Summary
老化は防止または腫瘍形成は議論の余地があるかどうかを促進。化学療法薬は老化するがん細胞を誘導することができるので、老化を研究する新しい治療法を提案するために不可欠である。ただし、標準化され広く使用されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。我々はここで老化を定量化するための迅速かつ高感度フローサイトメトリーベースのアッセイを提案する。
Abstract
ヒトの細胞は無限に増殖しない。外部および/または内因合図すると、細胞が老化と呼ばれる安定した細胞周期の停止を死ぬか、または入力します。このようなテロメアの短縮やマイトジェン癌遺伝子の異常発現などのいくつかの細胞のメカニズムは、老化を引き起こすことが示されている。老化は、正常細胞に限定されず、癌細胞はまた、老化することが報告されている。
化学療法薬は、癌細胞の老化を誘導することが示されている。しかし、それは老化が防止または腫瘍形成を促進するかどうか議論の余地がある。それは最終的に患者固有のかもしれないような、癌細胞の老化を評価するための迅速かつ高感度の方法はすぐに必要とされる。
この目的のために、標準的なβ-ガラクトシダーゼアッセイを、現在使用されている方法は、主要な欠点を提示する。それは時間がかかり、敏感ではない。ここではリチウムの老化を研究するためのフローサイトメトリーベースのアッセイを提案セルをVEの。このアッセイは、感受性、迅速であるという利点を提供し、種々の細胞マーカーの免疫標識に結合することができる。
Introduction
60年代前半とヘイフリックとムーアによるその発見以来、老化はまだ携帯好奇心1のままです。ヒトの細胞は無限に老化によって、ヘイフリックとムーアは老化の細胞プロセスを造語、増殖しません。老化は、細胞死とは対照的に、細胞は代謝的に活性なままである、安定した細胞周期の停止である。テロメアの短縮、DNA損傷、クロマチン摂動、及びマイトジェン癌遺伝子の異常発現2：日付には、4つの細胞メカニズムは老化を誘導することが示されている。これは、正常細胞だけでなく、癌細胞だけでなく老化3を受けることができることを示している。実際のところ、老化を受けている癌細胞をさらに腫瘍進行4-5に対する障壁を構成することが示された。しかし、いくつかの報告は現在、特定の状況下で、細胞老化にも悪性6-7を促進することができる、と指摘している。癌CELの老化を研究現在使用されている化学療法薬はin vitroにおいてもin vivoで 8だけでなく、がん細胞の老化につながることができるようなLSは、がん研究の衝動になろうとしている。
老化細胞の存在を調査するマスターアッセイは、酸性pHでのβ-ガラクトシダーゼアッセイである。この組織化学的アッセイは最も老化細胞で発生するリソソーム生合成増加を反映している。簡潔には、細胞に適用外因X-galのは、青色9を生じる、老化細胞のリソソームに富むβ-ガラクトシダーゼによって切断される。青色老化細胞は、その後、明視野顕微鏡下で定量することができる。非常に人気があるが、β-ガラクトシダーゼアッセイは、大きな欠点を提示します。まず、このアッセイは、固定細胞上で実行される。それは顕微鏡下で老化細胞の有意に高い数をカウントすることによって老化の程度を定量化することを意味するので、第二に、それは時間がかかる。第三に、このアッセイ老化と非老化細胞の間に差別が完全にオブザーバーに依存しているとして区別されません。
我々はここに住んで老化細胞の存在を評価するために未開発の、迅速、かつ高感度メトリーベースのアッセイを話し合う。このアッセイは、膜透過性分子の加水分解、5 - dodecanoylaminofluoresceinジ-β-D-ガラクトピラノシド（C 12 FDG）に基づいて、β-ガラクトシダーゼによる老化細胞に富む。加水分解およびレーザー励起した後、C 12 FDGは、緑色の蛍光を発するため、フローサイトメトリー10,11で検出することができる。フローサイトメトリーを介した老化細胞の検出は、迅速かつ高感度であることの大きな利点を提供しています。また、フローサイトメトリーによる老化細胞の検出は、他の細胞マーカーの検出と結合することができる。このアッセイは、化学療法で処理した癌細胞の集団内で老化細胞を検出するために使用することができ、日常的に設定することができるまで組織切片上で、携帯解離後、診療所である。
