Summary
Stage-specifik isolering af midten til slutningen af Drosophila follikler er nyttigt for en række forskellige formål. Sådanne follikler udvikler sig i kulturen, som giver mulighed for genetiske og / eller farmakologiske manipulationer at blive koblet med in vitro udvikling assays og direkte billedvisning. Derudover kan follikler anvendes til molekylære undersøgelser, såsom isolering af mRNA og protein.
Abstract
Drosophila oogenesen eller follikel udvikling har været meget anvendt til at fremme forståelsen af komplekse udviklings-og celle biologiske processer. Denne metoder papir beskriver, hvordan at isolere midten til sene stadier af follikler (Stage 10B-14) og bruge dem til at give ny indsigt i de molekylære og morfologiske begivenheder i stramme vinduer i udviklingsmæssig tid. Isolerede follikler kan anvendes til en række forskellige eksperimentelle teknikker, herunder in vitro-udvikling af assays, levende billeddannelse, mRNA-ekspression analyse og Western blot-analyse af proteiner. Hårsække på Stage 10B (S10B) eller senere vil fuldføre udviklingen i kultur, hvilket gør det muligt at kombinere genetiske eller farmakologiske forstyrrelser med in vitro-udvikling for at definere virkningerne af sådanne manipulationer på de processer, der forekommer i bestemte perioder af udvikling. Derudover, fordi disse follikler udvikler sig i kulturen, er de velegnet til levende billeddiagnostiske undersøgelser, Som ofte afslører nye mekanismer, der medierer morfologiske begivenheder. Isolerede follikler kan også anvendes til molekylære analyser. For eksempel kan defineres ændringer i genekspression, som skyldes genetiske forstyrrelser specifikke udviklingsmæssige vinduer. Derudover kan protein niveau, stabilitet og / eller posttranslational modifikation tilstand under en bestemt fase af follikel udvikling undersøges gennem western blot analyser. Således trinspecifik isolering af Drosophila follikler giver en rig kilde til oplysninger i vid udstrækning bevaret processer for udvikling og morfogenese.
Introduction
Hver Drosophila æggestok er sammensat af ~ 16 ovarioles eller kæder af sekventielt modning æg kamre eller hårsække. Hver follikel er sammensat af en enkelt oocyt, 15 kimcelletransformerede afledte sygeplejerske eller bæreceller, og ~ 650 somatiske celler betegnes follikelceller (figur 1A). Drosophila oogenesen er opdelt i 14 morfologisk definerede udviklingstrin 1. Hvert trin af follikeludvikling er observeret mange gange inden for en enkelt flue, hvilket gør det relativt nemt at isolere et betydeligt antal fase-specifikke follikler.
De midten til sene stadier af oogenesen (Stages 10B-14) er særligt velegnet til scenen isolation (Figur 1). Hos Stage 10B (S10B), er folliklen fuldstændigt aflange (dvs. dens længde er lig med en Stage 14 (S14) hårsækken, se figur 1 og figur 2H) og halvdelen af længden af follicle er sammensat af sygeplejerske cellermens den anden halvdel er oocytten (figur 1C). På dette stadium sygeplejerske celler undergår dramatiske actin remodeling, styrkelse af den kortikale actin og skabe parallelle bundter af actin filamenter 2. Samtidig en population af follikelceller, betegnet centripetale celler migrerer mellem sygeplejerske celler og oocytten og to dorsale grupper af follikelceller bliver bestemt til at undergå overgangen til dannelse af de dorsale vedhæng, rørformede respiratoriske apparater til foster 3 . Sygeplejerske celler derefter kontrakt (S11), presse deres cytoplasmatiske indhold i ægget i en proces kaldet sygeplejerske celle dumping, som giver oocyt med de faktorer, der er nødvendige for at fuldføre embryogenese (figur 1D). Sygeplejerske celler undergår derefter celledød (S12-S13) 4 og folliklen celler udskiller og mønster æggeskallen 5 (fig. 1E-G). Således er rig med vigtige udviklingsmæssige en slutningen af oogenesend morfogenetiske processer.
Isolerede midten til sene stadier af follikler (S10B-S14) kan anvendes til en række forskellige formål, herunder molekylære analyser. For eksempel kan mRNA fra trinvis follikler isoleres til RT-PCR, microarray, eller RNA-seq analyser. Dette gør det muligt at se på genekspression inden for en kort udviklingsmæssige vindue, med kun nogle få celletyper til stede, og bestemme, hvordan genekspression ændres ved enten farmakologiske eller genetiske forstyrrelser. Stage isolation kan også bruges til at se på proteiner ved Western blotting. Sådanne analyser er vigtigt, fordi det gør det muligt at kvantificere niveauet af protein-ekspression i vildtype-versus mutanter på bestemte stadier. Mens man kunne bruge immunofluorescens analyser at opnå lignende resultater, kvantificering af fluorescens er mindre robust på grund af de strenge krav, at alle pixels være inden for det lineære område for detektion 6. Derudover kan western blot analyse give andre oplysninger, f.eks ens hvis proteinet posttranslationelt modificeres eller udtrykkes fra en bestemt splejsningsisoform. Isolerede faser kan også anvendes til yderligere rensning af proteiner, herunder subcellulær fraktionering eller coimmunoprecipitation.
