Summary
बुढ़ापा रोकता है या tumorigenesis के विवादास्पद बनी हुई है को बढ़ावा देता है. Chemotherapeutical दवाओं senesce को कैंसर कोशिकाओं को उत्पन्न कर सकते हैं, वार्धक्य का अध्ययन नए उपचारों के प्रस्ताव के लिए आवश्यक है. हालांकि, मानक और मोटे तौर पर इस्तेमाल β-galactosidase परख प्रमुख कमियां प्रस्तुत करता है. हम यहाँ बुढ़ापा यों के लिए एक तेजी से और संवेदनशील प्रवाह cytometry आधारित परख का प्रस्ताव.
Abstract
मानव कोशिकाओं को अनिश्चित काल के लिए पैदा करना नहीं है. बाहरी और / या आंतरिक संकेतों पर, कोशिकाओं को मरने या बुढ़ापा नामक एक स्थिर सेल चक्र गिरफ्तारी दर्ज कर सकता है. ऐसे telomere छोटा और mitogenic ओंकोजीन के असामान्य अभिव्यक्ति के रूप में कई सेलुलर तंत्र, बुढ़ापा कारण दिखाया गया है. बुढ़ापा सामान्य कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है, कैंसर कोशिकाओं को भी senesce करने के लिए सूचित किया गया है.
Chemotherapeutical दवाओं कैंसर कोशिकाओं में बुढ़ापा प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है. हालांकि, यह बुढ़ापा रोकता है या tumorigenesis बढ़ावा देता है कि क्या विवादास्पद बना हुआ है. यह अंत में रोगी विशेष हो सकता है, कैंसर सेल में वार्धक्य का आकलन करने के लिए एक तेजी से और संवेदनशील विधि जल्द ही आवश्यक हो जाएगा.
यह अंत करने, मानक β-galactosidase परख, वर्तमान में इस्तेमाल किया विधि, प्रमुख कमियां प्रस्तुत करता है: यह समय लेने वाली और संवेदनशील नहीं है. हम यहाँ लिस्ट में बुढ़ापा अध्ययन करने के लिए एक प्रवाह cytometry आधारित परख का प्रस्तावकोशिकाओं ve. यह परख संवेदनशील, तेजी से होने का लाभ प्रदान करता है, और विभिन्न सेलुलर मार्कर के immunolabeling के लिए युग्मित किया जा सकता है.
Introduction
जल्दी साठ के दशक और हेफिलिक और Moorhead द्वारा इसकी खोज के बाद से, बुढ़ापा अभी भी एक सेलुलर जिज्ञासा 1 बनी हुई है. मानव कोशिकाओं को अनिश्चित काल के लिए बुढ़ापा द्वारा, हेफिलिक और Moorhead उम्र बढ़ने के सेलुलर प्रक्रिया गढ़ा, पैदा करना और नहीं है. बुढ़ापा सेलुलर मौत के लिए विरोध के रूप में कोशिकाओं metabolically सक्रिय रहते हैं, जिसमें एक स्थिर सेल चक्र गिरफ्तारी है. Telomere छोटा, डीएनए की क्षति, क्रोमेटिन गड़बड़ी, और mitogenic ओंकोजीन के असामान्य अभिव्यक्ति 2: तिथि करने के लिए, चार सेलुलर तंत्र वार्धक्य प्रेरित करने के लिए दिखाया गया है. यह है कि सामान्य कोशिकाओं को न केवल इंगित करता है, लेकिन यह भी कैंसर कोशिकाओं वार्धक्य 3 गुजरना करने में सक्षम हैं. तथ्य की बात के रूप में, बुढ़ापा दौर से गुजर कैंसर की कोशिकाओं को आगे ट्यूमर प्रगति 4-5 के लिए एक बाधा का गठन करने के लिए दिखाया गया. हालांकि, कई रिपोर्टों अब कुछ निश्चित परिस्थितियों में, सेलुलर senescence भी द्रोह 6-7 प्रोत्साहित कर सकते हैं, कि बाहर बताया है. कैंसर सेल का बुढ़ापा पढ़ रही हैरास वर्तमान chemotherapeutic दवाओं विट्रो में बल्कि विवो 8 में न केवल कैंसर कोशिकाओं की वार्धक्य को जन्म दे सकता है इस्तेमाल के रूप में कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में एक से आग्रह करता हूं बनने के बारे में है.
वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए जांच करने के लिए मास्टर परख अम्लीय पीएच पर β-galactosidase परख है. इस histochemical परख सबसे वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं में होने वाली लाइसोसोमल जीवजनन में वृद्धि को दर्शाता है. संक्षेप में, कोशिकाओं को लागू एक्सोजेनस एक्स लड़की, एक नीले रंग 9 को जन्म दे रही है, वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की लाइसोसोम में समृद्ध β-galactosidase द्वारा cleaved है. नीले वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं को फिर एक उज्ज्वल क्षेत्र खुर्दबीन के नीचे मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. बहुत लोकप्रिय है, β-galactosidase परख प्रमुख कमियां प्रस्तुत करता है. सबसे पहले, इस परख तय कोशिकाओं पर किया जाता है. यह एक खुर्दबीन के नीचे वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की संख्या काफी अधिक संख्या की गणना के द्वारा बुढ़ापा की डिग्री यों तात्पर्य दूसरा, क्योंकि यह समय लगता है. तीसरा, इस परखवृद्ध होनेवाला और गैर वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के बीच भेदभाव पूरी तरह से पर्यवेक्षक पर निर्भर करता है के रूप में संवेदनशील नहीं है.
हम यहाँ रहते वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए मूल्यांकन करने के लिए एक unexploited, त्वरित, और संवेदनशील cytometry आधारित परख चर्चा की. यह परख एक झिल्ली पारगम्य अणु की hydrolysis, 5 dodecanoylaminofluorescein Di-β-डी galactopyranoside (सी 12 FDG) पर आधारित है, β-galactosidase से वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं में समृद्ध बनाया. Hydrolysis और लेजर उत्तेजना के बाद, सी 12 FDG हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है और इसलिए प्रवाह cytometry 10, 11 से पता लगाया जा सकता है. प्रवाह के माध्यम से वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के तेजी से और संवेदनशील होने का महान लाभ प्रदान करता है. इसके अलावा, प्रवाह cytometry से वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के अन्य सेलुलर मार्करों का पता लगाने के साथ मिलकर किया जा सकता. यह परख कीमोथेरपी के साथ इलाज कैंसर कोशिकाओं की आबादी के भीतर वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और नियमित रूप से निर्धारित किया जा सकता हैऊपर ऊतक वर्गों पर, सेलुलर हदबंदी के बाद, क्लिनिक में.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C12FDG, Bafilomycin ए 1, और सेल संस्कृति की तैयारी
- 20 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में सी 12 FDG पाउडर भंग. -20 डिग्री सेल्सियस पर अशेष और दुकान DMSO के उपयुक्त सुरक्षा शर्तों के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए.
- 0.1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए DMSO में bafilomycin A1 का पाउडर भंग. पर विभाज्य और दुकान - 20 डिग्री सेल्सियस Bafilomycin उचित सुरक्षा शर्तों के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए.
- 37 में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% एंटीबायोटिक दवाओं, डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 युक्त मीडिया में, RPMI 8226 सेल लाइन, या पक्षपाती या नहीं अन्य सेल लाइनों खेती. प्रयोग के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या का अनुमान है. प्रवाह cytometry विश्लेषण के दौरान की घटनाओं का एक पर्याप्त संख्या में रिकॉर्ड करने के लिए, 5 x 10 5 कोशिकाओं की आवश्यकता होती है. वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए, तीन सेल के नमूने की आवश्यकता है: unlabeled नमूना, अनुपचारित कोशिकाओं सी 12 FDG के साथ दाग, इलाज कोशिकाओं के साथ दागसी 12 FDG.
- कोशिकाओं सेलुलर प्रसार की अवस्था के प्रवेश चरण में हैं कि इतने बीज कोशिकाओं 24 घंटा पहले प्रयोग का प्रदर्शन.
2. बुढ़ापा की प्रेरण
- एक chemotherapeutical दवा जोड़कर कैंसर कोशिकाओं की बुढ़ापा प्रेरित. दवा एकाग्रता और इलाज की अवधि का परीक्षण सेल प्रकार के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. के बारे में 10 6 कोशिकाओं / एमएल कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए 50 एनएम डॉक्सोरूबिसिन के अंतिम एकाग्रता में एक 48 घंटे के उपचार के साथ शुरू करो. (नकारात्मक नियंत्रण) अनुपचारित नमूना शामिल करने के लिए मत भूलना.
