Summary
-Fase específica aislamiento de mediados y finales de los folículos de Drosophila es útil para una variedad de propósitos. Estos folículos se desarrollan en la cultura, lo que permite la manipulación genética y / o farmacológicos a acoplar con los ensayos in vitro de desarrollo en y de imagen en vivo. Además, los folículos se pueden utilizar para los estudios moleculares, tales como el aislamiento de ARNm y proteína.
Abstract
Ovogénesis Drosophila o el desarrollo del folículo ha sido ampliamente utilizado para avanzar en la comprensión de los complejos procesos biológicos celulares y de desarrollo. En este trabajo se describen los métodos de cómo aislar folículos etapa a mediados y finales de la etapa (10B-14) y utilizarlos para proporcionar nuevos conocimientos sobre los fenómenos moleculares y morfológicos que ocurren durante las ventanas cerradas de tiempo de desarrollo. Folículos aislados se pueden utilizar para una variedad de técnicas experimentales, incluyendo los ensayos in vitro en desarrollo, de formación de imágenes en vivo, análisis de la expresión de ARNm y análisis de transferencia Western de proteínas. Los folículos en Etapa 10B (S10B) o posterior completarán el desarrollo de la cultura, lo que permite combinar perturbaciones genéticas o farmacológicas con el desarrollo in vitro para definir los efectos de esas manipulaciones en los procesos que ocurren en períodos específicos del desarrollo. Además, debido a que estos folículos se desarrollan en la cultura, que son ideales para los estudios de imágenes en directo, Que a menudo revelan nuevos mecanismos que median los eventos morfológicos. Folículos aislados también se pueden utilizar para los análisis moleculares. Por ejemplo, los cambios en la expresión génica que resultan de perturbaciones genéticas se pueden definir para ventanas de desarrollo específicas. Además, el nivel de proteína, la estabilidad, y / o estado de modificación postraduccional durante una etapa particular del desarrollo del folículo pueden ser examinados a través de análisis de Western blot. Por lo tanto, el aislamiento de la etapa específica de los folículos de Drosophila proporciona una rica fuente de información en muy conservadas procesos de desarrollo y la morfogénesis.
Introduction
Cada ovario de Drosophila se compone de ~ 16 ovarioles, o cadenas de forma secuencial con vencimiento cámaras de huevos o folículos. Cada folículo se compone de un único ovocito, 15 de la línea germinal derivadas células de la enfermera o de apoyo, y ~ 650 células somáticas denominadas células del folículo (Figura 1A). Drosophila ovogénesis se divide en 14 etapas morfológicamente definidas de desarrollo 1. Cada etapa de desarrollo del folículo se observa muchas veces dentro de una sola marcha, por lo que es relativamente fácil de aislar un número sustancial de los folículos etapa específica.
Los mediados y finales de etapas de ovogénesis (Etapas 10B-14) son especialmente adecuados para el aislamiento de fase (Figura 1). En la Etapa 10B (S10B), el folículo está totalmente alargada (es decir, su longitud es igual a la de una etapa 14 (S14) folículo, véase la figura 1 y la figura 2H) y media la longitud del folículo se compone de células de la enfermeramientras que la otra mitad es el ovocito (Figura 1C). En esta etapa las células de la enfermera se someten a la remodelación de actina dramática, el fortalecimiento de la actina cortical y la generación de haces paralelos de filamentos de actina 2. Al mismo tiempo, una población de células del folículo, denominada células centrípetas, migrar entre las células de la enfermera y el ovocito, y dos grupos dorsales de las células del folículo se convierta especificado para someterse a la migración para formar los apéndices dorsales, aparatos respiratorios tubulares para el embrión 3 . Las células de la enfermera después de contrato (S11), apretando sus contenidos citoplasmáticos en el ovocito en un proceso llamado célula nodriza dumping, que proporciona el ovocito con los factores necesarios para que se complete la embriogénesis (Figura 1D). Las células de la enfermera a continuación, se someten a la muerte celular (S12-S13) 4, y las células del folículo secretan y el patrón de la cáscara de huevo 5 (Figuras 1E-G). Por lo tanto, el final de la ovogénesis es rica con un importante desarrollod procesos morfogenéticos.
Folículos aislados entre mediados y finales de etapa (S10B-S14) se puede utilizar para una variedad de propósitos, incluyendo los análisis moleculares. Por ejemplo, ARNm a partir de folículos por etapas puede ser aislado por RT-PCR, microarrays, o los análisis de ARN-ss. Esto le permite a uno a ver la expresión de genes dentro de una ventana de desarrollo a corto, con sólo unos pocos tipos de células presentes, y determinar cómo la expresión génica se cambia por perturbaciones ya sea farmacológicos o genéticos. Aislamiento etapa también se puede utilizar para analizar las proteínas por Western Blot. Este análisis es importante porque permite cuantificar el nivel de expresión de la proteína de tipo salvaje frente a los mutantes en etapas específicas. Si bien se podría utilizar de inmunofluorescencia analiza para lograr resultados similares, la cuantificación de la fluorescencia es menos robusto debido a los requisitos estrictos que todos los píxeles dentro de la gama lineal de detección 6. Además, el análisis de transferencia Western puede proporcionar otra información, tals si la proteína se posttranslationally modificado o se expresa a partir de una isoforma de empalme específico. Etapas aisladas también se pueden usar para una mayor purificación de proteínas, incluyendo fraccionamiento subcelular o coimmunoprecipitation.
