Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף Published: December 2, 2013 doi: 10.3791/50493
Automatic Translation
1, 1
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Iowa Carver College of Medicine

Summary

בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף שימושי למגוון מטרות. זקיקים כזה מתפתחים בתרבות, המאפשרת למניפולציות גנטיות ו / או תרופתיות כדי להיות יחד עם מבחני חוץ גופיית פיתוח והדמיה לחיות. בנוסף, זקיקים יכולים לשמש למחקרים מולקולריים, כגון בידוד mRNA וחלבון.

Abstract

oogenesis דרוזופילה או התפתחות זקיק כבר בשימוש נרחב על מנת לקדם את ההבנה של תהליכים ביולוגיים התפתחותית ותא מורכבים. נייר שיטות זה מתאר כיצד לבודד זקיקי האמצע לסוף שלב (שלב 10B-14) ולנצל אותם על מנת לספק תובנות חדשות על האירועים המולקולריים ומורפולוגיים המתרחשים במהלך חלונות הדוקים של זמן התפתחותי. זקיקים מבודדים יכולים לשמש למגוון רחב של טכניקות ניסוי, כוללים במבחני חוץ גופית פיתוח, הדמיה לחיות, ניתוח ביטוי mRNA וניתוח כתם המערבי של חלבונים. זקיקים בשלב 10B (S10B) או במאוחר יהיו להשלים את הפיתוח בתרבות, זה מאפשר לשלב הפרעות גנטיות או תרופתיות עם פיתוח במבחנה כדי להגדיר את ההשפעות של מניפולציות כאלה על התהליכים המתרחשים בתקופות מסוימות של התפתחות. בנוסף, משום שזקיקים אלה מפתחים בתרבות, הם מתאימים באופן אידיאלי למחקרי הדמיה חיות, אשר לעתים קרובות לחשוף את המנגנונים חדשים שלתווך אירועים מורפולוגיים. גם זקיקים מבודדים יכולים לשמש לניתוחים מולקולריים. לדוגמא, שינויים בביטוי הגנים הנובעים מהפרעות גנטיות יכולים להיות מוגדרים עבור חלונות התפתחותיים ספציפית. בנוסף, רמת חלבון, יציבות, ו / או שינוי מצב posttranslational בשלב מסוים של התפתחות זקיק ניתן לבחון באמצעות כתם מערבי מנתח. לפיכך, בידוד בשלב מסוים של זקיקי דרוזופילה מספק מקור מידע עשיר לתהליכי שימור נרחב של פיתוח והמורפוגנזה.

Introduction

כל השחלה דרוזופילה מורכבת מ~ 16V ovarioles, או רשתות של תאי ביצה ברצף התבגרות או זקיקים. כל זקיק מורכב מביצית אחת, תאי אחות או תמיכה נגזרים שורת נבט 15, ו~ 650 תאים סומטיים מכונים תאי זקיק (איור 1 א). Oogenesis דרוזופילה מחולק ל14 שלבים מוגדרים מורפולוגית של פיתוח 1. בכל שלב של התפתחות זקיק הוא ציין פעמים רבות בתוך זבוב אחד, ולכן קל יחסית לבודד מספר ניכר של זקיקים בשלב מסוים.

שלבי האמצע עד סוף של oogenesis (שלבי 10B-14) הם גם מתאימים במיוחד לבידוד במה (איור 1). בשלב 10B (S10B), הזקיק מוארך באופן מלא (כלומר אורכו שווה לזה של שלב 14 (זקיק S14), ראה איור 1 ואיור 2H) ומחצית מאורכו של הזקיק מורכב מתאי אחותואילו המחצית השנייה היא הביצית (איור 1 ג). בשלב זה תאי האחות עוברים שיפוץ אקטין דרמטי, חיזוק אקטין קליפת המוח ויצירת חבילות מקבילות של סיבי אקטין 2. במקביל, אוכלוסייה של תאי זקיק, המכונה תאים הצנטריפטלי, נודדים בין תאי האחות והביצית, ושתי קבוצות הגבי של תאי זקיק הופכות צוינו לעבור הגירה כדי ליצור את הנספחים הגבי, מנגנוני נשימה צינורי לעובר 3 . תאי האחות אז חוזה (S11), לוחץ תוכן cytoplasmic שלהם לתוך הביצית בתהליך הנקרא תא אחות השלכת, אשר מספק את הביצית עם הגורמים הדרושים לכך שכדי להשלים את העובר (1D איור). תאי האחות ואז לעבור תא מוות (S12-S13) 4, ותאי הזקיק מפרישים ודפוס קליפת הביצה 5 (האיורים 1E-G). לפיכך, בסוף oogenesis עשיר בהתפתחותיים חשובתהליכי morphogenetic ד.

זקיקים מבודדים באמצע בשלב מאוחר (S10B-S14) יכולים לשמש למגוון מטרות, כולל ניתוחים מולקולריים. לדוגמא, ה-mRNA מזקיקים מבוימים יכולה להיות מבודד לRT-PCR, microarray, או RNA-seq ניתוחים. זה מאפשר להסתכל על ביטוי גנים בתוך חלון התפתחותית קצר, עם רק כמה סוגי תאים בהווה, ולקבוע כיצד ביטוי גנים שונה על ידי הפרעות או תרופתיות או גנטיות. גם בידוד שלב ניתן להשתמש להסתכל על חלבונים על ידי מערבי סופג. ניתוח כזה הוא חשוב משום שהוא מאפשר לכמת את רמת ביטוי החלבון בwild-type לעומת מוטציות בשלבים מסוימים. אמנם אפשר להשתמש immunofluorescent מנתח כדי להשיג תוצאות דומות, כימות של הקרינה היא חזקה פחות בשל הדרישות הקפדניות שכל הפיקסלים יהיו בתחום ליניארי של זיהוי 6. בנוסף, ניתוח כתם מערבי עשוי לספק מידע אחר, כגוןים אם החלבון הוא שונה או שהוא בא לידי ביטוי מאיזופורם אחו ספציפי posttranslationally. גם שלבים מבודדים יכולים לשמש לטיהור חלבונים נוספת, כוללים חלוקה או coimmunoprecipitation subcellular.