3. Bafilomycin A1 का उपचार
- पिछले चरण में इस्तेमाल किया chemotherapeutical दवा सेल apoptosis को जन्म दे सकता है, के रूप में trypan नीले (v / v) के साथ मिश्रण कोशिकाओं द्वारा सेल व्यवहार्यता की जाँच करें. एक Malassez चेंबर में भरें और नीले रंग की कोशिकाओं (मृत कोशिकाओं) का और सफेद कोशिकाओं (जीवित कोशिकाओं) की संख्या गिनती. व्यवहार्यता का प्रतिशत कम से कम 70% है, तो मृत कोशिकाओं रेम हो सकता हैयह सुनिश्चित करने के लिए एक उपयुक्त किट का उपयोग कर oved मृत कोशिकाओं पूर्वाग्रह बाद के विश्लेषण नहीं होगा.
- संस्कृति मीडिया निकालें और prewarmed ताजा संस्कृति मीडिया द्वारा जगह. Bafilomycin ए 1 की 100 एनएम के एक अंतिम एकाग्रता के साथ कोशिकाओं को समझो. Bafilomycin ए 1 लाइसोसोम के अम्लीय पीएच बेअसर करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर 1 घंटे सेते हैं.
4. सी 12 FDG धुंधला
- 2 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए prewarmed ताजा संस्कृति मीडिया में सी 12 FDG भंग.
- 33 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता में कोशिकाओं को यौगिक जोड़ें और 37 पर 2 घंटा सेते डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2. गैर पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, तो 4 डिग्री सेल्सियस (गति सेल इस्तेमाल किया प्रकार के लिए समायोजित किया जा सकता है) से कम 5 मिनट के लिए 300 XG कोशिकाओं अपकेंद्रित्र, पीबीएस के साथ 2x धो लो. ठंड पीबीएस के 500 μl में सेल गोली Resuspend. पक्षपाती कोशिकाओं का उपयोग करते हैं, तो मीडिया को हटाने और पीबीएस के साथ 2x धो लो. एक trypsin समाधान और अपकेंद्रित्र का उपयोग पक्षपाती कोशिकाओं फसल4 में 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस (गति सेल इस्तेमाल किया प्रकार के लिए समायोजित किया जा सकता है). ठंड पीबीएस के 500 μl में सेल गोली Resuspend. दोनों ही मामलों में, सेल एकाग्रता 6 के बारे में 10 कोशिकाओं / एमएल होना चाहिए.
- आगे वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की आबादी को चिह्नित करने के लिए एक सह immunolabeling प्रदर्शन करना.
5. फ्लो विश्लेषण
- प्रवाह cytometer के निर्माता से सिफारिश नियंत्रण मोती का उपयोग कर प्रवाह cytometer जांचना. सभी चरणों के लिए कम से कम 10 4 घटनाओं दर्ज किया जाना है.
- Unlabeled कोशिकाओं से युक्त पहला नमूना चलाएँ. एक दो पैरामीटर ग्राफिक प्रदर्शित आगे तितर बितर चैनल (एफएससी) बनाम ओर तितर बितर चैनल (एसएससी) तैयार करें. Photomultiplier ट्यूब (PMTs) सेट और नमूना तैयार करने के दौरान दिखाई दिया है हो सकता है कि मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को छोड़कर ब्याज की एक क्षेत्र को परिभाषित. लॉग पैमाने पर FL1 प्रदर्शित एक एक पैरामीटर हिस्टोग्राम में गेट ब्याज की इस क्षेत्रx-अक्ष और y-अक्ष में घटनाओं की संख्या की. घटनाओं की कुल संख्या का विश्लेषण कोशिकाओं की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है. Unlabeled कोशिकाओं एक्स अक्ष के लॉग पैमाने पर पहले दशक में दिखाई देते हैं तो पी एम टी सेट. यदि आवश्यक हो तो कोशिकाओं के autofluorescence का निर्धारण करते हैं.