Trinspecifik follicle isolation kan også anvendes til in vitro-udvikling af assays 7 og levende billeddannelse 8. Isolerede S10B-S13 follikler vil fortsætte med at udvikle sig til S14 i simple kultur medier (se nedenfor). Det er vigtigt at bemærke, at S10A hårsække vil ikke fremskridt gennem sygeplejerske celle dumping ved hjælp af dyrkningsbetingelser omtales i dette manuskript. Vi har brugt S10B in vitro udvikling assays at definere den rolle af prostaglandiner, både farmakologisk og genetisk, i reguleringen aktin remodellering ved hjælp af sygeplejerske celle dumping og udvikling som udlæsninger 7,9. Ligeledes kan de senere faser af udvikling også være isoleret for at bestemme virkningerne af farmakologiske behandlinger eller genetisk mandipulations på bestemte processer såsom centripetal celle migration, bryst vedhæng migration / dannelse 10 og sygeplejerske celledød. Sådanne analyser kan bruges til at udføre dominerende interaktion skærme eller analyser, for eksempel, mens heterozygositet for mutationer i PXT eller fascin alene har nogen effekt på S10B in vitro udvikling, hårsække fra dobbelt heterozygoter udviser sygeplejerske celle dumping fejl og en blok i udvikling 9.
Derudover, fordi S10B-13 kan udvikle sig i kultur, alle de processer, der sker i løbet af denne tid kan observeres ved levende billeddannelse. En sådan imaging kan udføres blot ved hjælp af transmitteret lys (hvis man kun er interesseret i store ændringer i morfologi), eller med konfokal mikroskopi ved hjælp af transgene fluer, der udtrykker fluorescerende prober eller hårsække farves med levende billeddannelse farvestoffer. Live-billeddannelse bliver brugt til væsentligt at fremme vores forståelse af udviklingsprocesser. Faktisk bor imaging sene hårsække har udvidet kendskab til dorsale vedhæng migration, et eksempel på tubulogenesis 10. Vi forventer, at billeddannelse af yderligere sene processer, herunder aktin dynamik under sygeplejerske celle dumping, vil give nye indsigter i disse udviklingsmæssige begivenheder. Det er vigtigt at bemærke, at mens S10A og tidlige stadier af follikel udvikling ikke vil fortsætte med at udvikle sig til en S14 i kultur, er mulig levende billeddannelse af begivenheder i løbet af disse faser af udvikling ved hjælp af alternative dyrkningsbetingelser 11-14 (se Diskussion om mere information).
Her giver vi detaljerede protokoller til isolering sene hårsække for enten in vitro udvikling og leve-imaging, eller molekylære analyser (mRNA og protein isolation).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Forberedelse Drosophila Forud for fase Isolation
- Gør våd gær pasta ved at kombinere 50 g tørgær med 90 ml destilleret vand. Bland med en spatel til at kombinere. Lad blandingen stå i ~ 30 minutter før vurderingen konsistens. Konsistensen skal være lige tyk nok til at holde sig til den side af en flue hætteglas, men ikke køre ned langs siden. For at opnå den ønskede konsistens, kan det være nødvendigt at tilsætte op til 10 ml yderligere vand eller en lille mængde af tørgær. Opbevar i en overdækket beholder ved 4 ° C. Den lagrede gær kan anvendes til ~ 1-2 uger.
- Saml <24 timers gamle voksne fluer (både mænd og kvinder) af de ønskede genotyper og sætte dem ind i et hætteglas med flue mad plus våd gær pasta smurt på siden af hætteglasset. Den temperatur, ved hvilken fluer holdes vil variere afhængigt af forsøget. Til rutinemæssige eksperimenter er fluer holdes ved stuetemperatur. Der henviser til forsøg, hvor et gen erbliver overudtrykt vha. UAS/GAL4 systemet 15 maj kræve opretholdelse af fluer ved 25 ° C eller højere, alt efter omstændighederne.
- Give fluer med en frisk udstrygning af gær pasta dagligt i 2 dage. BEMÆRK: Som follikeludvikling er stramt reguleret af ernæringstilstand kvindelige flue, er det vigtigt at give fluen med den næringsrige gær pasta mindst 36 hr før dissektion.
2. Isolating Mid-til-sen Iscenesat Drosophila Follikler
- At medierne til at komme til stuetemperatur (~ 30 min.) Hvis trinvis follikler skal anvendes til in vitro-udvikling af assays forberede frisk IVEM medier (Graces insekt medier, 10% varmeinaktiveret kalvefosterserum og 1x penicillin / streptomycin). Hvis trinvis follikler vil blive anvendt til mRNA eller protein isolation bruge enten Graces insekt eller IVEM medier. VIGTIGT: Medier temperatur er kritisk. Hvis mediet er koldt det vil ændrebåde actin og mikrotubuli cytoskeletons og blokere udvikling.