גם בידוד זקיק בשלב מסוים יכול לשמש במבחני חוץ גופית פיתוח 7 וחייה הדמיה 8. זקיקי S10B-S13 מבודדים ימשיכו לפתח לS14 בתקשורת תרבות הפשוטה (ראה להלן). חשוב לציין כי זקיקי S10A לא להתקדם דרך תא אחות השלכת באמצעות תנאי התרבות שנדונו בכתב היד הזה. יש לנו בשימוש במבחני חוץ גופית פיתוח S10B להגדיר את התפקיד של פרוסטגלנדינים, שני פרמקולוגית וגנטי, בויסות שיפוץ אקטין באמצעות תא אחות השלכת ופיתוח לקריאה פסקי 7,9. בדומה לכך, בשלבים מאוחר יותר של התפתחות יכולים גם להיות מבודדים כדי לקבוע את ההשפעות של טיפולים תרופתיים או איש גנטיipulations על תהליכים מסוימים, כגון הגירה הצנטריפטלי תא, הגירת תוספת גב / היווצרות 10, ומוות של תאי אחות. מבחני מסוג זה יכול לשמש כדי לבצע מסכי אינטראקציה דומיננטיים או מבחני, למשל, בעוד heterozygosity למוטציות בPXT או fascin לבד אין להם השפעה על התפתחות S10B במבחנה, זקיקים מheterozygotes הכפול תא אחות תערוכת הטלת מומים ולחסום בפיתוח 9.

בנוסף, בגלל S10B-13 יכולים להתפתח בתרבות, כל התהליכים המתרחשים בתקופה זו ניתן לצפות בזמן אמת הדמיה. הדמיה כזו יכולה להתבצע רק באמצעות אור מועבר (אם הוא מעוניין רק בשינויים במורפולוגיה ברוטו) או עם מיקרוסקופיה confocal באמצעות זבובים מהונדסים מבטא בדיקות או זקיקים מוכתמים בצבעי ניאון הדמיה לחיות. הדמיה חיה נמצאת בשימוש כדי לקדם את ההבנה של תהליכים התפתחותיים שלנו באופן משמעותי. אכן, לחיות לדמייןגרם של זקיקים בשלב מאוחר הרחיב את הידע של הגירת תוספת גב, דוגמא של tubulogenesis 10. אנו מצפים כי הדמיה חיה של תהליכים נוספים בשלב מאוחר, ובכלל זה אקטין דינמיקה בתא אחות השלכת, תספק תובנה חדשות אירועים התפתחותיים אלה. חשוב לציין כי בעוד S10A ושל התפתחות זקיק בשלבים מוקדמים לא ימשיכו להתפתח S14 בתרבות, בשידור חי הדמיה של אירועים המתרחשים באותם שלבים של התפתחות אפשרית באמצעות תנאי תרבות אלטרנטיביים 11-14 (ראה דיון ליותר מידע).

כאן אנו מספקים פרוטוקולים מפורטים לבידוד זקיקים בשלב מאוחר גם עבור פיתוח במבחנה ולחיות הדמיה, או ניתוחים מולקולריים (mRNA ובידוד חלבון).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת דרוזופילה לפני שלב בידוד

  1. הפוך שמרים להדביק רטוב על ידי שילוב של 50 גרם של שמרים יבשים פעילים עם 90 מיליליטר של מים מזוקקים. מערבבים עם מרית לשלב. תן לתערובת לעמוד במשך ~ 30 דקות לפני הערכת עקביות. העקביות צריכה להיות רק עבה מספיק כדי לדבוק בצד של בקבוקון לטוס אבל לא לרוץ למטה בצד. כדי להשיג את המרקם הרצוי ייתכן שיהיה צורך להוסיף עד 10 מיליליטר מים נוספים או כמות קטנה של שמרים יבשים. לאחסן במכל מכוסה ב 4 ° C. השמרים המאוחסנים יכולים לשמש ל~ 1-2 שבועות.
  2. לאסוף <זבובי 24 שעות ישנים מבוגרים (שני זכרים ונקבות) של גנוטיפים הרצויים ולשים אותם לתוך בקבוקון עם אוכל לטוס בתוספת ממרח שמרים רטוב מרוחה בצד של הבקבוקון. הטמפרטורה שבה נשמרים הזבובים תשתנה בהתאם לניסוי. בניסויים שיגרתי, זבובים נשמרים בטמפרטורת חדר. בעוד שניסויים שבהם הוא גןשביטוי יתר באמצעות מערכת UAS/GAL4 מאי 15 דורש שמירה על הזבובים 25 מעלות צלזיוס או יותר, על פי צורך.
  3. לספק את הזבובים עם כתם טרי של שמרים להדביק ביום למשך 2 ימים. הערה: כפי שהתפתחות זקיק מוסדרת היטב על ידי המצב התזונתי של נקבת הזבוב, זה חיוני כדי לספק לטוס עם השמרים להדביק עשיר המזינה לפחות 36 שעה לפני לנתיחה.