- अनुपचारित कोशिकाओं से युक्त दूसरा नमूना चलाएँ. FL1 (सी 12 FDG के प्रतिदीप्ति) प्रदर्शित करने के एक पैरामीटर हिस्टोग्राम पर, dimly लेबल जनसंख्या के बाद कर्सर जगह है. इस दहलीज गैर वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं (dimly लेबल कोशिकाओं) और वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं (चमकते लेबल कोशिकाओं) के बीच भेदभाव की अनुमति देगा.
- इलाज कोशिकाओं से युक्त तीसरी नमूना चलाएँ. चमकते कोशिकाओं लेबल, यानी वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं पिछले चरण में निर्धारित सीमा से ऊपर दिखाई देते हैं. घटनाओं की कुल संख्या प्रति उज्ज्वल घटनाओं की संख्या से विभाजित करके वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के प्रतिशत का मूल्यांकन. यदि आवश्यक हो, β-galactosidase की गतिविधि भी मतलब प्रतिदीप्ति का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता हैतीव्रता.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
एकाधिक myeloma, एक हिमेटोलोजिकल द्रोह, एक chemotherapeutical प्रक्रिया द्वारा प्रेरित वार्धक्य का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एम.एम. सेल लाइन (RPMI 8226) डॉक्सोरूबिसिन, एक chemotherapeutical दवा के साथ 2 दिनों के लिए इलाज किया गया था ऐसा करने के लिए. कोशिकाओं तो bafilomycin A1 में उपचार के अधीन और आगे सी 12 FDG के साथ incubated रहे थे. कोशिकाओं प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया. चित्रा 1 वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का प्रतिशत सी 12 FDG के उपयोग के साथ एक दिन के भीतर निर्धारित किया जा सकता है कि विभिन्न चरणों और शो दिखाता है. Unlabeled कोशिकाओं प्रवाह cytometer में पहली चलाए जा रहे थे. जैसा कि चित्र 2A में दिखाया गया है, ब्याज की एक क्षेत्र मृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को बाहर करने के लिए ग्राफिक FSC बनाम एसएससी पर स्थापित किया गया था. ब्याज की इस क्षेत्र में कोशिकाओं x-अक्ष और y-अक्ष पर घटनाओं की संख्या पर सी 12 FDG (FL1) के प्रतिदीप्ति प्रदर्शित हिस्टोग्राम पर फिर गेटेड थे. अनुपचारित कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया. एकलाल कर्सर दर्शाया चित्रा रूप dimly लेबल जनसंख्या के बाद स्थापित किया गया था 2 बी: वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं क्षेत्र में मौजूद रहेंगे वी. इलाज कोशिकाओं उसके बाद प्रवाह cytometer में चला गया, जबकि गैर वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं, क्षेत्र यू में दिखाई देगा. चित्रा -2 (बाएं पैनल) के रूप में दिखाया चमकते लेबल कोशिकाओं की आबादी, क्षेत्र वी में, पहले से निर्धारित लाल कर्सर ऊपर दिखाई दिया. यह आबादी वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है और उनका प्रतिशत बाद में गणना की जा सकती. समानांतर में, एक ही सेल नमूना सचित्र (सही पैनल) के रूप में β-galactosidase परख का उपयोग सना हुआ था. इस प्रतिनिधि चित्र में, पूरी तरह से नीला कोशिकाओं और आंशिक रूप से नीले रंग की कोशिकाओं को सही मायने में नीले वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं भेदभाव करने में कठिनाई का वर्णन करने के लिए दिखाए जाते हैं.
वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के प्रतिशत के निर्धारण में सी 12 FDG की विशिष्टता का वर्णन करने के लिए, कोशिकाओं डॉक्सोरूबिसिन के विभिन्न एकाग्रता के साथ इलाज किया गया. का प्रतिशतवृद्ध होनेवाला कोशिकाओं चित्रा 2B में के रूप में निर्धारित किया गया था. इस्तेमाल किया डॉक्सोरूबिसिन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में उज्ज्वल कोशिकाओं बढ़ जाती है के प्रतिशत के रूप में 3 चित्र में दिखाया गया है. यह सी 12 FDG लेबलिंग वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के लिए विशिष्ट है कि यह दर्शाता है.