- Bedøver fluerne i yeasted hætteglas ved at injicere CO 2-gas og placere 3-5 kvindelige fluer på en flue pad under CO 2. VIGTIGT: Lad ikke flere kvinder, end der kan dissekeret i en 10 min periode på flue pad som udvidet eksponering for CO 2 kan forårsage sterilitet og død.
- Fyld en brønd af en 9-spot plade med medier og placere den på toppen af en mørk overflade (et stykke sort plexiglas fungerer godt). Fokusere dissektionsmikroskop på bunden af brønden.
- Brug # 5 Dumont pincet afhente en enkelt kvinde med den ene hånd (dette gøres bedst ved hjælp af den dominerende hånd). Det er ofte nemmest at afhente den kvindelige af vinger, ben eller thorax til maven overgang. Sænk den kvindelige i medierne fyldt godt. Justere fokus af mikroskopet er nødvendigt.
- Ved hjælp af en anden tang holdes i nondominant side få hunnen ved den forreste ende af mavensåledes at den bageste ende er placeret mod den dominerende hånd (figur 2A). Sørg for at holde fluen nedsænket i medierne.
- Med den dominerende hånd, bruge pincet til at gribe neglebånd på den 2. mest posteriore pigmenteret segment og rippe den væk fra resten af maven (figur 2B-C).
- Brug pincet i den dominerende hånd, forsigtigt klemme den forreste ende af maven indtil æggestokkene dukke (figur 2D-E). Hvis det er nødvendigt at placere tangen mellem de to æggestokke og trække dem ud af slagtekroppen.
- Enten flytter æggestokkene til en ny brønd med frisk medier (figur 2F) eller fjerne kroppen til en Kimwipe eller køkkenrulle. Dette er især vigtigt, hvis follikler bliver isoleret til in vitro-udvikling.
- Gentag indtil 3-5 par af æggestokke er blevet isoleret. BEMÆRK: Hver æggestok er sammensat af ~ 16 ovarioles eller kæder af sekventielt modning hårsække. Hver ovarioleer indeholdt i en muskel kappe.
- Brug pin Kortfilm og nåle, der følger med dem, forsigtigt trække fra hinanden æggestokken ved at køre nåle mellem ovarioles (figur 2G). Dette vil undertiden frigive de enkelte hårsække samt.
- Individuelle ovarioles og lette at skelne morfologiske stadier af follikel udvikling bør nu være synlig (figur 2G, drillet hinanden æggestok). Der henvises til figur 1 og 2H til morfologiske forskelle, der kan bruges til at skelne mellem de forskellige faser. At isolere hårsække, der er inden intakte ovarioles og stadig indeholdt i en muskel kappe, skal du bruge en nål til at skære på tværs af ovariole ved den forreste af de foregående follicle og ved den bageste af hårsækken umiddelbart efter follikel interesse. Dette vil bryde muskel kappe og hårsækken af interesse væk kan nu skæres bort fra de tilstødende hårsække uden at beskadige det. Som enkelte trin er adskilt, flytte hårsække af interesse, ved hjælp af et glas pipette til et nyt godt med friske medier. Dette er især vigtigt, når isolering follikler til in vitro udvikling. BEMÆRK: Det er vigtigt at klem pipetten pære før ind medierne til at forhindre luftbobler omfordele hårsække af interesse i hele godt. Desuden, hvis folliklerne klistrer til glaspipette pipetten kan præovertrukket med 3% bovint serumalbumin (BSA) ved pipettering BSA-opløsningen op og ned flere gange og skylning med dissekere medier.
- Når tilstrækkeligt hårsække er blevet isoleret, fortsæt med efterfølgende eksperimenter.
3. In vitro Udvikling af S10B Follikler
- Isoler S10B follikler ved hjælp af fase isolation protokollen (trin 2) i IVEM medier. Sørg for, at hårsække hurtigt flyttes væk fra snavs. Da disse follikler vil fortsætte med at modne, er det important at S10Bs indsamles i 30-60 minutter og derefter anbragt i modning medier valg. BEMÆRK: S10B skal nøje skelnes fra S10A follikler (Figur 1C forhold til 1B), da S10A hårsække ikke vil modnes i IVEM kultur medier. I både S10A og S10B hårsække, er halvdelen af længden bestående af sygeplejerske celler og den anden halvdel er i ægget, men i S10B længden af follicle er lig med den af S14 hårsække.
- Ved hjælp af en glaspipette flytte ~ 30 S10B follikler i en brønd på en 24-brønds vævskulturplade. BEMÆRK: Sørg for at kontrollere, at alle de hårsække der overføres er S10B og har ikke modnet til S11.
- Forbered 1 ml af modning medier per brønd, dvs IVEM medier plus farmakologiske reagenser.
- Ved hjælp af en trak glaspipette *, fjerne så meget medier fra brønden (trin 3.2) som muligt, og hurtigt at tilføje modning medier valg. BEMÆRK: Det er vigtigt at bruge en trukket glas pipette som iscenesatte hårsække kan let tages op med enten glas pipetter eller pipettespidser med en Pipetman.