2. בידוד אמצע לסוף מבוים דרוזופילה זקיקים

  1. לאפשר לתקשורת כדי להגיע לטמפרטורת חדר (~ 30 דקות). אם הזקיקים המבוימים הולכים לשמש למבחני חוץ גופיית פיתוח, טרי להכין תקשורת IVEM (מדיה של גרייס חרקים, 10% בסרום שור העובר מומת חום, ו1x פניצילין / סטרפטומיצין). אם הזקיקים המבוימים הולכים לשמש לmRNA או בידוד חלבון להשתמש גם החרק של גרייס או מדיה IVEM. חשובה: טמפרטורת מדיה היא קריטית. אם התקשורת היא קרה זה יהיה לשנותגם אקטין וcytoskeletons microtubule ופיתוח בלוק.
  2. הרדימי זבובים בבקבוקון yeasted על ידי הזרקת גז CO 2 ומקום 3-5 זבובים נשיים על כרית לטוס תחת CO 2. חשוב: אל תשאיר יותר נשים מאשר יכול להיות גזור בתקופת זמן 10 דקות על משטח לעוף כמו חשיפה ממושכת לCO 2 יכול לגרום לעקרות ומוות.
  3. מלא גם אחד של צלחת 9-spot עם תקשורת ולמקם אותו על גבי משטח כהה (חתיכת פרספקס השחור עובדת היטב). להתמקד ההיקף לנתח בתחתית הבאר.
  4. # 5 מלקחיים דומון באמצעות להרים נקבה אחת ביד אחת (זה נעשה הכי טוב בעזרת היד הדומיננטית). זה בדרך כלל הקל ביותר להרים את הנקבה על ידי כנפיים, רגליים, חזה או למעבר בטן. להטביע את הנקבה בתקשורת מילאה היטב. התאם את המיקוד של המיקרוסקופ בהתאם לצורך.
  5. שימוש בזוג נוסף של מלקחיים שנערכו בnondominant היד, לתפוס את הנקבה בקצה הקדמי של הבטןכך שהקצה האחורי ממוקם לכיוון היד הדומיננטית (איור 2 א). הקפד לשמור את הזבוב השקוע בתקשורת.
  6. עם היד הדומיננטית, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את הציפורן במגזר פיגמנט האחורי ביותר 2 ולקרוע אותו משאר חלל הבטן (איורים 2 ב-C).
  7. שימוש במלקחיים ביד הדומיננטית, ללחוץ בעדינות את הקצה הקדמי של הבטן עד לשחלות לצוץ (איורים 2D-E). במידת צורך, הנח את המלקחיים בין שתי השחלות ולמשוך אותם אל מחוץ לגופה.
  8. כך או להזיז את השחלות לבאר חדשה עם תקשורת טרי (איור 2F) או להסיר את הפגר למגבת Kimwipe או נייר. זה חשוב במיוחד אם זקיקים להיות מבודדים לפיתוח במבחנה.
  9. חזור על פעולה עד 3-5 זוגות של השחלות היו מבודדים. הערה: כל השחלה מורכבת מ~ 16V ovarioles או שרשרות של זקיקים ברצף התבגרות. כל ovarioleהוא הכיל בתוך מעטפת שרירים.
  10. באמצעות מלחציים סיכה והמחטים מסופקות עימם, בעדינות לפרק את השחלה על ידי הפעלת המחטים בין ovarioles (איור 2G). לפעמים זה ישחרר את הזקיקים הבודדים גם כן.
  11. ovarioles פרט והשלבים מורפולוגיים להבחין בקלות של התפתחות זקיק צריך עכשיו להיות גלוי (איור 2G, השחלה התגרתה מזה). עיין באיורים 1 ו 2H להבדלים מורפולוגיים שניתן להשתמש בם כדי להבדיל בין השלבים השונים. כדי לבודד זקיקים שנמצאים בovarioles שלם ועדיין בתוך מעטפת שרירים, להשתמש במחט לחוצה ovariole בקדמי של הזקיק שקדמו ובאחורי של הזקיק הבא הזקיק של עניין באופן מיידי. זה ישבור את מעטפת השרירים והזקיק של עניין משם כעת ניתן לחתוך מהזקיקים השכנים ללא פגיעה בו. כשלבים בודדים מופרדים, הזז את הזקיקים של עניין, באמצעות פיפטה זכוכית, לבאר חדשה עם מדיה חדשה. הדבר חשוב במיוחד כאשר מבודדים את הזקיקים להתפתחות במבחנה. הערה: חשוב לסחוט את הנורה פיפטה לפני הכניסה לתקשורת כדי למנוע בועות האוויר מהפיזור מחדש של הזקיקים של עניין לאורך כל כן. בנוסף, אם הזקיקים דבקים בפיפטה הזכוכית, פיפטה ניתן precoated עם 3% אלבומין בסרום שור (BSA) על ידי pipetting פתרון BSA מעלה ומטה מספר פעמים ושטיפה עם תקשורת לנתח.
  12. ברגע שמספיק זקיקים היו מבודדים, להמשיך בניסויים הבאים.

3. פיתוח במבחנה של S10B זקיקים

  1. לבודד זקיקי S10B באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) בתקשורת IVEM. ודא שהזקיקים הם במהירות התרחקו מפסולת. כאשר זקיקים אלו ימשיכו להבשיל, זה important שS10Bs נאספים ל30-60 דקות ולאחר מכן הניח לתקשורת ההתבגרות של בחירה. הערה: S10B צריך להיות מכובד על זהירות מזקיקי S10A (איור 1 ג לעומת 1 ב '), כפי שזקיקי S10A לא בוגרים בתקשורת ותרבות IVEM. בשני זקיקי S10B S10A ו, מחצית מהאורך מורכבת מתאי אחות ואת החצי השני הוא הביצית, אבל בS10B האורך של הזקיק הוא שווה לזה של זקיקי S14.
  2. בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר ~ 30 זקיקי S10B לתוך באר של צלחת תרבית רקמת 24 גם. הערה: הקפד לוודא שכל הזקיקים מועברים הם S10B ולא הבשיל לS11.
  3. הכן 1 μl של מדיה התבגרות לכל טוב, כלומר תקשורת IVEM בתוספת חומרים כימיים תרופתיים.
  4. באמצעות פיפטה * זכוכית משך, להסיר כמה שיותר מדיה מהבאר (שלב 3.2) ככל האפשר, ובמהירות להוסיף מדיה התבגרות של בחירה. הערה: זה חיוני להשתמש פיפס זכוכית משךette כזקיקים מבוימים ניתן לקחת בקלות גם עם טפטפות זכוכית או טיפים פיפטה עם Pipetman.
    * כדי להפוך טפטפות משכה: 1) מחמם את החלק הדק של טפטפות בלהבה של מבער בונזן הארוכה, זכוכית רק עד שהזכוכית מתחילה להתרכך; 2) להעביר באופן מיידי את פיפטה מהלהבה ולמשוך אופקי כדי לצייר את פיפטה לתוך צינור עדין; 3) לשבור כדי ליצור נקודה עדינה. זהירות: השתמש בהגנה על העין שברי הזכוכית עשויים להתעופף.
  5. חזור על שלבים 3.1-3.4 לבארות רבות כמו הניסוי דורש.
  6. אפשר לזקיקים להתפתח ל> 10 שעה ולהבקיע ההתקדמות התפתחותית בהיקף לנתח. הערה: ניסויים בדרך כלל הבקיע למחרת כדי לאפשר מספיק זמן לזקיקים להתפתח. S10B היא ~ 5 שעות, S11 הוא ~ 30 דקות, S12 הוא ~ 2 שעות, וS13 הוא ~ 1 שעות במשך ב25 C ° 1 ופיתוח בטמפרטורת חדר ייקח מעט יותר זמן. ניסויים דומים לזה שתוארו על זקיקי S10B יכולים להיותמבוצע באמצעות זקיקי S11-S13.