चित्रा 1. प्रयोग की योजना कुल मिलाकर. प्रकोष्ठों पहले 1 24 घंटा chemotherapeutical दवा 2 के साथ उपचार वरीयता प्राप्त थे. प्रयोग के दिन, कोशिकाओं Bafilomycin ए 1 से 3 के साथ और फिर C12FDG 4 के साथ incubated रहे थे. कोशिकाओं तो प्रवाह cytometer 5 पर विश्लेषण किया गया.
चित्रा 2. प्रवाह cytometry विश्लेषण. ब्याज वा की (ए) एक क्षेत्रमृत कोशिकाओं और सेलुलर मलबे को बाहर करने की साजिश FSC बनाम एसएससी पर निर्धारित की. (बी) अनुपचारित कोशिकाओं प्रवाह cytometer में चलाए जा रहे थे और लाल कर्सर स्थापित किया गया था. (सी) का इलाज किया कोशिकाओं प्रवाह cytometer में चलाए जा रहे थे. वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं लाल कर्सर ऊपर दिखाई दिया. यू और वी क्रमशः हित के क्षेत्रों, यानी गैर वृद्ध होनेवाला और वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं. (डी) समानांतर में (एक ही नमूना है, वही उपचार), कोशिकाओं β-galactosidase परख का उपयोग दाग रहे थे. वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के भेदभाव की अनुमति के लिए एक सीमा निर्धारित करने के लिए कठिनाई को दिखाता है जो कोशिकाओं के धुंधला के विभिन्न डिग्री (पूरी तरह से नीले रंग की कोशिकाओं, आंशिक रूप से नीले कक्ष), ध्यान दें. आगे तितर बितर चैनल (एफएससी), साइड स्कैटर चैनल (एसएससी), प्रतिदीप्ति 1 (FL1).
चित्रा 3. सी 12 की विशिष्टताFDG लेबलिंग. कोशिकाओं 5 (अंधेरे ग्रे हिस्टोग्राम), 25 (हल्के भूरे रंग हिस्टोग्राम) और डॉक्सोरूबिसिन के 50 एनएम (सफेद हिस्टोग्राम) के साथ इलाज किया गया. यू गैर वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं से युक्त क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का प्रतिशत घटनाओं की कुल संख्या प्रति उज्ज्वल घटनाओं की संख्या से विभाजित करके मूल्यांकन किया जाता है. वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का प्रतिशत क्रमश: 0.8%, 15.78%, 5, 25 की एक खुराक के लिए 26.31%, और 50 एनएम डॉक्सोरूबिसिन, कर रहे हैं.
| परख C12FDG | β-galactosidase परख | |
| संवेदनशीलता | + | - |
| लागत | = | = |
| Throughput | + | - |
| परख अवधि | - | + |
| सेल टाइप करने के लिए प्रयोज्यता | = | = |
| प्रकोष्ठों | सेल जीते | निश्चित सेल |
| विशेष उपकरणों के लिए आवश्यकता | प्रवाह cytometer | उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप |
तालिका 1. (-) और (=) क्रमशः, लघु और समकक्ष डिग्री के अनुरूप हैं. जबकि सी 12 FDG cytometry आधारित परख और β-galactosidase परख (+) के फायदे और नुकसान के उच्च डिग्री से मेल खाती है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हम यहाँ रहते कैंसर की कोशिकाओं में सेलुलर senescence यों तो एक प्रवाह cytometry आधारित विधि प्रस्तुत किया. इस विधि झिल्ली पारगम्य परिसर, सी 12 FDG के उपयोग पर आधारित है, और मिश्रित कोशिकाओं द्वारा लिया जाता है इसलिए किसी भी प्रकार की कोशिकाओं में और लंबे समय के रूप में विभिन्न उपचार के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है. सेलुलर तेज करने पर, सी 12 FDG वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की लाइसोसोम में समृद्ध β-galactosidase, द्वारा hydrolyzed है. लेजर उत्तेजना के बाद, यौगिक वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करता है. हरी प्रतिदीप्ति की इस मात्रा का ठहराव या तो प्रवाह cytometry द्वारा या प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है. हालांकि, इस