Aislamiento folículo Etapa específica también puede ser utilizado para los ensayos in vitro en desarrollo 7 y en vivo de imágenes 8. Aislados folículos S10B-S13 continuarán desarrollando a S14 en medios de cultivo sencillo (ver abajo). Es importante tener en cuenta que los folículos S10A no progresar a través de célula nodriza de dumping utilizando las condiciones de cultivo se analizan en este manuscrito. Hemos utilizado en los ensayos in vitro de desarrollo S10B para definir el papel de las prostaglandinas, tanto farmacológica y genética, en la regulación de la remodelación de la actina utilizando células enfermera dumping y el desarrollo como leer-outs 7,9. Del mismo modo, las etapas posteriores del desarrollo también se pueden aislar para determinar los efectos de los tratamientos farmacológicos o hombre genéticaipulations sobre determinados procesos como la migración centrípeta celular, la migración apéndice dorsal / formación 10, y la muerte celular enfermera. Tales ensayos pueden ser utilizados para realizar pantallas de interacción dominantes o ensayos, por ejemplo, mientras que la heterocigosidad para mutaciones en PXT o Fascin solos no tienen efecto sobre S10B desarrollo in vitro, los folículos de los heterocigotos dobles célula nodriza de exposiciones de dumping defectos y un bloqueo en el desarrollo 9.
Además, debido a S10B-13 puede desarrollarse en la cultura, todos los procesos que tienen lugar durante este tiempo se puede observar por las imágenes en vivo. Esta imagen se puede realizar simplemente usando luz transmitida (si uno está interesado sólo en los cambios en la morfología bruto) o con microscopía confocal utilizando moscas transgénicas que expresan las sondas o los folículos teñidas con tintes de imágenes en directo fluorescentes. Formación de imágenes en vivo se utiliza para avanzar sustancialmente nuestra comprensión de los procesos de desarrollo. De hecho, vivir imaging de los folículos en fase tardía se ha ampliado el conocimiento de la migración apéndice dorsal, un ejemplo de tubulogenesis 10. Esperamos que las imágenes en directo de los procesos finales de etapa adicionales, incluyendo la dinámica de actina durante célula nodriza de dumping, proporcionará nuevos conocimientos sobre estos eventos de desarrollo. Es importante señalar que si bien S10A y las primeras etapas de desarrollo de los folículos no continuarán desarrollando en un S14 en la cultura, en vivo de imágenes de los acontecimientos que ocurren durante esas etapas de desarrollo es posible utilizando condiciones de cultivo alternativos 11-14 (véase la discusión para más información).
Aquí nos proporcionan protocolos detallados para aislar folículos en fase tardía, ya sea para el desarrollo in vitro y vivimos de imágenes, o los análisis moleculares (ARNm y de aislamiento de proteínas).
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Protocol
1. Preparación de Drosophila Antes de la etapa de aislamiento
- Hacer pasta de levadura húmeda combinando 50 g de levadura seca activa con 90 ml de agua destilada. Mezclar con una espátula para mezclar. Dejar reposar la mezcla durante aproximadamente 30 minutos antes de la evaluación de la consistencia. La consistencia debe ser sólo lo suficientemente gruesa como para adherirse a la parte de un vial mosca pero no correr por el lado. Para lograr la consistencia deseada puede ser necesario añadir un máximo de 10 ml de agua adicional o una pequeña cantidad de levadura seca. Almacene en un recipiente tapado a 4 ° C. La levadura almacenada se puede utilizar para ~ 1-2 semanas.
- Reunir <24 hr viejas moscas adultas (hombres y mujeres) de los genotipos deseados y los puso en un vial con comida fly plus pasta de levadura húmeda untado en el lado del vial. La temperatura a la que se mantienen las moscas variará dependiendo del experimento. Para los experimentos de rutina, las moscas se mantuvieron a temperatura ambiente. Considerando que experimentos en los que un gen seestá sobreexpresada usando el sistema de UAS/GAL4 15 de mayo requerir el mantenimiento de las moscas a 25 ° C o superior, según sea apropiado.
- Proporcionar a las moscas con un frotis fresco de pasta de levadura al día durante 2 días. NOTA: A medida que el desarrollo del folículo está estrechamente regulada por el estado nutricional de la mosca hembra, es indispensable proporcionar a la mosca con la rica pasta de levadura de nutrientes durante al menos 36 horas antes de la disección.
2. Aislar a mediados y finales de Staged Drosophila folículos
- Permita que el medio para llegar a la temperatura ambiente (~ 30 min). Si los folículos por etapas van a ser utilizados para los ensayos in vitro de desarrollo en recién preparar medios IVEM (medios de Grace de insectos, 10% de suero bovino fetal inactivado por calor, y 1x penicilina / estreptomicina). Si los folículos por etapas van a ser utilizados para el ARNm o el aislamiento de proteínas usan ya sea de insectos de Grace o medios IVEM. IMPORTANTE: Temperatura del fluido es crítico. Si el medio es el frío que se alteratanto la actina y microtúbulos citoesqueletos y desarrollo del bloque.
- Anestesie las moscas en el vial yeasted mediante la inyección de CO 2 gas y colocar 3-5 moscas hembra en una almohadilla de mosca bajo CO 2. IMPORTANTE: No deje más hembras que pueden ser diseccionado en un período de tiempo de 10 min en la plataforma de la mosca como la exposición prolongada a CO 2 pueden causar esterilidad y la muerte.
