilket gör det idealiskt för både morfologiska och molekylära analyser. Vidare, på grund av strukturen i äggstockarna, är det relativt enkelt att erhålla ett stort antal specifika stadier av follikelutveckling med en gemensam dissektionsmikroskop och minimal utbildning. Som varje steg representerar ett kort tidsfönster, kan steget isolering ge betydande molekylära insikter i de utvecklingsprocesser som sker under det stadiet. Till exempel har vi använt mitten till sent skede follikelstimulerande isolering för att karakterisera genuttryck förändringar som sker under S10B, S12 och S14 ^18. Denna analys tyder på ett antal tidigare uncharacterized gener kommer sannolikt att bidra till follikelutveckling och framför allt, äggskal bildning.

Steg isolering kan ge dramatiska insikter morfologiska händelser via live avbildning. Sådan bildbehandling kan utföras på al l stadier av Drosophila follikelutveckling. Medan fokus i detta arbete är S10B-14, är läsarna hänvisas till följande artiklar för live-avbildning av tidigare stadier: germarium ^13, follikelstimulerande töjning ^19, och scen 9 ^11,12,14. Odlingsbetingelserna som användes i dessa studier skiljer sig från de som diskuteras i detta arbete. Specifikt dessa studier användes Schneiders Insekt medier med varierande nivåer av FBS (2,5 till 15%) såväl som tillägg av insulin ^11-13,19 och, i vissa fall, ytterligare tillsats av trehalos, metopren, 20-hydroxyecdysone och adenosin deamidase ^14. Det är viktigt att påpeka att dessa levande imaging studier väsentligt har avancerat vår förståelse av de händelser som inträffar under dessa tidigare utvecklingsstadier. Dock kan dessa scen folliklar tidiga inte utvecklas hela vägen till slutskedet av utvecklingen av folliklar, S14. Omvänt kommer S10B-13 utvecklas till S14 i kultur.

ove_content "> Under S10B-S14 många morfologiska processer inträffar som kan studeras genom live-avbildning. Exempelvis kan leva avbildning kan användas för att undersöka processen för sjuksköterskan cell dumpning, den process genom vilken sjuksköterska cellerna pressa sina cytoplasmiska innehåll i äggcellen att förse den med allt den behöver för att slutföra embryogenes. Sjuksköterska cell dumpning kan observeras av tidsförlopp avbildning med genomlysning 7 eller genom konfokal avbildning med transgena linjer uttrycker fluorescensmarkörer (se Figur 4). Fortsatt användning av levande avbildning väntas ge nya insikter i cytoskelettala dynamik som behövs för sjuksköterskan cell dumpning. Live-avbildning av senare skeden har också avancerat vår förståelse av rygg bihang primordia migration och tubulogenesis ^10.

In vitro-utveckling av S10B-S13 folliklar kan användas för att definiera effekterna av både farmakologiska reagens och genetiska manipulationer på de processer skerring under denna tid. Vi har använt in vitro utveckla S10B folliklar att fastställa betydelsen av prostaglandiner i reglering sjuksköterska cell dumpning ^7. Därefter har vi använt denna analys för att utföra en farmakologisk-interaktion skärmen, specifikt, har vi testat om förlust av en kopia av en aktin regulator förstärker eller dämpar sjuksköterskan cellen dumpning fel på grund av förlusten av prostaglandiner. Denna skärm har avslöjat ett antal förmodade nedströms mål ⁽⁹ och Spracklen, Meyer, och Tootle, opublicerade data). Analysen kan också användas för att undersöka genetisk interaktion genom att bedöma utvecklingsdefekter, såsom ett block i sjuksköterska cell dumpning, på grund av heterozygositet för två olika faktorer (för ett exempel på detta se ^9).

Medan isolera mitten till sent stadium Drosophila folliklar är en ganska enkel process, det finns ett antal kritiska faktorer för optimal framgång. För det första, är att förbereda flugornamycket viktigt. Det är bäst att hålla olika genotyper av flugor på så lika villkor som möjligt, det vill säga antalet flugor per flaska, förhållandet mellan kvinnor till män (2:1 är perfekt), och ge nya, våt jäst konsekvent. Matningen (våta jäst) och dissektion tiden förändrar förekomsten av de olika utvecklingsstadier. Vi har funnit att när flugorna konsekvent matas på morgonen kan fler S10Bs isoleras på morgonen, medan mer S12s är närvarande på eftermiddagen. En andra kritisk faktor är media. För in vitro-utveckling och Bildproduktion är det viktigt att förbereda färskt IVEM media. Dessutom måste media komma till rumstemperatur så kalla medier kommer att ändra cytoskeletons både aktin och mikrotubuli och därför störa den fortsatta utvecklingen. Det är också viktigt att hålla hårsäckarna borta från skräp. Ibland, under dissektionen kommer tarmen komma ut med äggstockarna. Vi har funnit att om tarmen spräcksoch hårsäckarna hålls i förorenade medier, är det osannolikt att utvecklas i kultur hårsäckarna. Eftersom folliklar fortsätter att utvecklas i kulturen, är det viktigt att Bekräfta igen iscensättningen efter dissektion innan du fortsätter med antingen in vitro utveckling eller molekylära analyser. Slutligen är det viktigt att ha ordentliga kontroller för experimenten. För in vitro-utveckling, är det nödvändigt att använda vildtyp folliklar att testa att media tillåter normal utveckling (80-100% färdigt sjuksköterska cell dumpning), och för att testa att farmakologiska reagens fungerar som förväntat (se figur 3).

Sammanfattningsvis kan isolering av mitten till sent stadium Drosophila folliklar ge betydande insikt i utvecklingsprocesser genom olika experimentella tekniker.

Tabell över specifika reagenser och utrustning:

Reagensets namn	Company	Kattalogue antal	Kommentarer (frivilligt)
Aktiv torrjäst	Genesee Scientific	62-103	Varje källa av aktiv torrjäst är bra
Graces Insect Media	Lonza	04-457F
Värmeinaktiverat fetalt bovint serum	Atlanta Biologicals	S11050H	Alla värmeinaktiverad FBS bör arbeta
10x Pen / Strep	Gibco / Invitrogen	15140-122
Pin Vises och Nålar	Ted Pella, Inc.	13561-10
Spot Plate, Nine Well	Corning	7220-85
# 5 Dumont pincett	Fine Science Tools	11252-20
24 flerbrunnsplattor	Becton Dickinson	35 3226	Alla 24-brunnars vävnadsodlingsskål bör arbeta
Täckglas Bottom Fat (35 mm)	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Cover tjocklek kommer att bero på mikroskopet / målet som används
Glaspipetter	Corning	7095B-5x (för överföring av folliklar) 7095B-9 (för att producera drog pipetter)
Prov mortelstöt (1,5 pl, RNas / DNas gratis)	Research Products International	199228	Varje plastmortelstöt som passar 1,5 pl mikrocentrifugrör kan användas
Trizol	Invitrogen	15596-018

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Active Dry Yeast	Genesee Scientific	62-103	Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media	Lonza	04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S11050H	Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep	Gibco/Invitrogen	15140-122
Pin Vises and Needles	Ted Pella, Inc.	13561-10
Spot Plate, Nine Well	Corning	7220-85
#5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
24 multi-well plates	Becton Dickinson	35 3226	Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm)	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes	Corning	7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes - long	Corning	7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free)	Research Products International	199228	Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol	Invitrogen	15596-018