4. בידוד במה עבור הדמית חיה

  1. לבודד את הזקיקים בשלב מאוחר (S10B-14) המבטא את סמן פלואורסצנטי של בחירה באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) בתקשורת IVEM, נע במהירות זקיקים מפסולת.
  2. הזז זקיקים של עניין לתוך מדיה חדשה ולאחר מכן להעביר על ידי פיפטה זכוכית לצלחת פטרי תחתון coverslip. תשמור על עצמך כדי להוסיף מדיה, כך שהוא מבעבע באזור התחתון coverslip אבל לא יגלוש.
  3. לזמן לשגות סרטים ארוכים יותר, לפעמים יש צורך לשמור על לחות בתוך צלחת פטרי על ידי הוספת Kimwipe מופשלת, טבולה במים, לקצה הפנימי של צלחת פטרי. מניחים את המכסה על ראש.
  4. תמונה על מיקרוסקופ הפוכה. החלטה מפורטת תדרוש מיקרוסקופיה confocal. זה הכרחי כדי לאזן את התדר של הדמיה, עוצמת התאורה, ואורך של הדמיה, זה צריך להיות באופן עצמאי הסתדר לכל ליטרכלי abeling ותהליך התפתחותי.

5. בידוד במה לmRNA הכנה

  1. לבודד זקיקי שלב בודדים באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) עם או תקשורת של גרייס או IVEM.
  2. בעזרת פיפטה זכוכית, להעביר את השלבים הבודדים של עניין לתוך בארות חדשות עם תקשורת; ניתן לאסוף שלבים מרובים בבת אחת.
  3. שמור פעמים אוסף תחת 1 שעות. הזז את הזקיקים, באמצעות פיפטה זכוכית, ל1.5 מיליליטר צינורות microfuge.
  4. לסובב את הצינור לזמן קצר במיני microcentrifuge כדי גלולה כל הזקיקים. בעזרת פיפטה משכה את הזכוכית (ראה שלב 3.4) להסיר בזהירות את כל אמצעי התקשורת. הערה: אם אתם משתמשים בmicrocentrifuge בגודל מלאים, לסובב את הזקיקים במהירות נמוכה.
  5. הוספה של Trizol 100 μl ולטחון ביד ל~ 20 שניות באמצעות העלי פלסטיק. ספין למטה במהירות מלאה בmicrocentrifuge ולעבור Trizol לנזהר שלא להפריע לכל ד pelleted צינור 1.5 microfuge מיליליטר חדשebris. חנות ב -80 ° C.
  6. חזור על שלבים 5.1-5.5 עד מספיק זקיקים התקבלו לניסוי. באופן שיגרתי, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, ו~ 100 S14 זקיקים להניב ~ 10 מיקרוגרם של רנ"א.
  7. הפשירו דגימות על קרח. משלב דגימות, לפי העניין, לצינור microfuge אחד ולהביא עד 800 μl Trizol הנפח. להמשיך עם בידוד RNA לפי הוראות היצרן. חשוב: זכור לDNase טיפול RNA הבודד עם DNase RNase ללא.

6. בידוד במה לסופג מערבי

  1. מחממים גוש חום ל100 ° C.
  2. לבודד זקיקי שלב בודדים באמצעות פרוטוקול בידוד השלב (שלב 2) עם או תקשורת של גרייס או IVEM. הערה: יש צורך לקבוע באופן אמפירי כמה מזקיק בשלב מסוים יש צורך להתבונן בכל חלבון ספציפי. לחלבונים הביעו מאוד 1-3 זקיקי S10B / טוב מספיק כדי לראות את איתות חזקה על כתם מערבי. עם זאת, חשוב לעשותמדגם מייצג, לוקח זקיקים מנקבות מרובות. לפיכך, 15-20 זקיקים של שלב מסוים הם בדרך כלל שנאספו.
  3. הזז זקיקים, באמצעות פיפטה זכוכית, לצינור microfuge 1.5 מיליליטר. ספין בקצרה במיני microcentrifuge לגלולת הזקיקים (ראה שלב 5.4). מוציא בזהירות את כל התקשורת באמצעות פיפטה זכוכית משך (ראה שלב 3.4) ולהוסיף 50 μl של 1x PBS ו50 μl של חיץ 2x Laemmli.
  4. לטחון ביד ל~ 20 שניות עם העלי פלסטיק. הערה: עלי פלסטיק ניתן לעשות שימוש חוזר לטחינת דגימות מערביות על ידי שטיפה והמעוקר.
  5. מרתיחים את הדגימות עבור 10 דקות בגוש החום.
  6. צ'יל בקצרה על קרח וספין במהירות מלאה ל15 שניות בmicrocentrifuge. או מייד להעמיס על ג'ל SDS-PAGE או חנות ב -20 ° C. שים לב: אם הדגימות מאוחסנות, לזכור להרתיח מחדש את הדגימות לפני העמסתי על ג'ל.
  7. ביצוע ניתוח כתם מערבי בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר מבודדים את שלבים מסוימים של התפתחות זקיק דרוזופילה זה הכרחי כדי להיות מסוגל להבחין במדויק את שלבי מורפולוגיים השונים. זה קצת מאתגר עבור S10A וS10B, כמו תאי האחות והביצית כל לקחת חצי אורכו של הזקיק בשלבים האלה (איור 1 ב בהשוואה ל1C). עם זאת, זקיקי S10A הם קצרים באורך יותר מזקיקי S10B, כמו זקיקי S10B מוארכים באופן מלא ובכך שווה באורך זקיק S14 (תרשים 1C בהשוואה ל1G). בנוסף, קבוצת משנה של הזקיק או תאים סומטיים על הביצית נקראת תאי זקיק הצנטריפטלי מתחילה לנדוד בין תאי האחות והביצית בS10B. במהלך S10B, אשר לוקח ~ 5 שעות, תאי האחות עוברים שיפוץ אקטין דינמי כך שבS11 חוזה תאי אחות, לוחץ תוכן cytoplasmic שלהם לתוך הביצית. וכך, בS11, יש לו את אזור תא האחותירד באופן משמעותי, ואילו הביצית הרחיבה (1D איור). בS12, תאי האחות מתחילים לעבור מוות ולקחת על מראה אטום יותר (איור 1E); מעניין, בתרבות, dorsally תלתל שרידי תא אחות בזקיקי S12 (ראה S12s בדמויות 3C'-D "). במהלך S13, אזור תא האחות הוא שקוף כמו המוות של תאים מתבצע הושלם, והיווצרות תוספת הגבי מתרחשת (איור 1F). על ידי S14 רק הביצית ותאי הזקיק יישארו, והיווצרות תוספת הגבי הושלמה (איור 1G).