- Llenar un pocillo de una placa de 9-punto con los medios de comunicación y colóquelo en la parte superior de una superficie oscura (un pedazo de plexiglás negro funciona bien). Enfoque el microscopio de disección en la parte inferior del pozo.
- Uso # 5 pinzas Dumont recoger una sola hembra con una mano (esto se hace mejor con la mano dominante). A menudo es más fácil de recoger a la hembra por las alas, piernas o tórax a la transición abdomen. Sumerja la mujer en los medios de comunicación llenos también. Ajuste el enfoque del microscopio según sea necesario.
- El uso de un segundo par de pinzas en la mano no dominante, agarra a la hembra en el extremo anterior del abdomende manera que el extremo posterior está posicionado hacia la mano dominante (Figura 2A). Asegúrese de mantener la marcha sumergido en los medios de comunicación.
- Con la mano dominante, utilizar las pinzas para agarrar la cutícula en el segundo segmento pigmentada más posterior y rasgar lejos del resto del abdomen (Figuras 2B-C).
- Usando las pinzas en la mano dominante, apriete suavemente el extremo anterior del abdomen hasta que los ovarios emergen (Figuras 2D-E). Si es necesario, coloque la pinza entre los dos ovarios y sacarlos de la canal.
- Mueva los ovarios para que un nuevo pozo con medio fresco (Figura 2F) o retire el cadáver de una toalla Kimwipe o papel. Esto es particularmente importante si los folículos se están aislados para el desarrollo in vitro.
- Repita hasta que se han aislado de 3-5 pares de ovarios. NOTA: Cada ovario se compone de ~ 16 ovarioles o cadenas de forma secuencial con vencimiento folículos. Cada ovarioleestá contenido dentro de una vaina del músculo.
- El uso de prensas de patas y las agujas suministradas con ellos, tire suavemente aparte del ovario mediante la ejecución de las agujas entre los ovarioles (Figura 2 G). Esto a veces liberar los folículos individuales también.
- Ovarioles individuales y las etapas morfológicas fácilmente distinguibles de desarrollo del folículo ahora debe ser visible (Figura 2G, se separan del ovario). Consulte las Figuras 1 y 2H de las diferencias morfológicas que se pueden utilizar para distinguir las diferentes etapas. Para aislar folículos que están dentro de ovariolas intactas y todavía contenidos dentro de una vaina del músculo, utilizar una aguja para cortar a través de la ovariole en la parte anterior del folículo anterior y en la posterior de la folículo inmediatamente después de la folículo de interés. Esto romperá la vaina del músculo y el folículo de interés lejos ahora se puede cortar lejos de los folículos vecinos sin dañarlo. A medida que se separan las fases individuales, mover los folículos de interés, utilizando una pipeta de vidrio, a un nuevo pozo con medio fresco. Esto es particularmente importante cuando el aislamiento de folículos para el desarrollo in vitro. NOTA: Es importante para exprimir el bulbo de la pipeta antes de entrar en los medios de comunicación para evitar las burbujas de aire de la redistribución de los folículos de interés a lo largo del pozo. Además, si los folículos están pegando a la pipeta de vidrio, la pipeta puede reviste previamente con 3% de albúmina de suero bovino (BSA) pipeteando la solución de BSA arriba y abajo varias veces y enjuague con medios de disección.
- Una vez que suficientes folículos se han aislado, continuar con los experimentos posteriores.
3. Desarrollo in vitro de folículos S10B
- Aislar folículos S10B usando el protocolo de aislamiento de fase (paso 2) en los medios de comunicación IVEM. Asegúrese de que los folículos se mueven rápidamente lejos de los escombros. A medida que estos folículos continuarán madurando, es importante que S10Bs se recogen durante 30-60 minutos y luego se coloca en los medios de comunicación de maduración de elección. NOTA: S10B deben distinguirse cuidadosamente de folículos S10A (Figura 1C comparación con 1B), como folículos S10A no madurarán en los medios de cultivo IVEM. En tanto S10A y S10B folículos, la mitad de la longitud se compone de células de la enfermera y la otra mitad es el ovocito, pero en S10B la longitud del folículo es igual a la de los folículos S14.
- Usando una pipeta de vidrio, mover ~ 30 folículos S10B en un pocillo de una placa de cultivo tisular de 24 pocillos. NOTA: Asegúrese de verificar que todos los folículos que se transfieren son S10B y no han madurado hasta S11.
- Preparar 1 l de media maduración por pozo, es decir, los medios de comunicación IVEM más reactivos farmacológicos.
- Usando una pipeta de vidrio tirado *, eliminar la mayor cantidad de medios desde el pozo (paso 3.2) como sea posible, y rápidamente agregar medios maduración de elección. NOTA: Es imprescindible el uso de un pip vidrio tiradoette como folículos por etapas puede ser fácilmente absorbido tanto con pipetas de vidrio o puntas de pipeta con una Pipetman.
* Para hacer pipetas tirados: 1) calentar la parte delgada de largo, pipetas de vidrio en la llama de un mechero Bunsen sólo hasta que el cristal comienza a ablandarse, 2) pasar de inmediato la pipeta de la llama y tire horizontalmente para dibujar la pipeta en un tubo fino, 3) romper para generar un punto fino. PRECAUCIÓN: Use protección para los ojos como fragmentos de vidrio pueden volar. - Repita los pasos 3.1 a 3.4 para tantos pozos como el experimento requiere.