* For at gøre trukket pipetter: 1) opvarmning af tynde del af lange, glaspipetter i flammen fra en bunsenbrænder lige indtil glasset begynder at blødgøre, 2) straks flytte pipetten ud af flammen og træk vandret for at trække pipette en finere rør, 3) at bryde for at generere en fin spids. ADVARSEL: Brug beskyttelsesbriller som fragmenter af glas kan flyve væk. - Gentag trin 3,1-3,4 for så mange brønde, som kræver eksperimentet.
- Tillad hårsække til at udvikle til> 10 timer og score den udviklingsmæssige progression under et dissekere omfang. BEMÆRK: Forsøg normalt scoret det næste dag for at give tilstrækkelig tid til hårsække til at udvikle sig. S10B er ~ 5 timer, S11 er ~ 30 min S12 er ~ 2 timer, og S13 er ~ 1 time i varighed ved 25 ° C 1 og udvikling ved stuetemperatur vil tage lidt længere tid. Lignende forsøg, der er beskrevet for S10B hårsække kan væreudføres ved hjælp af S11-S13 hårsække.
4.. Stage Isolation til Live Imaging
- Isoler sene follikler (S10B-14) udtrykker det fluorescerende markør af valg ved hjælp scenen isolation protokol (trin 2) i IVEM medier, bevæger sig hurtigt follikler væk fra snavs.
- Flyt hårsække af interesse i nye medier og derefter overføre med glaspipette til et dækglas bund Petri plade. Vær omhyggelig med at tilføje medier, så det bobler op i dækglasset bunden område, men ikke afsmittende.
- For længere time-lapse film, er det nogle gange nødvendigt at opretholde fugtigheden i Petri pladen ved at tilføje en sammenrullet Kimwipe, fugtet med vand, til den indvendige kant af Petri pladen. Sæt låg på toppen.
- Billedet på et inverteret mikroskop. Detaljeret opløsning vil kræve konfokal mikroskopi. Det er nødvendigt at skabe balance mellem hyppigheden af billedbehandling, styrken af belysning, og længden af billedbehandling, og dette vil være nødvendigt at selvstændigt arbejdede for hver labeling værktøj og udviklingsproces.
5.. Stage Isolation for mRNA Forberedelse
- Isolere enkelte fase hårsække hjælp scenen isolation protokol (trin 2) med enten Graces eller IVEM medier.
- Ved hjælp af en glaspipette flytte de enkelte faser af interesse i nye brønde med medier, er det muligt at samle flere trin på en gang.
- Hold indsamling gange under 1 time. Flyt follikler under anvendelse af en glaspipette til 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Spin røret kortvarigt i en mini-mikrocentrifuge for at pelletere alle follikler. Ved hjælp af en trukket glas pipette (se trin 3.4) forsigtigt fjerne alle medier. BEMÆRK: Hvis du bruger en fuld størrelse mikrocentrifuge, spin ned hårsække ved lav hastighed.
- Tilsæt 100 pi af Trizol og male i hånden for ~ 20 sek med en plastik pistil. Spin ned ved fuld hastighed i en mikrocentrifuge og flytte Trizol til et nyt 1,5 ml mikrofugeglas være omhyggelig med ikke at forstyrre nogen pelleteret debris. Opbevar ved -80 ° C.
- Gentag trin 5,1-5,5 indtil nok hårsække er opnået til eksperimentet. Rutinemæssigt ~ 75 S10B, ~ 75 S12, og ~ 100 S14 follikler give ~ 10 ug RNA.
- Optø prøverne på is. Kombiner prøver, som er relevant, i én mikrofugerør og bringe Trizol volumen op til 800 ul. Fortsæt med RNA isolation som anvist af producenten. VIGTIGT: Husk at DNase behandle isolerede RNA med RNase fri DNase.
6.. Stage Isolation for Western blotting
- Forvarm en varmeblok til 100 ° C.
- Isolere enkelte fase hårsække hjælp scenen isolation protokol (trin 2) med enten Graces eller IVEM medier. BEMÆRK: Det er nødvendigt at empirisk bestemme, hvor mange af en bestemt fase follicle er nødvendige for at overholde hvert specifikt protein. For højt udtrykte proteiner 1-3 S10B hårsække / vel er nok til at se et stærkt signal på en western blot. Men det er vigtigt atrepræsentativ prøve, der tager hårsække fra flere hunner. Således er 15-20 hårsække af en bestemt fase indsamles normalt.
- Flyt follikler ved hjælp af en glas pipette til et 1,5 ml mikrofugerør. Spin kortvarigt i en mini-mikrocentrifuge for at pelletere follikler (se trin 5.4). Fjern omhyggeligt alt medierne ved hjælp af en forstrakt glaspipette (se trin 3.4), og der tilsættes 50 pi 1x PBS og 50 ul 2x Laemmli buffer.
- Grind med hånden for ~ 20 sek med en plastik pistil. BEMÆRK: Plastic pestles kan genbruges til slibning vestlige prøver ved vask og autoklavering dem.
- Kog prøverne i 10 minutter i varmeblok.
- Chill kortvarigt på is og centrifugering ved fuld hastighed i 15 sekunder i en mikrocentrifuge. Enten umiddelbart indlæse på en SDS-PAGE gel eller opbevares ved -20 ° C. BEMÆRK: Hvis de opbevares, så husk at reboil prøverne før de anbringes på gelen.
- Udfør Western blot-analyse efter standardprotokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når isolere bestemte stadier af Drosophila follikel udvikling er det vigtigt at være i stand til præcist at skelne mellem de forskellige morfologiske stadier. Dette er noget udfordrende for S10A og S10B, som sygeplejerske celler og oocytten hver optager halvdelen af længden af follikel på disse stadier (figur 1B i forhold til 1C). Men S10A follikler er kortere i længden end S10B follikler, som S10B follikler er fuldt aflange og dermed ens i længde til en S14 follikel (figur 1C forhold til 1G). Derudover en delmængde af folliklen eller somatiske celler i oocytten kaldet centripetale follikelceller begynder at migrere mellem sygeplejerske celler og oocytten ved S10B. Under S10B, der tager ~ 5 timer sygeplejersken celler undergår dynamiske actin remodeling så på S11 sygeplejerskens celler kontrakt, presse deres cytoplasmatiske indhold i oocyt. Således på S11, sygeplejersken celle regionen harfaldt betydeligt, mens ægget er steget (figur 1D). På S12, begynder sygeplejerske celler til at gennemgå døden og tage på en mere uigennemsigtig fremtoning (Figur 1E), interessant, i kultur, sygeplejerske celle rester krøller dorsalt i S12 follikler (se S12s i figur 3C'-D "). Under S13, sygeplejersken celle region er gennemsigtig som celledød bliver afsluttet, og dorsal vedhængsdannelse forekommer (figur 1F). Ved S14 kun ægget og folliklen celler forbliver, og dorsal vedhængsdannelse er færdig (Figur 1G).
In vitro udvikling assay kan anvendes til at vurdere konsekvenserne af forskellige farmakologiske behandlinger og genetiske mutationer på S10B udvikling og sygeplejerske celle dumping (Figur 3). Udviklingen af S10Bs i kultur er robust, men en række faktorer kan føre til dårlige eksperimentelle resultater. I figur 3A,eksperimentelle data fra både en vellykket og et mislykket forsøg er forudsat. En vellykket eksperiment er et, hvor 80-100% af vildtype follikler i kontrol medier komplet sygeplejerske celle dumping og fremskridt til S12-14 (figur 3A, vægt 1). Lejlighedsvis vildtype-kontroller vil mislykkes, hvilket betyder, at færre end 80% af folliklerne (figur 3A, vægt 2). Denne fejl kan være forårsaget af en række emner, herunder: 1). Manglende evne til at skelne S10A fra S10B follikler (se figur 1 og 2), 2) problemer med medierne (temperatur, alder osv.), og / eller 3) follikler var udsat for vragrester for længe.
In vitro-udviklingen af S10Bs kan anvendes i kombination med farmakologisk behandling. For sådanne eksperimenter, er det vigtigt, at kontrollen narkotika, nemlig behandling af vildtype-follikler med stoffet, udføres med hvert eksperiment, fordi stoffet effektivitet og / eller concentration kan ændre sig med tiden. For farmakologiske eksperimenter, er det praktisk at analysere forholdet mellem den procentdel af follikler udvikler i medicinsk behandling for at i kontrol medier dette styrer for små genetiske baggrund forskelle. Det er ofte nyttigt at behandle med IC50 koncentrationen af lægemidlet, og dette er den koncentration, der blokerer 50% af vildtype (yw) follikler fra undergår sygeplejerske celle dumping og yderligere udvikling. . Således er forholdet for vildtype-follikler forventes at være 0,5 (figur 3B, narkotika 1) Figur 3B er et eksempel på, hvordan et lægemiddel (aspirin) kan blive for koncentreret (lægemiddel 2, sandsynligvis på grund af afdampning af opløsningsmiddel) og blokere mere end 50% af de vildtype hårsække fra udviklingslande. For yderligere at illustrere udviklingen in vitro assay, er billeder af to brønde i udviklingslandene S10B follikler billede. 3C og D illustrerer S10B follikler i begyndelsen afassay i kontrol-eller aspirin behandlede (~ 2 mM) medier. figur 3C 'og D' illustrerer enden af assayet, afslører, at de fleste af kontrol behandlede follikler udviklet til S14, mens størstedelen af aspirin behandlede follikler ikke udfyldt sygeplejerske celle dumping.
In vitro udvikling analyse kan også anvendes til screening for genetiske baggrunde, som er mere følsomme over for et bestemt lægemiddel. Figur 3E indeholder to eksempler herpå. I det første eksempel, den genetiske baggrund (expt1, blå bar) undlader at interagere med aspirin som forholdet forbliver ~ 0,5; omvendt, i det andet eksempel, den genetiske baggrund (expt2, rød bar) øger virkningen af aspirin. Således kan in vitro-udvikling-assay anvendes til at definere konsekvenserne af mutationer og farmakologiske reagenser om de udviklingsmæssige og morfologiske begivenheder i sene oogenesen, derudover assayet kan bruges til at vurdere både farmakologiske og genetiske interaktioner (se 9).