במבחנה assay הפיתוח ניתן להשתמש כדי להעריך את ההשלכות של טיפולים שונים תרופתיים ומוטציות גנטיות על התפתחות S10B ותא אחות השלכת (איור 3). הפיתוח של S10Bs בתרבות הוא חזק, לעומת זאת מספר גורמים יכולים להוביל לתוצאות ניסוי עניות. באיור 3 א,נתוני ניסוי ממוצלח וניסוי נכשל גם מסופקים. ניסוי מוצלח הוא כזה שבי 80-100% מזקיקי wild-type בתקשורת סלולרי שליטה מלאה אחות השלכת והתקדמות לS12-14 (איור 3 א, WT 1). לפעמים פקדים פראי מהסוג ייכשלו, כלומר פחות מ 80% מהזקיקים לפתח (איור 3 א, WT 2). כישלון זה יכול להיגרם על ידי מספר הנושאים ביניהם: 1.) חוסר יכולת להבחין S10A מזקיקי S10B (ראה איורים 1 ו -2), 2) בעיות בתקשורת (טמפרטורה, גיל, וכו '), ו / או 3) זקיקים היו נחשף לפסולת במשך זמן רב מדי.

במבחנה פיתוח S10Bs יכול לשמש בשילוב עם טיפול תרופתי. עבור ניסויים כאלה, חשוב ששולט בסמים, כלומר טיפול בזקיקי wild-type עם הסמים, מבוצעים בכל ניסוי, כי יעילות תרופה ו / או תרכיזייון יכול להשתנות עם זמן. בניסויים תרופתיים, זה נוח לנתח את היחס בין אחוז הזקיקים המתפתחים בטיפול התרופתי לזה בתקשורת שליטה; זה שולט להבדלי רקע גנטי קלים. זה בדרך כלל שימושי לטיפול עם ריכוז IC 50 של התרופה, זה הריכוז שחוסם 50% מwild-type (י.ו.) זקיקים מעוברים תא אחות השלכת ופיתוח נוסף. . כך, היחס לזקיקים פראי מהסוג צפוי להיות 0.5 (איור 3B, סמים 1) איור 3 היא דוגמא לאופן שתרופה (אספירין) יכולה להיות מרוכזת מדי (סמים 2; הנראה בשל ממס אידוי) ובלוק יותר מ 50% מזקיקים פראי מהסוג מלפתח. כדי להמחיש את assay פיתוח במבחנה נוסף, תמונות של שתי בארות של זקיקי S10B פיתוח מסופקות. 3C הדמויות וD להמחיש את זקיקי S10B בתחילתassay, בשליטה או אספירין שטופל (~ 2 מ"מ) בתקשורת. 3C דמויות 'ו' ד 'להמחיש את סוף assay, חושף כי מרבית הזקיקים שטופלו השליטה פותחו כדי S14, בעוד הרוב המכריע של הזקיקים שטופלו באספירין יש לא תא אחות הושלם השלכת.

גם במבחנה assay הפיתוח יכול לשמש מסך לרקע גנטי, כי הם יותר רגישים לתרופה מסוימת. איור 3E מכיל שתי דוגמאות לכך. בדוגמא הראשונה, הרקע הגנטי (expt1, פס כחול) לא מצליח לקיים אינטראקציה עם אספירין כיחס נשאר ~ 0.5; לעומת זאת, בדוגמא השנייה, הרקע הגנטי (expt2, הפס אדום) משפר את ההשפעה של אספירין. לפיכך, במבחנה assay הפיתוח ניתן להשתמש כדי להגדיר את ההשלכות של מוטציות וחומרים כימיים תרופתיים על האירועים התפתחותיים ומורפולוגיים המתרחשים במהלך oogenesis המאוחר, בנוסף, assay ניתן להשתמש בם כדי להעריך את שני תרופתי ואינטראקציות גנטיות (ראה 9).

גם בידוד במה יכול לשמש להדמית חיה של תהליכים התפתחותיים. איור 4 היא דוגמא לסרט זמן לשגות של זקיק S10B להביע Utrophin-GFP, תחום המחייב אקטין מUtrophin האדם התמזגו חלבון פלואורסצנטי ירוק. שימוש בכלי הדמיה, היווצרות זו אקטין חבילה ועיבוי ניתן דמיינו. כלים רבים זמינים עבור הדמיה חיה, כוללים קווים מהונדסים מלכודת חלבון 16,17, כטב"מ מונע מתויג fluorescently סמני אברון (מיטוכונדריה, Golgi, reticulum endoplasmic, וכו '.), כטב"מ מונע מתויג fluorescently סמני cytoskeletal (חלבונים מחייבים אקטין ותקטין, microtubule ו microtubule מחייב חלבונים), קווים מהונדסים הבעת מתויג fluorescently חלבון של עניין, וצבעים חיוניים (הנילוס אדום תוויות שומנים ניטראליים, תוויות Edu משכפלות את ה-DNA, FM4-64 קרומי תוויות).

ove_content "> ניתן לבצע ניתוחים מולקולריים באמצעות שלבים בודדים של זקיקי דרוזופילה. לניתוח חלבונים על ידי מערבי סופג, יש צורך לקבוע באופן אמפירי כמה זקיקים, של שלב התפתחותי מסוים, נדרשים כדי לבחון את החלבון של עניין. איור 5 הוא דוגמא לאופן לדלל ברצף lysate חלבון מרוכז כדי לקבוע את מספר זקיקי S10B צורך להתבונן חלבון מסוים, Fascin. במקרה זה אחד זקיק S10B מספיק להתבונן חלבון זה על ידי מערבי סופג.

איור 1
איור 1. תרשים המתאר את ההרכב התאי של זקיקי דרוזופילה ותמונות הממחישים את ההבדל הצורני של שלב האמצע עד סוף תחשיב היחסים דרוזופילהlicles. א תרשים המתאר את ההרכב התאי של זקיק S10A. BG. נציג תמונות של זקיקי S10A-S14 דרוזופילה צולמו באמצעות סטריאו לנתח היקף. זקיק דרוזופילה כולל 16 תאים שמקורם בתאי מין: ביצית 1 (אדום,) ו15 תאי אחות או תמיכה (צהוב,), שמוקפים על ידי ~ 650 תאי האפיתל גופני הנגזרים (לבן, מגנטה, ציאן, ). בS10A, מחצית מאורכו של הזקיק מורכבת מתאי האחות (סוגר צהוב, ב '), אשר מכוסים על ידי תאי זקיק מתיחה (מג'נטה ב), ואת החצי השני מורכב מהביצית (כוכבית אדומה , ב '), אשר מכוסה על ידי תאי זקיק הגוף העיקריים (לבן ב). בS10B, תאי האחות (סוגר צהוב, C) וביצית (כוכבית אדומה, ג) כל אחד להלחין מחצית length של הזקיק, לעומת זאת האורך הכולל של הזקיק הוא שווה לזה של זקיק S14 (השווה C ל-G) עכשיו. במהלך S11, תאי האחות (סוגר צהוב, ד ') במהירות לסחוט תוכן cytoplasmic שלהם לתוך הביצית מתארכת (כוכבית אדומה, ד') בתהליך אקטין / שרירן תלוי מכונה תא אחות הטלה. על ידי S12, הביצית (כוכבית אדומה, E) יש מוארכת באופן מלא כתא אחות השלכת היא שרידי תא אחות מלאים ורק יישארו (סוגר צהוב, E). שרידי תא אחות מוות של תאים מלאים (סוגר צהוב, F) בS13. S14 מייצג את הזקיק בשלה לגמרי, שמורכב מהביצית (כוכבית אדומה, G), התאים סומטיים, וקליפת הביצה, כולל הנספחים הגבי (חצים לבנים, G). בר = 0.1 מ"מ הסולם ב '.