- Permitir a los folículos a desarrollar durante> 10 h, y la puntuación de la progresión en el desarrollo bajo un microscopio de disección. NOTA: Los experimentos suelen ser marcados al día siguiente para dar tiempo suficiente para que los folículos se desarrollen. S10B es de ~ 5 horas, S11 es de ~ 30 min, S12 es de ~ 2 h, y S13 es de ~ 1 hora de duración a 25 ° C 1 y desarrollo a temperatura ambiente tardará un poco más. Experimentos similares al descrito para los folículos pueden ser S10Brealizado utilizando folículos S11-S13.
4. Etapa Aislamientos para imágenes en vivo
- Aislar los folículos en fase tardía (S10B-14) que expresa el marcador fluorescente de elección mediante el protocolo de aislamiento etapa (etapa 2) en los medios de comunicación IVEM, moviéndose rápidamente folículos lejos de los escombros.
- Mueva los folículos de interés en nuevos medios de comunicación y luego transferir mediante una pipeta de vidrio a una placa de Petri de fondo cubreobjetos. Tenga cuidado al añadir los medios para que las burbujas en la zona del fondo cubreobjetos pero no se derrame sobre.
- Para películas a intervalos más largos, a veces es necesario para mantener la humedad dentro de la placa de Petri mediante la adición de un enrollado Kimwipe, humedecido con agua, hasta el borde interior de la placa de Petri. Coloque la tapa en la parte superior.
- Imagen de un microscopio invertido. Resolución detallada requerirá la microscopía confocal. Es necesario para equilibrar la frecuencia de formación de imágenes, la fuerza de la iluminación, y la longitud de proyección de imagen; este tendrá que ser trabajado de forma independiente para cada Lherramienta Abeling y el proceso de desarrollo.
5. Etapa de aislamiento para la Preparación de ARNm
- Aislar folículos individuales de cada etapa usando el protocolo de aislamiento de fase (paso 2) con cualquiera de los medios de Grace o IVEM.
- Usando una pipeta de vidrio, mover las etapas individuales de interés en nuevos pozos con medios de comunicación, sino que es posible recoger múltiples etapas a la vez.
- Mantenga horarios de recogida en el punto 1 hr. Mover los folículos, usando una pipeta de vidrio, a 1,5 ml de tubos de microfuga.
- Haga girar el tubo brevemente en un mini-microcentrífuga para sedimentar todos los folículos. Usando una pipeta de vidrio tirado (véase el paso 3.4) retire con cuidado todos los medios de comunicación. NOTA: Si utiliza una microcentrífuga a tamaño completo, centrifugar los folículos a baja velocidad.
- Añadir 100 l de Trizol y moler a mano durante ~ 20 s utilizando un mortero plástico. Haga girar hacia abajo a toda velocidad en una microcentrífuga y mover Trizol a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con cuidado de no tocar ninguna d peletizadoebris. Almacenar a -80 ° C.
- Repita los pasos 5.1 a 5.5 hasta que haya suficientes folículos se han obtenido para el experimento. Rutinariamente, ~ 75 S10B, ~ 75 S12, y S14 ~ 100 ~ folículos dió 10 g de ARN.
- Descongele las muestras en hielo. Combine las muestras, según el caso, en un tubo de microcentrífuga y llevar el volumen Trizol hasta 800 l. Proceda con el aislamiento de ARN como lo indique el fabricante. IMPORTANTE: Recuerde que debe tratar la DNasa ARN aislado con RNasa libre de DNasa.
6. Etapa de aislamiento para el Western Blot
- Precaliente un bloque de calor a 100 ° C.
- Aislar folículos individuales de cada etapa usando el protocolo de aislamiento de fase (paso 2) con cualquiera de los medios de Grace o IVEM. NOTA: Es necesario determinar empíricamente la cantidad de un folículo etapa particular se necesitan para observar cada proteína específica. Para las proteínas altamente expresadas 1-3 folículos / pocillo S10B es suficiente para ver una señal fuerte en un western blot. Sin embargo, es importante hacer unamuestra representativa, teniendo folículos de varias hembras. De este modo, 15-20 folículos de una etapa particular se recogen por lo general.
- Mueva folículos, usando una pipeta de vidrio, a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Haga girar brevemente en un mini-microcentrífuga para sedimentar los folículos (véase el paso 5.4). Retire con cuidado todos los medios de comunicación utilizando una pipeta de vidrio tirado (véase el paso 3.4) y añadir 50 l de PBS 1x y 50 l de tampón Laemmli 2x.
- Triturar con la mano durante aproximadamente 20 segundos con una mano de mortero de plástico. NOTA: las majas de plástico pueden ser reutilizados para la molienda de muestras occidentales por el lavado y la esterilización en autoclave ellos.
- Hervir las muestras durante 10 min en el bloque de calor.
- Chill brevemente en hielo y centrifugar a toda velocidad durante 15 segundos en una microcentrífuga. Cualquiera de cargar inmediatamente en un gel de SDS-PAGE o almacenar a -20 ° C. NOTA: Si se almacenan las muestras, recuerde que debe recalentar las muestras antes de la carga en el gel.
- Realizar análisis de Western blot siguiendo protocolos estándar.