Stage isolation kan også bruges til billeddannelse af udviklingsprocesser. Figur 4 er et eksempel på en time-lapse film af en S10B follikel udtrykker Utrophin-GFP, actinbindings domæne fra human Utrophin fusioneret med grønt fluorescerende protein. Ved hjælp af denne billedbehandling værktøj actin bundt dannelse og kondens kan visualiseres. Mange værktøjer er tilgængelige for levende billeddannelse, herunder protein fælde transgene linier 16,17, UAS kørt fluorescens mærkede organel markører (mitokondrier og Golgi endoplasmatiske reticulum, osv.), UAS kørt fluorescens mærkede cytoskeletal markører (actin og actin-bindende proteiner, mikrotubuli og mikrotubuli bindende proteiner), transgene linier udtrykker nogen fluorescens mærkede protein af interesse, og vitale farvestoffer (nilrødt etiketter neutrale lipider, Edu etiketter replikerende DNA, FM4-64 etiketter membraner).
ove_content "> Molekylære analyser kan udføres ved hjælp af isolerede stadier af Drosophila hårsække. For protein analyse ved western blotting, er det nødvendigt at empirisk bestemme, hvor mange hårsække, af en bestemt fase af udviklingen, er forpligtet til at overholde protein af interesse. Figur 5. er et eksempel på, hvordan man sekventielt fortynde en koncentreret proteinlysat at bestemme antallet af S10B follikler er nødvendige for at overholde et bestemt protein, fascin. I dette tilfælde en S10B follicle er tilstrækkelig til at iagttage dette protein ved western blotting.
Figur 1.. Diagram der beskriver den cellulære sammensætning af Drosophila hårsække og billeder, der illustrerer den morfologiske forskel på midten til sent Drosophila follicles. A. Diagram skildrer den cellulære sammensætning af en S10A follicle. BG. Repræsentative billeder af S10A-S14 Drosophila follikler taget ved hjælp af et stereo dissekere omfang. Drosophila-follikel består af 16 kimcellelinje-afledte celler: 1 oocyt (rød, A) og 15 sygeplejerske eller bæreceller (gul, A), som er omgivet af ~ 650 somatisk-afledte epitelceller (hvid, magenta og cyan, A ). Hos S10A, er den ene halvdel af længden af hårsækken bestående af sygeplejerske celler (gul beslag, b), som er omfattet af stretch follikelceller (magenta i A), og den anden halvdel består af oocyt (rød stjerne , B), der er omfattet af de vigtigste organ follikelceller (hvide i A). Hos S10B, sygeplejerske-celler (gul beslag, c) og oocyt (rød stjerne, C) hver komponere halvdelen af length af hårsækken, men den samlede længde af follicle er nu den samme som en S14 follikel (sammenlign C til G). Under S11, sygeplejerske-celler (gul beslag, D) hurtigt presse deres cytoplasmatiske indhold i forlængede ægcelle (rød stjerne, D) i en actin / myosin-afhængig proces betegnes sygeplejerske celle dumping. Af S12 har oocyt (rød stjerne, E) helt aflange som sygeplejerske celle dumping er komplette og kun sygeplejerske celle rester forbliver (gul beslag, E). Sygeplejersken celle rester (gul beslag, F) komplet celledød på S13. S14 repræsenterer den fuldt modne follikel, som er sammensat af oocytten (rød stjerne, G), somatiske celler, og æggeskal, herunder dorsale vedhæng (hvide pile, G). B. Scale bar = 0.1 mm.
Figur 2.. Images giver et overblik over æggestok dissektion og follicle isolation. A. Nedsænkes fluen i dissekere medierne og orientere det, så det holdes ved pincet, i nondominant hånd. B. Brug den dominerende hånd, tag fat i neglebånd ved den bageste af maven. C. Træk neglebånd slukket, udsætter æggestokkene (gul pil). D. Arbejde fra den forreste af maven mod den bageste, forsigtigt klemme maven frigiver æggestokkene (gul pil). E. Adskil æggestokkene (gul pil) fra enhver resterende neglebånd (rød pilespids) og / eller indre organer (hvide pilespidser). F. Overfør isolerede æggestokke til en frisk godt indeholdende dissekere medier. G. drille hinanden æggestokkene, ved hjælp af dissekere nåle, at eksponere indiduelle follikler (sammenligne intakt æggestok (øverst) til separeret æggestok (nederst). White pilespids peger på en stukket S10B follicle, et eksempel på en follikel, som ikke bør anvendes til efterfølgende eksperimenter. H. Vælg morfologiske stadier af interesse (trin 10A -14 (S10A-S14), vist).