मामले में, फ्लोरोसेंट कोशिकाओं समय की आवश्यकता होती है, प्रेक्षक द्वारा गिना जा होगा. सी 12 FDG β-galactosidase द्वारा hydrolyzed है के बाद से, इस विधि β-galactosidase की गतिविधि यों को, वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव के अलावा, की अनुमति देता हैऔर एंजाइम का स्थानीयकरण, ज्यादातर लाइसोसोमल पुटिका में प्रस्तुत करते हैं. विधि सरल है, ध्यान चरण 3 पर तैयार किया जाना चाहिए. वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं के सफल पता लगाने ज्यादातर लाइसोसोम की सही पीएच पर निर्भर करता है. ऐसा करने के लिए, हम लाइसोसोम के अम्लीय पीएच बेअसर करने bafilomycin A1 का इस्तेमाल किया. सेल इस्तेमाल किया प्रकार पर निर्भर करता है, यह कदम आवश्यक नहीं किया जा सकता है. बुढ़ापा उम्मीद है और कोई धुंधला पाया जाता है, हम bafilomycin A1 के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण (कोई bafilomycin) शामिल करने के लिए और bafilomycin ए 1 की एकाग्रता बढ़ाने के लिए सुझाव देते हैं. ऐसा करने से है, इस वृद्धि कोशिका मृत्यु को उत्पन्न नहीं है यह सुनिश्चित. वैकल्पिक रूप से, bafilomycin ए 1 क्लोरोक्वीन या लाइसोसोम का पीएच वृद्धि कर सकते हैं कि किसी भी अन्य यौगिकों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम सफलतापूर्वक एक दिन के भीतर डॉक्सोरूबिसिन इलाज के बाद एकाधिक myeloma कोशिकाओं में वृद्ध होनेवाला कोशिकाओं का प्रतिशत मात्रा. इस प्रोटोकॉल अन्य संगठनों में इस्तेमाल किया जा सकता हैएर कैंसर कोशिका प्रकार है, लेकिन यह भी गैर कैंसर कोशिका प्रकार में. सेलुलर पीएच भी नियंत्रित किया जाना चाहिए, जिसके लिए लोकप्रिय और overused β-galactosidase परख,, कम से कम 2 दिन की आवश्यकता है. दरअसल β-galactosidase द्वारा एक्स लड़की की दरार के बाद प्राप्त अधिकतम नीले रंग,, 12 के बाद हासिल की है - ऊष्मायन 9 से 16 घंटे. यह परख इसलिए प्रस्तावित cytometry आधारित परख की तुलना में अधिक समय लगता है. सही मायने में वृद्ध होनेवाला नहीं किया जा रहा है, जबकि एक नीले सेल वृद्ध होनेवाला सेल के रूप में गिना जा सकता है क्योंकि इसके अलावा, इस परख के प्रति संवेदनशील नहीं है. दो तकनीकों के लिए 1 टेबल स्मरण दिलाता फायदे और नुकसान.
इस विधि के अन्य लाभ यह है कि कोशिका की सतह निर्माताओं के immunostaining के साथ मिलकर किया जा सकता है. एकाधिक myeloma के मामले में, यह हमारे कि गैर कैंसर स्टेम कोशिकाओं को 12, जबकि एकाधिक myeloma कैंसर स्टेम कोशिकाओं, निम्न डॉक्सोरूबिसिन उपचार senesce नहीं है दिखाने के लिए अनुमति दी गई है. बुढ़ापा होने के लिए समर्थक और विरोधी tumorigenic दिखाया गया है. Chemotherapeutical दवाओं वार्धक्य को प्रेरित कर सकते हैं, वार्धक्य का अध्ययन क्लिनिक में महत्वपूर्ण हो सकता है. यह अंत करने, तेजी से और संवेदनशील assays के इस तरह हम यहाँ वर्णित परख के रूप में इस्तेमाल किया जाना है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम cytometry सुविधा के उपयोग के लिए एस एफ 4206 ICORE (Université डी कान) धन्यवाद. जे.सी. Conseil डे radioprotection डी EDF और Basse-Normandie की Conseil क्षेत्रीय से पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप प्राप्त किया. Comités डे ल Orne एट डु Calvados - उन डेटा लीग नेशनल contre ले कैंसर द्वारा वित्त पोषित परियोजनाओं का हिस्सा थे.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