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Representative Results
Cuando el aislamiento de etapas específicas de desarrollo del folículo de Drosophila que es esencial para ser capaz de distinguir con precisión las diferentes etapas morfológicas. Esto es algo difícil para S10A y S10B, como las células de la enfermera y el ovocito cada uno ocupan la mitad de la longitud del folículo en estas etapas (Figura 1B comparó a 1C). Sin embargo, los folículos S10A son más cortos en longitud que los folículos S10B, como los folículos S10B están completamente alargados y, por tanto igual en longitud a un folículo S14 (Figura 1C en comparación con 1G). Además, un subconjunto del folículo o células somáticas sobre el ovocito llamado células del folículo centrípetas comienzan a migrar entre las células de la enfermera y el ovocito en S10B. Durante S10B, que toma ~ 5 h, las células de la enfermera se someten a la remodelación de la actina dinámica para que en S11 contrato células de la enfermera, apretando sus contenidos citoplasmáticos en el ovocito. Por lo tanto en S11, la región de células enfermera tienedisminuido significativamente, mientras que el ovocito se ha expandido (Figura 1D). En S12, las células de la enfermera comienzan a sufrir la muerte y tomar una apariencia más opaca (Figura 1 E), curiosamente, en la cultura, los restos celulares enfermera dorsalmente rizo en los folículos S12 (S12 ver en las figuras 3C'-D '). Durante S13, la región célula nodriza es transparente como se está completando la muerte celular, y se está produciendo la formación de apéndice dorsal (Figura 1F). Por S14 sólo el ovocito y las células de los folículos se mantienen, y la formación de apéndice dorsal es completa (Figura 1G).
El ensayo in vitro de desarrollo en se puede utilizar para evaluar las consecuencias de los diversos tratamientos farmacológicos y mutaciones genéticas en el desarrollo y S10B célula nodriza dumping (Figura 3). El desarrollo de S10Bs en la cultura es robusto, sin embargo, un número de factores que pueden conducir a resultados experimentales pobres. En la figura 3A,Se proporcionan datos experimentales, tanto desde el éxito y un experimento fallido. Un experimento exitoso es uno en el que el 80-100% de los folículos de tipo salvaje en los medios de control de células enfermera completa dumping y el progreso a S12-14 (Figura 3A, en peso 1). De vez en cuando los controles de tipo salvaje fallará, lo que significa que menos del 80% de los folículos a desarrollar (Figura 3A, en peso 2). Este fallo puede ser causada por una serie de cuestiones que incluyen:. 1) incapacidad para distinguir S10A de folículos S10B (refiérase a las Figuras 1 y 2), 2) problemas de los medios de comunicación (temperatura, edad, etc), y / o 3) los folículos eran expuestos a los desechos durante demasiado tiempo.
Desarrollo in vitro de S10Bs se puede utilizar en combinación con el tratamiento farmacológico. Para estos experimentos, es importante que los controles de drogas, es decir, el tratamiento de los folículos de tipo salvaje con el fármaco, se llevan a cabo con cada experimento debido a la eficacia del fármaco y / o concentration puede cambiar con el tiempo. Para los experimentos farmacológicos, es conveniente para analizar la relación entre el porcentaje de folículos en desarrollo en el tratamiento de la droga para que en los medios de control; esto controla para ligeras diferencias de fondo genético. A menudo es útil para tratar con la concentración IC50 de la droga, lo que es la concentración que bloquea el 50% de los de tipo salvaje (yw) folículos de someterse célula nodriza dumping y un mayor desarrollo. . Por lo tanto, se espera que la proporción de folículos de tipo salvaje a ser de 0,5 (Figura 3B, drogas 1) Figura 3B es un ejemplo de cómo un fármaco (aspirina) puede llegar a ser demasiado concentrada (de drogas 2; probablemente debido a la evaporación del disolvente) y el bloque mayor que 50% de los folículos de tipo salvaje de desarrollo. Para ilustrar aún más el ensayo de desarrollo in vitro, se proporcionan imágenes de dos pozos de desarrollo folículos S10B. Figuras 3C y D ilustran los folículos S10B al comienzo de laensayo, en el control o tratado con aspirina (~ 2 mM) medios de comunicación. Figuras 3C 'y D' ilustran el final del ensayo, revelando que la mayoría de los folículos tratados de control desarrollados a S14, mientras que la mayoría de los folículos tratados con aspirina no tiene célula nodriza completado dumping.
El ensayo in vitro de desarrollo en también se puede utilizar para la detección de antecedentes genéticos que son más sensibles a un fármaco en particular. Figura 3E contiene dos ejemplos de esto. En el primer ejemplo, el fondo genético (expt1, barra azul) falla para interactuar con la aspirina como la relación sigue siendo ~ 0,5, por el contrario, en el segundo ejemplo, el fondo genético (expt2, barra roja) aumenta el efecto de la aspirina. Por lo tanto, el ensayo in vitro de desarrollo en se puede utilizar para definir las consecuencias de las mutaciones y reactivos farmacológicos sobre los eventos de desarrollo y morfológicos que ocurren durante finales de la ovogénesis; adicionalmente, el ensayo se puede utilizar para evaluar tanto farmacológico y las interacciones genéticas (ver 9).
Etapa de aislamiento también se puede utilizar para imágenes en vivo de los procesos de desarrollo. Figura 4 es un ejemplo de una película de lapso de tiempo de un folículo S10B expresar utrofina-GFP, el dominio de unión a actina de la utrofina humana fusionado a la proteína fluorescente verde. El uso de esta herramienta de imagen, la formación de haz de actina y la condensación se puede visualizar. Muchas herramientas están disponibles para imágenes en vivo, incluyendo atrapar proteínas líneas transgénicas 16,17, UAS impulsadas fluorescente etiquetados marcadores de orgánulos (mitocondrias, aparato de Golgi, retículo endoplásmico, etc.), UAS impulsadas fluorescente etiquetados marcadores citoesqueleto (proteínas de unión a actina y actina, microtúbulos y proteínas de unión a los microtúbulos), líneas transgénicas que expresan cualquier etiquetados fluorescentemente proteína de interés, y colorantes vitales (Rojo Nilo etiquetas de lípidos neutros, etiquetas Edu replicación de ADN, FM4-64 etiquetas membranas).
ove_content "> Los análisis moleculares se pueden realizar utilizando etapas aisladas de los folículos de Drosophila. Para el análisis de proteínas por Western Blot, es necesario determinar empíricamente la cantidad de folículos, de una etapa particular del desarrollo, están obligados a observar la proteína de interés. Figura 5 es un ejemplo de cómo se diluye secuencialmente un lisado de proteína concentrada para determinar el número de folículos S10B necesarios para observar una proteína particular, Fascin. En este caso un folículo S10B es suficiente para observar esta proteína mediante inmunotransferencia de tipo Western.
Figura 1. Diagrama que describe la composición celular de los folículos de Drosophila y las imágenes que ilustran la diferencia morfológica entre mediados y finales de etapa Drosophila follicles. A. Diagrama que representa la composición celular de un folículo S10A. BG. Imágenes representativas de los folículos S10A-S14 Drosophila tomadas con una disección estéreo alcance. El folículo Drosophila se compone de 16 células de la línea germinal derivado: 1 ovocito (rojo, A) y 15 enfermeras de apoyo o células (amarillo, A), que están rodeadas por ~ 650 células epiteliales derivadas somáticamente-(blanco, magenta y cian, A ). En S10A, la mitad de la longitud del folículo se compone de las células de la enfermera (soporte de amarillo, B), que están cubiertas por las células del folículo tramo (magenta en A), y la otra mitad se compone del ovocito (asterisco rojo , B), que está cubierto por las principales células del folículo del cuerpo (blancas en A). En S10B, las células de la enfermera (escuadra amarilla, C) y ovocitos (asterisco rojo, C) cada componen la mitad de la le-ngth del folículo, sin embargo, la longitud total del folículo es ahora igual a la de un folículo S14 (comparar C a G). Durante S11, las células de la enfermera (soporte amarillo, D) aprietan rápidamente sus contenidos citoplasmáticos en el ovocito de alargamiento (asterisco rojo, D) en un / proceso de miosina dependiente de actina denomina célula nodriza dumping. Por S12, el ovocito (asterisco rojo, E) se ha alargado plenamente como célula nodriza dumping restos completos y solamente teléfonos enfermera permanecen (soporte amarillo, E). Los restos de células enfermera (soporte amarillo, F) la muerte celular completa en S13. S14 representa el folículo totalmente madura, que se compone del ovocito (asterisco rojo, G), células somáticas, y la cáscara del huevo, incluyendo los apéndices dorsales (flechas blancas, G). B. Barra de escala = 0,1 mm.
Figura 2. Imágenes proporcionar una visión general de la disección de ovario y el aislamiento del folículo. A. sumerja la marcha en los medios de disección y orientarlo de manera que se lleva a cabo, por el fórceps, en la mano no dominante. B. Uso de la mano dominante, agarre la cutícula en la parte posterior del abdomen. C. Tire de la cutícula apagado, exponiendo los ovarios (flecha amarilla). D. Trabajando desde la parte anterior del abdomen hacia la parte posterior, apriete suavemente el abdomen liberación de los ovarios (flecha amarilla). E. Separe los ovarios (flecha amarilla) desde cualquier cutícula restante (punta de flecha roja) y / o los órganos internos (puntas de flecha blancas). F. Transferencia de los ovarios aislados a un nuevo máximo de medios de disección así que contengan. G. desmenuzar los ovarios, el uso de agujas de disección, para exponer indifolículos individuales (compare ovario intacto (arriba) para ovario separado (parte inferior). Blancas punta de flecha a un folículo S10B apuñalado, un ejemplo de un folículo que no debe ser utilizado para los experimentos posteriores. H. Seleccione las etapas morfológicas de interés (Etapas 10A -14 (S10A-S14) se muestra).
Figura 3. Ejemplos de ensayos in vitro de desarrollo en. A. Gráfico del porcentaje de S10B folículos que el desarrollo total de la cultura. en peso 1 es un ejemplo de desarrollo esperado de tipo salvaje folículos S10B (96% en desarrollo), mientras que en peso 2 es un ejemplo de un pobre desarrollo de la cultura (68% en desarrollo). Generalmente Nos descartamos todo el experimento si el desarrollo de los de tipo salvaje folículos S10B en los medios de control está por debajo de 80%. B. 50 para la aspirina para el desarrollo porcentaje en los medios de control. El IC 50 es la concentración que bloquea el 50% de los folículos S10B de desarrollo; Esto significa que el valor de tipo salvaje debe ser ~ 0,5. Drogas 1 es un ejemplo de la relación de tipo salvaje esperado (0,52), mientras que las drogas 2 es un ejemplo de lo que ocurre cuando la concentración del fármaco es demasiado fuerte (0,37). CD ". Imágenes de vitro pozos de desarrollo en. CC '. Control tratada. DD '. tratado con aspirina (~ 2 mM). de CD. Imagen de la S10Bs al comienzo del ensayo. C'-D'. Imagen de los folículos en el punto final del ensayo. Control tratados folículos S10B desarrollan a S14s en cultivo (C '), mientras que la mayoría de los folículos tratado con aspirina no llega a completar célula nodriza dumping (D').