Fig. 3. Eksempler på in vitro-udvikling af assays. A. Diagram af den procentdel af S10B hårsække, der fuldstændig udvikling i kultur. vægt 1 er et eksempel på forventede udvikling af vildtype-S10B follikler (96% udviklingslande), mens vægt-2 er et eksempel på dårlig udvikling i kultur (68% udvikle). Vi vil typisk kassere hele eksperimentet, hvis udviklingen af vildtype-S10B follikler i kontrol medier er under 80%. B. 50 for aspirin til den procentdel udvikler sig i kontrol-medier. IC 50 er den koncentration, der blokerer 50% af S10B hårsække fra udviklingslandene, hvilket betyder vildtype-værdi skal være ~ 0.5. Drug 1 er et eksempel på den forventede vildtype-forhold (0,52), mens stoffet 2 er et eksempel på, hvad der sker, når lægemiddelkoncentrationen er for stærk (0,37). CD. Billeder af in vitro-udvikling af brønde. CC '. Kontrol behandles. DD. Aspirin behandlede (~ 2 mM). cd. Billede af S10Bs ved begyndelsen af assayet. C'-D '. Billede af folliklerne ved slutpunktet af assayet. Kontrol behandlet S10B follikler udvikler til S14s i kultur (C '), mens størstedelen af aspirin behandlede follikler undlader at fuldføre sygeplejerske celle dumping (D').
Figur 4.. Eksempel på brug af isolerede S10B follikler for levende billeddannelse. AF. Maksimale fremskrivninger af 3 skiver fra time-lapse z-stakke af en S10B follikel isoleret fra Utrophin :: GFP udtrykker transgene fluer (sqh-Utrophin :: GFP). A'-F '. Forstørrede mellemværker fremhæve en enkelt sygeplejerske celle fra A- F. AF '. F-actin (Utrophin :: GFP), hvid. A, A'. Tid (t) = 0 min. B, B '. T = 20 min. C, C'. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min. F, F '. t = 100 min. I den indledende tidspunkt kan korte actinfilamenter observeres indad fra sygeplejersken cellemembraner (A, A '). Disse actinfilamenter langstrakt hele den tidlige tidspunkter (BC 'i forhold til A, A'), indtil de er fuldt aflange (D, D '). I senere tidspunkter, disse fuldt aflange actinfilamenter derefter forkorte og kondensere hele sygeplejerske celle dumping (EF) A. Scale bar = 50 mM. A '. Skala bar = 10 um.
_upload/50493/50493fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg "/>
.. Figur 5 Illustration af, hvordan man kan bestemme antallet af follikler, der er nødvendige for at undersøge et bestemt protein ved western blot analyse Dette er en western blot kigge på fascin udtryk i S10B follikler (1:20 sn 7C, Cooley, L.; Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), der er udviklet i regi af NICHD og vedligeholdes af University of Iowa, Biologisk Institut, Iowa City, IA, 52242). Numrene på tværs af top repræsenterer det omtrentlige antal S10B follikler indlæst per vognbane.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Drosophila-follikel består af kun et lille antal af celletyper, hvilket gør den ideel til både morfologiske og molekylære analyser. På grund af strukturen af æggestokkene, er det relativt let at opnå et stort antal specifikke stadier af follikeludvikling med et fælles dissekere omfang og minimal træning. Som hvert trin udgør en kort tidsmæssig vindue, kan fase isolation give betydelige molekylære indsigt i de udviklingsmæssige processer, der foregår i løbet af denne fase. For eksempel har vi brugt midten til sent follicle isolation at karakterisere genekspression forandringer i løbet af S10B, S12 og S14 18. Denne analyse tyder på en række tidligere karakteriserede gener er sandsynligvis bidrage til follikel udvikling og især, æggeskal formation.
Stage isolation kan give dramatiske indsigt i morfologiske events via live billedbehandling. En sådan imaging kan udføres på al l stadier af Drosophila follikeludvikling. Mens fokus i dette arbejde er S10B-14, er læserne henvises til følgende artikler til levende billeddannelse af tidligere stadier: germarium 13, follikelstimulerende forlængelsesegenskaberne 19, og scene 9 11,12,14. De dyrkningsbetingelser anvendes i disse undersøgelser, adskiller sig fra dem, der diskuteres i dette arbejde. Specifikt anvendes disse undersøgelser Schneiders Insect medier med varierende niveauer af FBS (2,5-15%), samt tilsætning af insulin 11-13,19, og i nogle tilfælde yderligere tilsætning af trehalose, methopren, 20-hydroxyecdysone og adenosin deamidase 14. Det er vigtigt at påpege, at disse levende billeddiagnostiske undersøgelser markant har avancerede vores forståelse af de begivenheder, der opstår under disse tidligere faser af udvikling. Dog kan disse fase hårsække tidlige ikke fremskridt hele vejen til den sidste fase af follikel udvikling, S14. Omvendt vil S10B-13 udvikle sig til S14 i kultur.