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Protocol
1。 C12FDG、バフィロマイシンA1、および細胞培養の調製
- 最終濃度20mMにジメチルスルホキシド（DMSO）中のC 12 FDG粉末を溶解する。 -20℃でアリコートと店舗DMSOは、適切な安全条件で使用されるべきである。
- 0.1mMの最終濃度DMSO中バフィロマイシンA1粉末を溶かす。アリコートと店で - 20℃バフィロマイシンは、適切な安全条件で使用する必要があります。
- 37℃、10％ウシ胎児血清および1％抗生物質、°C、5％CO 2を含む培地で、RPMI 8226細胞株、又は接着否か他の細胞株を養う。実験に必要なセルの数を見積もります。フローサイトメトリー分析の間に十分な数のイベントを記録するために、5×10 5個の細胞が必要である。老化細胞の割合を、3つの細胞サンプルが必要とされるかを判断するには、次のようにラベル付けされていないサンプル、C 12 FDGで染色処理した細胞で染色した未処理の細胞をC 12 FDG。
- シードセル24時間は、従来の細胞は、細胞増殖曲線の対数期内になるように実験を行う。
2。老化の誘導
- 化学療法薬を添加することにより癌細胞の老化を誘導する。薬物濃度と処理時間を試験した細胞タイプに適合させるべきである。約10 6細胞/ mlの細胞の濃度は50 nmのドキソルビシンの最終濃度で48時間処理を開始します。未処理のサンプル（ネガティブコントロール）を含めることを忘れないでください。
3。バフィロマイシンA1治療
- 前のステップで使用される化学療法薬は、細胞アポトーシスをもたらす可能性があるため、トリパンブルー（v / v）で混合すると細胞によって細胞生存率を確認する。 Malassez室に記入し、青色細胞（死細胞）の白と細胞（生細胞）の数を数える。生存率の割合が70％未満である場合は、死細胞は、レムかもしれない死んだ細胞はバイアスその後の分析をしないことを確保するための適切なキットを使用してoved。
- 培地を取り出し、あらかじめ温めておいた新鮮な培地で置き換える。バフィロマイシンA1 100nMの最終濃度で細胞を扱う。バフィロマイシンA1は、リソソームの酸性pHを中和するために使用される。 37℃、5％CO 2で1時間インキュベートします。
4。 C 12 FDG染色
- 2mMの最終濃度予め温め新鮮な培養培地中でC 12 FDGを溶解する。
- 33μMの最終濃度で細胞に化合物を添加し、37℃で2時間インキュベートする°C、5％CO 2。非接着細胞を使用する場合は、4℃で5分間300×gで細胞を遠心（速度が使用される細胞型に調整する必要があるかもしれません）、PBSで2倍を洗浄する。冷PBSの500μlの細胞ペレットを再懸濁します。接着細胞を使用している場合は、メディアを取り出し、PBSで2倍を洗う。トリプシン溶液と遠心分離機を用いて接着細胞を収穫4°Cで5分（速度は使用する細胞の種類に調整することが必要になる場合があります）、300×gで細胞。冷PBSの500μlの細胞ペレットを再懸濁します。両方の場合において、細胞濃度は、約10 6細胞/ mlであるべきである。
- さらに老化細胞の集団を特徴づけるために、共免疫標識を実行します。
5。フローサイトメトリー分析
- フローサイトメータの製造元が推奨する対照ビーズを用いたフローサイトメーターを較正する。すべての手順については、少なくとも10の4つのイベントが記録されなければならない。
- ラベル付けされていない細胞を含む最初のサンプルを実行します。 2パラメータのグラフィック表示を前方散乱チャネル（FSC）対側方散乱チャネル（SSC）を準備。光電子増倍管を（光電子増倍管）を設定し、試料調製時に登場しているかもしれない死んだ細胞や細胞破片を除いた関心領域を定義します。ゲートログスケールでFL1を表示1パラメータヒストグラムの関心のこの領域x軸とy軸でのイベント数。イベントの総数は、分析された細胞の数を表す。ラベル付けされていない細胞は、x軸の対数スケールで最初の十年で表示されるようにPMTを設定します。必要に応じて細胞の自家蛍光を決定します。
- 未処理の細胞を含む第二のサンプルを実行します。 FL1（C 12 FDGの蛍光）を表示し、ワンパラメータヒストグラムに、ぼんやりとラベルされた人口の後にカーソルを置きます。このしきい値は、非老化細胞（ぼんやりと標識された細胞）と老化細胞（明るく標識された細胞）の間の区別が可能になります。