איור 2 איור 2. תמונות מתן סקירה של נתיחת השחלה ובידוד זקיק. א להטביע את הזבוב בתקשורת לנתח ולכוון אותו כך שהוא מתקיים, על ידי מלקחיים, בnondominant היד. B. שימוש ביד הדומיננטית, לתפוס את הציפורן באחורית של הבטן. ג משוך את הציפורן מ, חושף את השחלות (חץ צהוב). ד עבודה מהקדמי של הבטן לכיוון האחורי, ללחוץ בעדינות את הבטן משחררת את השחלות (חץ צהוב). א הפרד את השחלות (חץ צהוב) מכל ציפורן הנותרת (חץ אדום) ו / או איברים פנימיים (ראשי חץ לבנים). פ מעבירים את השחלות המבודדות לתקשורת המכילה גם טרי לנתח. ג להקניט מלבד השחלות, באמצעות מחטים לנתח, לחשוף מצביעיםזקיקי vidual (השווה השחלה בשלמותה (למעלה) לשחלה מופרדת (תחתונה). נקודות ראש חץ לבנה כדי זקיק S10B נדקר, דוגמא של זקיק שלא אמור לשמש לניסויים הבאים. ה 'בחר שלבי מורפולוגיים של עניין (שלבים 10A -14 (S10A-S14) מוצג).

איור 3
איור 3. דוגמאות למבחני חוץ גופיית פיתוח. תרשים א 'של אחוז S10B זקיקי שפיתוח מלא בתרבות. WT 1 הוא דוגמא להתפתחות צפויה של זקיקים פראי מסוג S10B (פיתוח 96%), ואילו WT 2 היא דוגמא להתפתחות לקויה בתרבות (פיתוח 68%). אנחנו בדרך כלל היינו זורקים את הניסוי כולו, אם ההתפתחות של זקיקי S10B wild-type בתקשורת שליטה היא מתחת 80%. B. 50 IC לאספירין לפיתוח אחוז בבקרת מדיה. 50 IC הוא הריכוז שחוסם 50% מזקיקי S10B מפיתוח; פירוש זה הערך הפראי מהסוג צריך להיות ~ 0.5. סמים 1 הוא דוגמא ליחס הצפוי wild-type (0.52), ואילו סמים 2 הוא דוגמה למה שקורה כאשר ריכוז התרופה חזק מדי (0.37). תקליטור '. תמונות של במבחנה בארות פיתוח. CC ". בקרה טופל. DD '. אספירין מטופלים (~ 2 מ"מ). תקליטור. תמונה של S10Bs בתחילת assay. C'-D'. התמונה של הזקיקים בנקודת הסיום של assay. ביקורת שטופלה זקיקי S10B לפתח לS14s בתרבות (C '), בעוד הרוב המכריע של זקיקי אספירין מטופלים להיכשל כדי להשלים תא אחות השלכת (ד'). 50 IC לאספירין לפיתוח אחוז בבקרת מדיה. זוהי דוגמא של שני ניסויים מחפשים הפרמה-אינטראקציות. המוטציה expt1 (פס כחול) אינה משנה את ההשפעה של 50 IC לאספירין (0.57), בעוד expt2 מוטציה (פס אדום) משפרת את ההשפעה של אספירין (0.16).

איור 4
איור 4. דוגמא המראה את השימוש בS10B המבודד זקיקים להדמיה לחיות. ריבועי מוגדלים AF. תחזיות מרבי של 3 פרוסות מZ-ערימות הזמן לשגות של זקיק S10B מבודד מUtrophin :: ה-GFP להביע זבובים מהונדסים (sqh-Utrophin :: GFP). A'-F '. להדגיש תא אחות אחת מ A- פ AF '. ה-F-אקטין (Utrophin :: GFP), לבן.,'. זמן (t) = 0 דקות. ב ', ב'. T = 20 דקות. C, C '. T = 40 דקות. ד ', ד'. T = 60 דקות. E, E '. T = 80 דקות. F, F'. T = 100 דקות. בנקודת הזמן הראשונית, ניתן לראות סיבי אקטין קצר הארכה פנימה מקרום תא אחות (, '). סיבי אקטין אלה להאריך לאורך כל נקודות בתחילת הזמן (לפני הספירה 'בהשוואה ל', א ') עד שהם מוארכים באופן מלא (ד', ד '). בנקודות זמן מאוחר יותר, סיבי אקטין מוארך באופן מלא אלה אז לקצר ולתמצת בכל תא אחות השלכת (EF ') בר סולם א = 50 מיקרומטר.'. בר סולם = 10 מיקרומטר.

"Src =" _upload/50493/50493fig5highres.jpg / files/ftp_upload/50493/50493fig5.jpg "/>
.. איור 5 איור של איך לקבוע את מספר זקיקי צורך לבחון חלבון מסוים על ידי ניתוח כתם מערבי זה כתם מערבי מסתכל על ביטוי Fascin בזקיקי S10B (1:20, 7C SN, קולי, ל; התפתחותית ללימודים Hybridoma בנק (DSHB), שפותח בחסות NICHD ומתוחזק על ידי אוניברסיטת איווה, המחלקה לביולוגיה, Iowa City, IA, 52242). המספרים לרוחב החלק העליון מייצגים את המספר המשוער של זקיקי S10B הטעונים לכל נתיב.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

זקיק דרוזופילה מורכב ממספר קטן של סוגי תאים, מה שהופך אותו אידיאלי עבור שניהם המורפולוגיים וניתוחים מולקולריים. יתר על כן, בשל המבנה של השחלה, קל יחסית להשיג מספר גדול של שלבים מסוימים של התפתחות זקיק עם היקף ניתוחים נפוץ והכשרה מינימאלית. כמו כל שלב מייצג חלון זמן קצר, בידוד שלב יכול לספק תובנות מולקולריות משמעותיות לתהליכים התפתחותיים המתרחשים בשלב זה. לדוגמא, יש לנו להשתמש בידוד זקיק שלב האמצע לסוף כדי לאפיין את שינויי ביטוי גנים המתרחשים במהלך S10B, S12, S14 ו18. ניתוח זה מצביע על מספר גנים uncharacterized בעבר עשוי לתרום להתפתחות זקיק ו, בתצורה מסוימת, קליפת ביצה.