ove_content "> Under S10B-S14 mange morfologiske processer forekommer der kan studeres ved billeddannelse. For eksempel kan billeddannelse bruges til at undersøge processen for sygeplejerske celle dumping, den proces, hvorved sygeplejerske cellerne presse deres cytoplasmatiske indhold i oocyt at give den alt, hvad den har brug for til at fuldføre embryogenese. Sygeplejerske celle dumping kan observeres ved time-lapse imaging ved hjælp af transmitteret lys 7 eller ved konfokal billedbehandling hjælp transgene linier, der udtrykker fluorescerende markører (se figur 4). Fortsat brug af levende billeddannelse forventes at giver nye indsigter i cytoskeletal dynamik der er nødvendige for sygeplejerske celle dumping. Lev-imaging af senere faser har også avancerede vores forståelse af dorsal vedhæng primordier migration og tubulogenesis 10.In vitro udvikling af S10B-S13 hårsække kan bruges til at definere virkningerne af både farmakologiske reagenser og genetiske manipulationer på processer forekommerring i løbet af denne tid. Vi har anvendt in vitro udviklingen af S10B follikler at etablere rolle af prostaglandiner i reguleringen sygeplejerske celle dumping 7. Efterfølgende har vi brugt denne analyse til at udføre en farmakologisk interaktion skærm, specifikt har vi testet, om tab af én kopi af et actin regulator forstærker eller undertrykker sygeplejerske celle dumping fejl, der skyldes tab af prostaglandiner. Denne skærm har afsløret en række formodede downstream mål (9 og Spracklen, Meyer og Tootle, upublicerede data). Assayet kan også anvendes til at undersøge genetiske interaktioner ved at vurdere udviklingsmæssige defekter, såsom en blok i sygeplejerske celle dumping, på grund af heterozygositet for to forskellige faktorer (for et eksempel på denne se 9).
Mens isolere midten til sent Drosophila hårsække er en forholdsvis simpel proces, er der en række kritiske faktorer for optimal succes. Først, udarbejdelse af fluerne ermeget vigtigt. Det er bedst at opretholde forskellige genotyper af fluer i så ens en tilstand som muligt, dvs antallet af fluer per hætteglas, forholdet mellem kvinder til mænd (2:1 ratio er ideel), og sørg for frisk, våd gær konsekvent. Fodring (våd gær) og dissektion tiden vil ændre udbredelsen af de forskellige stadier af udvikling. Vi har fundet, at når fluerne konsekvent fodret i morgen kan flere S10Bs isoleres om morgenen, mens mere S12s er til stede i eftermiddag. En anden afgørende faktor er medierne. Til in vitro udvikling og live billedbehandling er det vigtigt at forberede frisk IVEM medier. Desuden skal mediet at komme til stuetemperatur kolde medier vil ændre cytoskeletons både actin og mikrotubuli, og derfor forstyrrer yderligere udvikling. Det er også vigtigt at holde follikler væk fra snavs. Undertiden under dissektion, vil tarmen kommer ud med æggestokkene. Vi har fundet, at hvis tarmen brydesog hårsække holdes i det forurenede medier, er det usandsynligt, at udvikle sig i kultur hårsække. Som hårsække fortsætter med at udvikle sig i kultur, er det vigtigt at genbekræfte iscenesættelsen efter dissektionen før du fortsætter med enten in vitro udvikling eller molekylære analyser. Endelig er det vigtigt at have en ordentlig kontrol til forsøgene. Til in vitro udvikling, er det nødvendigt at bruge vildtype-hårsække til at teste, at medierne giver mulighed for en normal udvikling (80-100% gennemført sygeplejerske celle dumping), og at teste, at farmakologiske reagenser fungerer som forventet (se figur 3).
Som konklusion kan isolering af midten til sent Drosophila hårsække give betydelig indsigt i udviklingsprocesser gennem en række eksperimentelle teknikker.
Tabel over specifikke reagenser og udstyr:
| Reagensets navn | Firma | Catalogue nummer | Kommentarer (valgfrit) |
|---|---|---|---|
| Tørgær | Genesee Scientific | 62-103 | Enhver kilde tørgær er fint |
| Graces Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Varmeinaktiveret føtalt bovint serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Enhver varmeinaktiveret FBS bør arbejde |
| 10x Pen / Strep | Gibco / Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises og nåle | Ted Pella, Inc. | 13.561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| # 5 Dumont pincet | Fin Science Tools | 11.252-20 | |
| 24 multi-brønds plader | Becton Dickinson | 35 3226 | Enhver 24-brønds vævsdyrkningsskål bør arbejde |
| Dækglas Bottom Retter (35 mm) | Mattek Corporation | P35G-1.0-14-C | Dækglas tykkelse vil afhænge af mikroskopet / mål anvendes |
| Glaspipetter | Corning | 7095B-5x (til overførsel af follikler) 7095B-9 (til fremstilling trukket pipetter) | |
| Prøve pistil (1,5 pi, RNase / DNase gratis) | Research Products International | 199.228 | Enhver plast pistil, der passer til 1,5 gl mikrocentrifugerør kan bruges |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Thomas Lecuit (sqh-Utrophin :: GFP linje), Bloomington Stock Center og Developmental Studies Hybridoma Bank for reagenser. Vi mener desuden takke alle medlemmer af Tootle Lab for nyttige diskussioner og kritik af manuskriptet. Finansiering fra National Science Foundation MCB-1158527, og startfonde fra Anatomi og Cellebiologi Institut, University of Iowa støttet dette arbejde. National Institutes of Health Predoctoral Training Grant i Farmakologisk Sciences T32GM067795 støttede AJS. Datalagring støtte blev givet af IKT, der er finansieret gennem CTSA støttet af National Center for Forskning Ressourcer og National Center for Fremme Translationelle Sciences, National Institutes of Health, gennem Grant UL1RR024979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
- Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).
- Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
- Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
- McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
- Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
- Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
- Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
- Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
- Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
- Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
- Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
- Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
- Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
- Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
- Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).