- 処理した細胞を含む第3のサンプルを実行します。明るく標識された細胞、 すなわち老化細胞は、前の手順で決定された閾値の上に表示されます。イベントの総数当たり明るいイベント数を割ることによって老化細胞の割合を評価する。必要に応じて、β-ガラクトシダーゼ活性は、平均蛍光を用いて推定することができる強度。
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Representative Results
多発性骨髄腫、血液学的悪性腫瘍は、化学療法によって誘導される手順老化を評価した。そのためには、市販のMM細胞株（RPMI 8226）はドキソルビシン、化学療法薬で2日間処理した。次いで、細胞をバフィロマイシンA1処理を施し、更にC 12 FDGと共にインキュベートした。細胞をフローサイトメトリーにより分析した。 図1は、老化細胞の割合C 12 FDGを用いて日以内に決定することができるさまざまなステップやショーを示す図である。非標識細胞をフローサイトメーターで最初に実行された。 図2Aに示すように、関心領域は、死細胞および細胞残屑を排除するためにグラフィックFSC対SSCに設定した。この関心領域内の細胞は、その後、x軸とy軸上のイベント数のC 12 FDG（FL1）の蛍光を表示するヒストグラムにゲートであった。未処理の細胞を分析した。 A赤いカーソルが描かれ、図のようにぼんやりとラベルされた人口の後に設定された2B：老化細胞は、地域に存在することになるV.処理した細胞は、その後、フローサイトメーターで実行されたのに対し、非老 化細胞は、領域Uに表示されます。 図2C（左パネル）のように明るく標識された細胞の人口は、地域Vで、以前に設定した赤いカーソルの上に登場しました。この集団は、老化細胞を表し、その割合は、続いて算出することができる。並行して、同じ細胞試料は、図示（右パネル）のようなβ-ガラクトシダーゼアッセイを用いて染色した。この代表的な絵では、完全に青のセルと部分的に青の細胞が本当に青老化細胞を識別するための難しさを説明するために示されています。
老化細胞の割合の決定におけるC 12 FDGの特異性を示すために、細胞を種々の濃度のドキソルビシンで処理した。の割合老化細胞は、 図2Bのように決定した。 図3に示すように、ドキソルビシン濃度の関数としての明色セルの増加割合が用いられる。これは、C 12 FDGラベリング老化細胞に特異的であることを示している。
図1。実験の全体的なスキーム。細胞は、化学療法薬2による治療前1 24時間を播種した。実験の日に、細胞を、バフィロマイシンA1 3、次いでC12FDG 4でインキュベートした。次いで、細胞をフローサイトメーターで分析した5。
図2。フローサイトメトリー分析。関心のWAの（A）領域sが死んだ細胞や細胞破片を除外するためにプロットFSC対SSCで決定。（B）未処理の細胞は、フローサイトメーターで実行され、赤のカーソルが設定されていました。（C）処理した細胞をフローサイトメーターで実行されていた。老化細胞は赤カーソル上に現れた。 U、Vはそれぞれ、関心のある領域、 すなわち 、非老 化および老化細胞を表す。（D）に平行（同じサンプル、同じ処理）において、細胞はβ-ガラクトシダーゼアッセイを用いて染色した。老化細胞の識別を可能にするしきい値を設定するには難しさを示した細胞の染色の様々な程度を（完全に青細胞、部分的に青細胞）、注意してください。前方散乱チャネル（FSC）、側方散乱チャネル（SSC）、蛍光1（FL1）。
図3。 C 12の特異性FDGラベル。細胞を、5（濃い灰色のヒストグラム）、25（薄い灰色のヒストグラム）およびドキソルビシン50nMの（白いヒストグラム）で処理した。 Uは、非老化細胞を含む領域を表します。老化細胞の割合は、イベントの総数当たり明るいイベント数を割ることによって評価される。老化細胞の割合は、それぞれ0.8％、15.78パーセント、5、25の線量のために26.31パーセント、および50 nmのドキソルビシン、です。
| アッセイC12FDG | β-ガラクトシダーゼアッセイ | |
| 感度 | + | - |
| コスト | = | = |
| スループット | + | - |
| 検定期間 | - | + |
| 細胞型への適用 | = | = |
| 細胞 | 生細胞 | 固定細胞 |
| 特殊な装置のための要件 | フローサイトメトリー | 明視野顕微鏡 |