Figura 4. Ejemplo que muestra el uso de aislado S10B folículos para imágenes en vivo. AF. Proyecciones Máximo de 3 rebanadas de time-lapse z-pilas de un folículo S10B aislado de Utrofina :: GFP moscas transgénicas que expresan (sqh-Utrofina :: GFP). A'-F '. Inserciones ampliadas resaltar la celda de la enfermera de A- F. AF '. F-actina (Utrofina :: GFP), blanco. A, A'. Tiempo (t) = 0 min. B, B '. T = 20 min. C, C'. T = 40 min. D, D '. t = 60 min. E, E'. t = 80 min. F, F '. t = 100 min. En el punto de tiempo inicial, los filamentos de actina cortos se pueden observar que se extiende hacia el interior desde las membranas celulares enfermera (A, A '). Estos filamentos de actina se alargan a lo largo de los primeros puntos de tiempo (antes de Cristo 'en comparación con A, A') hasta que estén completamente alargada (D, D '). En los puntos más adelante, estos filamentos de actina completamente alargadas entonces se acortan y se condensan en toda célula nodriza dumping (EF) A. Barra de escala = 50 m. A '. Barra de escala = 10 micras.
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.. Figura 5 Ilustración de la forma de determinar el número de folículos necesarios para examinar una determinada proteína por Western blot Este es un western blot mirando expresión Fascin en los folículos S10B (1:20, 7C sn, Cooley, L.; Estudios del Desarrollo Banco hibridoma (DSHB), desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Biología, Iowa City, IA, 52242). Los números en la parte superior representan el número aproximado de folículos S10B cargados por carril.
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Discussion
El folículo Drosophila se compone de sólo un pequeño número de tipos de células, por lo que es ideal para el estudio morfológico y análisis moleculares. Además, debido a la estructura del ovario, es relativamente fácil de obtener un gran número de etapas específicas de desarrollo del folículo con un microscopio de disección común y una formación mínima. A medida que cada etapa representa una ventana temporal corto, aislamiento etapa puede proporcionar conocimientos moleculares importantes en los procesos de desarrollo que ocurren durante esa etapa. Por ejemplo, hemos utilizado el aislamiento fase folículo mediados o finales para caracterizar los cambios en la expresión de genes que ocurren durante S10B, S12, S14 y 18. Este análisis sugiere una serie de genes previamente caracterizados son susceptibles de contribuir al desarrollo del folículo y, en particular, la formación, la cáscara de huevo.
Aislamiento etapa puede proporcionar ideas dramáticas en eventos morfológicos a través de imágenes en directo. Tal formación de imágenes puede realizarse en al l etapas de desarrollo del folículo de Drosophila. Aunque el foco de este trabajo es S10B-14, los lectores pueden consultar los siguientes artículos para vivir de imágenes de las etapas anteriores: germarium 13, folículo de elongación 19, y de la etapa 9 11,12,14. Las condiciones de cultivo utilizadas en estos estudios son distintos de los descritos en este trabajo. Específicamente, estos estudios utilizaron de Schneider Insecto de medios con niveles variables de FBS (2,5-15%), así como la adición de insulina 11-13,19 y, en algunos casos, la adición adicional de trehalosa, metopreno, 20-hidroxiecdisona, y adenosina desamidasa 14. Es importante señalar que estos estudios de imagen en vivo han avanzado significativamente nuestra comprensión de los acontecimientos que ocurren durante estas etapas tempranas del desarrollo. Sin embargo, estos folículos en fase inicial no pueden progresar todo el camino hasta la etapa final del desarrollo del folículo, S14. Por el contrario, S10B-13 se desarrollará a S14 en la cultura.
ove_content "> Durante S10B-S14 muchos procesos morfológicos ocurren que pueden ser estudiados por la imagen en vivo. Por ejemplo, las imágenes en directo se puede utilizar para examinar el proceso de célula nodriza dumping, el proceso por el cual las células de la enfermera exprimen sus contenidos citoplasmáticos en el ovocito para dotarla de todo lo necesario para completar la embriogénesis. celular Enfermera vertido se puede observar por time-lapse usando luz transmitida 7 o por la imagen confocal utilizando líneas transgénicas que expresan marcadores fluorescentes (ver Figura 4). El uso continuo de imágenes en vivo se espera que proporcionar nuevos conocimientos sobre la dinámica necesaria para la célula nodriza vertido citoesqueleto. Live-proyección de imagen de las etapas posteriores también ha avanzado nuestra comprensión de la dorsal apéndice migración primordios y tubulogenesis 10.En el desarrollo in vitro de folículos S10B-S13 se puede utilizar para definir los efectos de ambos reactivos farmacológicos y manipulaciones genéticas en los procesos ocurrirsonar durante este tiempo. Hemos utilizado en el desarrollo in vitro de folículos S10B para establecer el papel de las prostaglandinas en la regulación de células enfermera vertido 7. Posteriormente hemos estado utilizando este ensayo para llevar a cabo una pantalla farmacológico-interacción, en concreto, hemos estado probando si la pérdida de una copia de un regulador de actina aumenta o suprime la célula nodriza vertido defectos debidos a la pérdida de las prostaglandinas. Esta pantalla se ha puesto de manifiesto una serie de objetivos de abajo putativos (9 y Spracklen, Meyer y Tootle, datos no publicados). El ensayo también puede utilizarse para examinar las interacciones genéticas mediante la evaluación de los defectos del desarrollo, tales como un bloque en la celda enfermera dumping, debido a la heterocigosidad para dos factores diferentes (para un ejemplo de este ver 9).
Mientras que el aislamiento entre mediados y finales de etapa folículos Drosophila es un proceso bastante simple, hay una serie de factores críticos para el éxito óptimo. En primer lugar, la preparación de las moscas esmuy importante. Lo mejor es mantener diferentes genotipos de moscas en un estado lo más parecido posible, es decir, el número de moscas por vial, la proporción de mujeres a hombres (relación 2:1 es ideal), y proporcionar, levadura fresca y húmeda constantemente. La alimentación (de levadura húmeda) y el tiempo de disección alterarán la prevalencia de las diferentes etapas de desarrollo. Hemos encontrado que cuando las moscas se alimentan constantemente en la mañana, más S10Bs se pueden aislar de la mañana, mientras que más S12 están presentes en la tarde. Un segundo factor crítico es los medios de comunicación. Para el desarrollo in vitro e imágenes en vivo es esencial para preparar los medios de comunicación IVEM frescas. Además, los medios de comunicación deben llegar a la temperatura ambiente como medios fríos alterarán los citoesqueletos, tanto actina y los microtúbulos, y por lo tanto, interrumpir el desarrollo adicional. También es importante para mantener los folículos expuestos a la suciedad. A veces, durante la disección, el intestino va a salir con los ovarios. Hemos encontrado que si el intestino se rompey los folículos se mantienen en los medios contaminados, los folículos son poco probable desarrollar en cultivo. Como los folículos continúan desarrollándose en cultivo, es esencial volver a verificar la puesta en escena después de la disección antes de proceder con el desarrollo, ya sea in vitro o análisis moleculares. Por último, es importante disponer de controles adecuados para los experimentos. Para el desarrollo in vitro, es necesario el uso de los folículos de tipo salvaje para probar que los medios de comunicación permite para el desarrollo normal (80-100% de células enfermera completa dumping), y para probar que los reactivos farmacológicos actúan como era de esperar (véase la Figura 3).
En conclusión, el aislamiento de mediados y finales de los folículos etapa Drosophila puede proporcionar información valiosa sobre los procesos de desarrollo a través de una variedad de técnicas experimentales.
Tabla de Reactivos y Equipos:
| Nombre del reactivo | Empresa | GatoALOGUE número | Comentarios (opcional) |
|---|---|---|---|
| La levadura seca activa | Genesee Científico | 62-103 | Cualquier fuente de levadura seca activa está bien |
| De Grace insectos Medios | Lonza | 04-457f | |
| Inactivado por calor, suero bovino fetal | Atlanta Biologicals | S11050H | Cualquier FBS inactivado por calor debe trabajar |
| 10x Pen / Strep | Gibco / Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Prensas y agujas | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Placa para comer, Nine Bueno | Corning | 7220-85 | |
| # 5 pinzas Dumont | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 placas de pocillos múltiples | Becton Dickinson | 35 3226 | Cualquiera 24-así placa de cultivo tisular debe trabajar |
| Cubreobjetos platos de fondo (35 mm) | MatTek Corporación | P35G-1.0-14-C | Cubreobjetos espesor dependerá del microscopio / objetivo está utilizando |
| Pipetas de vidrio | Corning | 7095B-5x (para la transferencia de los folículos) 7095B-9 (para la producción de pipetas tirados) | |
| Maja muestra (1,5 l; RNasa / DNasa) | Productos Investigación Internacional | 199228 | Cualquier mano de mortero plástico que se coloca 1.5 tubos de microcentrífuga mu l se puede utilizar |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
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Disclosures
No hay nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a Thomas Lecuit (sqh-line Utrofina :: GFP), la Bolsa de Centro de Bloomington y el hibridoma Estudios del Desarrollo del Banco para los reactivos. Agradecemos además a todos los miembros del Laboratorio Tootle útil para los debates y las críticas del manuscrito. La financiación de la National Science Foundation fondos iniciales de la anatomía y el Departamento de Biología Celular MCB-1158527, y de la Universidad de Iowa apoya este trabajo. Institutos Nacionales de la Salud Predoctorales de Formación Grant en Farmacológica Ciencias T32GM067795 apoyaron AJS. Soporte de almacenamiento de datos fue proporcionada por la ICTS, que se financia a través de la CTSA apoyado por el Centro Nacional para Recursos de Investigación y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias de traslación, Institutos Nacionales de Salud, a través de Grant UL1RR024979.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Active Dry Yeast | Genesee Scientific | 62-103 | Any source of Active Dry Yeast is fine |
| Grace’s Insect Media | Lonza | 04-457F | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11050H | Any Heat Inactivated FBS should work |
| 10x Pen/Strep | Gibco/Invitrogen | 15140-122 | |
| Pin Vises and Needles | Ted Pella, Inc. | 13561-10 | |
| Spot Plate, Nine Well | Corning | 7220-85 | |
| #5 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| 24 multi-well plates | Becton Dickinson | 35 3226 | Any 24-well tissue culture dish should work |
| Coverslip Bottom Dishes (35mm) | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Coverslip thickness will depend on the microscope/objective being used |
| Glass pipettes | Corning | 7095B-5x (for transferring follicles) | |
| Glass pipettes - long | Corning | 7095B-9 (for producing pulled pipettes) | |
| Sample pestle (1.5 μl; RNase/DNase free) | Research Products International | 199228 | Any plastic pestle that fits 1.5 μl microfuge tubes can be used |
| Trizol | Invitrogen | 15596-018 |
References
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