בידוד שלב יכול לספק תובנות דרמטיות לאירועים מורפולוגיים באמצעות הדמיה לחיות. הדמיה כזו יכולה להתבצע על אל שלבי ליטר של התפתחות זקיק דרוזופילה. למרות ההתמקדות של עבודה זו היא S10B-14, קוראים מופנים למאמרים הבאים לחית הדמיה של שלבים מוקדמים יותר: germarium 13, התארכות זקיק 19, ושלב 9 11,12,14. תנאי התרבות מנוצלים במחקרים אלה נבדלים מאלה שנדונו בעבודה זו. באופן ספציפי, מחקרים אלה משמשים החרקים מדיה של שניידר עם רמות משתנה של FBS (2.5-15%), כמו גם התוספת של אינסולין 11-13,19 ו, במקרים מסוימים, תוספת נוספת של trehalose, methoprene, 20-hydroxyecdysone, ו אדנוזין deamidase 14. חשוב לציין כי מחקרי ההדמיה לחיות אלה קידמו את ההבנה של האירועים המתרחשים בשלבים המוקדמים אלה של התפתחות שלנו באופן משמעותי. עם זאת, זקיקים בשלב מוקדם אלה לא יכולים להתקדם כל הדרך אל השלב הסופי של התפתחות זקיק, S14. לעומת זאת, S10B-13 יפתחו לS14 בתרבות.

ove_content "> בתהליכים רבים מורפולוגיים S10B-S14 להתרחש כי ניתן ללמוד על ידי הדמיה לחיות. לדוגמא, הדמיה חיה יכולה לשמש כדי לבחון את התהליך של תא אחות השלכת, התהליך שבו תאי האחות לסחוט תוכן cytoplasmic שלהם לתוך הביצית לספק לו את כל מה שהוא צריך כדי להשלים את העובר. תא אחות השלכת יכולה להיות שנצפתה על ידי הזמן לשגות הדמיה באמצעות אור מועבר 7 או על ידי ההדמיה confocal באמצעות קווים מהונדסים מבטא סמני ניאון (ראה איור 4). המשך שימוש של הדמיה לחיות צפוי לספק תובנה חדשות על דינמיקת cytoskeletal הכרחית לתא אחות הטלה. Live-הדמיה של שלבים מאוחר יותר גם קידמה את ההבנה של הגירה הגבי תוספת primordia וtubulogenesis 10 שלנו.

בפיתוח חוץ גופית של זקיקי S10B-S13 יכול לשמש כדי להגדיר את ההשפעות של שני חומרים כימיים תרופתיים ומניפולציות גנטיות על התהליכים להתרחשתצלצל בתקופה זו. יש לנו להשתמש בפיתוח חוץ גופית של זקיקי S10B להקים את התפקיד של פרוסטגלנדינים בויסות תאי אחות השלכת 7. בהמשך לכך היינו באמצעות assay זה לבצע מסך תרופתי-אינטראקציה, במיוחד, יש לנו כבר בודק אם אובדן עותק אחד של רגולטור אקטין משפר או מונע תא אחות הטלת מומים עקב האובדן של פרוסטגלנדינים. מסך זה חשף מספר מטרות המשוערת במורד הזרם (9 וSpracklen, מאייר, וצפרנו, נתונים שלא פורסמו). גם assay יכול לשמש כדי לבחון אינטראקציות גנטיות על ידי הערכת ליקויים התפתחותיים, כגון בלוק בתא אחות השלכת, בשל הטרוזיגוטיות לשני גורמים שונים (לדוגמה לכך רואה 9).

בעוד בידוד זקיקי דרוזופילה האמצע עד סוף השלב הוא תהליך פשוט למדי, יש מספר גורמים קריטיים להצלחה אופטימלית. ראשית, הכנת הזבובים היאחשוב מאוד. זה הכי טוב כדי לשמור על גנוטיפים שונים של זבובים בדומה כתנאי ככל האפשר, כלומר את מספר זבובים לכל בקבוקון, היחס בין נקבות לזכרים (2:1 יחס הוא אידיאלי), ולספק שמרים טריים, רטובים באופן עקבי. ההאכלה (שמרים רטובים) וזמן נתיחה ישנו את השכיחות של השלבים השונים של פיתוח. מצאנו כי כאשר הזבובים מוזנים באופן עקבי בבוקר, יכול להיות מבודד יותר S10Bs בבוקר, בעוד יותר S12s נמצאים בשעתי אחר הצהריים. גורם קריטי שני הוא התקשורת. לפיתוח במבחנה והדמיה לחיות זה הכרחי כדי להכין את תקשורת IVEM טרי. בנוסף, התקשורת חייבת להגיע לטמפרטורת חדר כאמצעי תקשורת קרה תשנה cytoskeletons, גם אקטין וmicrotubules, ולכן, לשבש המשך פיתוח. כמו כן, חשוב לשמור על מרחק מפסולת הזקיקים. לפעמים, במהלך הניתוח, הבטן יצאו עם השחלות. מצאנו כי אם מקרע במעייםוהזקיקים נשמרים בתקשורת מזוהמת, הזקיקים אינם צפויים לפתח בתרבות. כזקיקים ימשיכו להתפתח בתרבות, זה הכרחי כדי לאמת מחדש את ההיערכות לאחר נתיחה לפני שתמשיך עם או מבחנה פיתוח באו ניתוחים מולקולריים. לבסוף, חשוב שתהיינה לי בקרות נאותות לניסויים. לפיתוח במבחנה, יש צורך להשתמש בזקיקי wild-type לבדוק שהתקשורת מאפשרת להתפתחות תקינה (80-100% תא אחות מלא השלכת), וכדי לבדוק שחומרים כימיים תרופתיים לפעול כצפוי (ראה איור 3).

לסיכום, בידוד של זקיקי שלב דרוזופילה האמצע עד סוף יכול לספק תובנה משמעותית לתהליכים התפתחותיים באמצעות מגוון רחב של טכניקות ניסוי.