表1。 （ - ）と（=）は、それぞれ、マイナーと同等の度に対応しています。ながらC 12 FDGサイトメトリーベースのアッセイおよびβ-ガラクトシダーゼアッセイ （+） の長所と短所は、より高い程度に相当します。
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Discussion
我々はここに住んで、癌細胞における細胞老化を定量化するためのフローサイトメトリーベースの方法を提示した。この方法は、膜透過性化合物、C 12 FDGの使用に基づいており、化合物が細胞によって取り込まれているようので、任意の細胞型において及び限り、種々の処理後に使用することができる。細胞への取り込み時に、C 12 FDGは、老化細胞のリソソームに富んだβ-ガラクトシダーゼによって加水分解される。レーザ励起の後、化合物は、老化細胞の定量を可能にする、緑色蛍光を発する。緑色蛍光のこの定量化は、いずれかのフローサイトメトリーや蛍光顕微鏡によって行うことができる。しかし、この場合、蛍光細胞は時間を要する、観察者によってカウントされなければならない。 C 12 FDGは、β-ガラクトシダーゼ活性を定量化するために、老化細胞の定量化に加えて、この方法は可能にする、β-ガラクトシダーゼによって加水分解されるので、と酵素の局在は、主にリソソーム小胞に存在する。方法は簡単ですが、注目は、ステップ3に描かなければならない。老化細胞の正常な検出は主にリソソームの右側のpHに依存しています。そうするために、我々はリソソームの酸性pHを中和するためにバフィロマイシンA1を使用していました。使用される細胞タイプに応じて、このステップは必要ないかもしれない。老化が予想されず、染色が検出されない場合、我々は、バフィロマイシンA1（無バフィロマイシン）のための陰性対照を含むようにし、バフィロマイシンA1の濃度を増加させることを示唆している。そうする場合、この増加は、細胞死を誘導しないこと。あるいは、バフィロマイシンA1は、クロロキンまたはリソソームのpHを増加させることができる任意の他の化合物と置換することができる。
説明されたプロトコルを使用して、我々は正常日以内に、ドキソルビシン処理後の多発性骨髄腫細胞における老化細胞の割合を定量化した。このプロトコルはOTHで使用することができる小胞体癌細胞の種類だけでなく、非癌細胞型である。細胞のpHを制御することも必要があるため人気があり、使い古されたβ-ガラクトシダーゼアッセイは、少なくとも2日が必要です。実際にβ-ガラクトシダーゼによるX-GALの切断後に得られた最大の青い色は、12後に達成される-インキュベーション9の16時間を。このアッセイは、したがって、提案されたサイトメトリーベースのアッセイよりもかかる多くの時間です。本当に老化ではないながら、青みがかった細胞は老化細胞としてカウントされる可能性があるため、また、このアッセイは区別されません。 2つの手法に表1に再現するには、長所と短所。
この方法の他の利点は、それが細胞表面メーカーの免疫染色と結合することができるということである。多発性骨髄腫の場合、これは、私たちは、非癌幹細胞が12をする間、多発性骨髄腫の癌幹細胞は、以下のドキソルビシン処理が老化しない表示させている。 老化は、炎症および抗腫瘍形成性であることが示されている。化学療法薬は老化を誘導することができるので、老化を研究することは診療所で重要になるかもしれません。この目的のために、迅速かつ高感度アッセイは、例えば、我々がここで説明するアッセイとして、使用しなければならない。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されていない。
Acknowledgments
我々はサイトメトリー施設の使用のためにSF 4206 ICORE（カーン大学）に感謝。 JCは、バースノルマンディーのConseilのデ放射線防護D'EDFとConseilの地域からのポスドクフェローシップを受けた。 comesの複数形デロルヌエデュカルヴァドス - それらのデータはリーグ国立結界伤害防护结界ルがんによって資金を供給されたプロジェクトの一部であった。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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