טבלה של חומרים כימיים וציוד ספציפיים:

שם המגיב חברה חתולalogue מספר תגובות (אופציונלי)
שמרים יבשים פעילים Genesee מדעי 62-103 כל מקור של שמרי יבשים פעילים הוא בסדר
החרקים מדיה של גרייס Lonza 04-457F
חום מומת בסרום שור עוברי אטלנטה ביולוגיות S11050H כל החום המומת FBS צריך לעבוד
10x פן / סטרפטוקוקוס Gibco / Invitrogen 15140-122
מלחציים פין ומחטים טד פלה, Inc 13,561-10
פלייט ספוט, תשע ובכן קורנינג 7220-85
# 5 מלקחיים דומון כלי מדע פיין 11,252-20
24 צלחות רב גם בקטון דיקינסון 35 3226 כל 2צלחת תרבית רקמת 4 היטב צריכה לעבוד
Coverslip כלים תחתונים (35 מ"מ) חברת MatTek P35G-1.0-14-C עובי coverslip יהיה תלוי בשימוש במיקרוסקופ / אובייקטיבי
טפטפות זכוכית קורנינג 7095B-5x (להעברת זקיקים)
7095B-9 (לייצור טפטפות משכה)
העלי מדגם (1.5 μl; RNase / DNase חינם) מוצרי המחקר בינלאומי 199,228 כל העלי פלסטיק שמתאים 1.5 צינורות microfuge μl יכול לשמש
Trizol Invitrogen 15596-018

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין מה לחשוף.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לתומאס Lecuit (קו GFP :: sqh-Utrophin), מרכז מלאי בלומינגטון, ובנק Hybridoma המחקרים התפתחותית לחומרים כימיים. בנוסף, אנו מודים לכל חברי המעבדה צפר לדיונים וביקורת מועילים של כתב היד. מימון מהקרן הלאומי למדע MCB-1158527, וקרנות הזנק מאנטומיה ומחלקת ביולוגיה של תא, אוניברסיטת איווה תמכו עבודה זו. המכון הלאומי לבריאות predoctoral הדרכה גרנט בתרופתי המדעים T32GM067795 נתמך AJS. תמיכת אחסון נתונים סופקה על ידי ICTS, אשר ממומן באמצעות CTSA נתמך על ידי המרכז הלאומי למשאבי מחקר והמרכז הלאומי לקידום מדעי Translational, המכונים הלאומיים לבריאות, דרך גרנט UL1RR024979.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Active Dry Yeast Genesee Scientific 62-103 Any source of Active Dry Yeast is fine
Grace’s Insect Media Lonza 04-457F
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11050H Any Heat Inactivated FBS should work
10x Pen/Strep Gibco/Invitrogen 15140-122
Pin Vises and Needles Ted Pella, Inc. 13561-10
Spot Plate, Nine Well Corning 7220-85
#5 Dumont forceps Fine Science Tools 11252-20
24 multi-well plates Becton Dickinson 35 3226 Any 24-well tissue culture dish should work
Coverslip Bottom Dishes (35mm) MatTek Corporation P35G-1.0-14-C Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used
Glass pipettes Corning 7095B-5x (for transferring follicles)
Glass pipettes - long Corning 7095B-9 (for producing pulled pipettes)
Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) Research Products International 199228 Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used
Trizol Invitrogen 15596-018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spradling, A. C. The development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinez-Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1-70 (1993).
  2. Guild, G. M., Connelly, P. S., Shaw, M. K., Tilney, L. G. Actin filament cables in Drosophila nurse cells are composed of modules that slide passively past one another during dumping. J. Cell Biol. 138, 783-797 (1997).
  3. Horne-Badovinac, S., Bilder, D. Mass transit: epithelial morphogenesis in the Drosophila egg chamber. Dev. Dyn. 232, 559-574 (2005).
  4. McCall, K. Eggs over easy: cell death in the Drosophila ovary. Dev. Biol. 274, 3-14 (2004).
  5. Berg, C. A. The Drosophila shell game: patterning genes and morphological change. Trends Genet. 21, 346-355 (2005).
  6. Taylor, C. R., Levenson, R. M. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment II. Histopathology. 49, 411-424 (2006).
  7. Tootle, T. L., Spradling, A. C. Drosophila Pxt: a cyclooxygenase-like facilitator of follicle maturation. Development. 135, 839-847 (2008).
  8. Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging. J. Vis. Exp. , (2012).
  9. Groen, C. M., Spracklen, A. J., Fagan, T. N., Tootle, T. L. Drosophila Fascin is a novel downstream target of prostaglandin signaling during actin remodeling. Mol. Biol. Cell. 23, 4567-4578 (2012).
  10. Dorman, J. B., James, K. E., Fraser, S. E., Kiehart, D. P., Berg, C. A. bullwinkle is required for epithelial morphogenesis during Drosophila oogenesis. Dev. Biol. 267, 320-341 (2004).
  11. Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Dev. Cell. 12, 997-1005 (2007).
  12. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nat. Protoc. 2, 2467-2473 (2007).
  13. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, 2207-2215 (2011).
  14. Bianco, A., et al. Two distinct modes of guidance signalling during collective migration of border cells. Nature. 448, 362-365 (2007).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
  16. Kelso, R. J., et al. Flytrap, a database documenting a GFP protein-trap insertion screen in Drosophila melanogaster. Nucleic Acids Res. 32, 418-420 (2004).
  17. Buszczak, M., et al. The carnegie protein trap library: a versatile tool for Drosophila developmental studies. Genetics. 175, 1505-1531 (2007).
  18. Tootle, T. L., Williams, D., Hubb, A., Frederick, R., Spradling, A. Drosophila eggshell production: identification of new genes and coordination by Pxt. PLoS. One. 6, e19943 (2011).
  19. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331, 1071-1074 (2011).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 82, טכניקות איברים תרבות פרופיל ביטוי גנים מיקרוסקופית confocal ביולוגיה של תא מחקר גנטי ביולוגיה מולקולרית פרמקולוגיה, Oogenesis זקיק חי הדמיה ביטוי גנים פיתוח
השירות של שלב ספציפי אמצע לסוף<em&gt; דרוזופילה</em&gt; בידוד זקיק
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Spracklen, A. J., Tootle, T. L. The… More

Spracklen, A. J., Tootle, T. L. The Utility of Stage-specific Mid-to-late Drosophila Follicle Isolation. J. Vis. Exp. (82), e50493, doi:10.3791/50493 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter