Summary
Hvorvidt senescence forhindrer eller fremmer tumorigenese stadig kontroversielt. Da chemotherapeutical medicin kan fremkalde kræftceller til senesce, studere senescence er afgørende for at foreslå nye behandlingsformer. Men den standard og bredt anvendt β-galactosidaseanalyse giver store ulemper. Vi foreslår her en hurtig og følsom flowcytometri-baseret assay at kvantificere degeneration.
Abstract
Humane celler ikke uendelige formere sig. Ved eksterne og / eller indre cues, kan cellerne dø eller indtaste en stabil cellecyklusstop kaldes ældning. Adskillige cellulære mekanismer, såsom telomer afkortning og unormal udtryk for mitogene onkogener, har vist sig at forårsage degeneration. Ældning er ikke begrænset til normale celler, cancerceller er også blevet rapporteret at senesce.
Chemotherapeutical lægemidler har vist sig at inducere degeneration i kræftceller. Men det er stadig kontroversielt, om degeneration forhindrer eller fremmer tumorigenese. Da det i sidste ende kunne være patient-specifikke, vil en hurtig og følsom metode til at vurdere senescens i kræftcellen snart være påkrævet.
Til dette formål viser standard β-galactosidaseanalyse, den anvendte metode, alvorlige ulemper: det er tidskrævende og ikke følsom. Vi foreslår her en flowcytometri-baseret assay at studere ældning på live celler. Dette assay har den fordel af at være hurtig, følsom, og kan kobles til immunolabeling af forskellige cellulære markører.
Introduction
Siden begyndelsen af tresserne, og dens opdagelse af Hayflick og Moorhead, stadig senescence stadig et cellulært nysgerrighed 1.. Menneskelige celler ikke uendelige formere, og ved degeneration, opfandt Hayflick og Moorhead den cellulære ældningsprocessen. Ældning er en stabil cellecyklusstop hvor cellerne forbliver metabolisk aktive i modsætning til celledød. Til dato har fire cellulære mekanismer vist sig at inducere degeneration: telomer afkortning, DNA-skader, kromatin forstyrrelse, og unormal ekspression af mitogene onkogener 2. Dette indikerer, at ikke alene normale celler, men også kræftceller er i stand til at undergå senescens 3.. Som en kendsgerning, blev kræftceller undergår degeneration vist at udgøre en hindring for yderligere tumorudvikling 4-5. Imidlertid har flere rapporter nu påpeget, at under visse omstændigheder kan cellulære ældning også fremme malignitet 6-7. Studere ældning for kræft cells er ved at blive en trang i kræftforskning, som i øjeblikket anvendes kemoterapeutiske stoffer kan føre til degeneration af kræftceller ikke kun in vitro, men også in vivo 8..
Føreren assay til at undersøge for tilstedeværelsen af senescentceller er β-galactosidaseanalyse i surt miljø. Denne histokemisk assay afspejler øget i lysosomale biogenese forekommer i de fleste senescentceller. Kort fortalt exogent X-gal, anvendt på celler, spaltes ved β-galactosidase beriget i lysosomer af senescentceller, giver anledning til en blå farve 9.. De blå senescentceller kan derefter kvantificeres under et lysfelt mikroskop. Selvom meget populær, præsenterer β-galactosidaseanalyse store ulemper. Først er dette assay udføres på fikserede celler. For det andet, det er tidskrævende, fordi det indebærer at kvantificere graden af ældning ved at tælle et signifikant højt antal senescentceller under et mikroskop. Tredje dette assayer ikke følsom som den forskelsbehandling mellem ældede og ikke-senescentceller helt afhængig af observatør.
Vi diskuterer her et uudnyttet, hurtig og følsom cytometri-baseret assay til at vurdere tilstedeværelsen af levende senescentceller. Dette assay er baseret på hydrolyse af en membranpermeabel molekyle, 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranosid (C 12 FDG), ved β-galactosidase beriget i senescentceller. Efter hydrolyse og laser excitation udsender C 12 FDG grøn fluorescens, og kan derfor detekteres ved flowcytometri 10, 11. Påvisning af senescentceller via flowcytometri giver den store fordel at være hurtigere og mere følsom. Desuden kan detektering af senescentceller ved flowcytometri kobles med påvisning af andre cellulære markører. Dette assay kan anvendes til at detektere senescentceller i en population af kræftceller behandlet med kemoterapi og kan rutinemæssigt indstillesop på vævssnit, efter cellulær dissociation. i klinikken
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af C12FDG, bafilomycin A1 og Cell Culture
- Opløs C 12 FDG pulver i dimethylsulfoxid (DMSO) til en slutkoncentration på 20 mM. Alikvot og opbevares ved -20 ° C. DMSO bør anvendes med passende sikkerhedsbetingelser.
- Opløs bafilomycin A1 pulver i DMSO til en slutkoncentration på 0,1 mM. Alikvot og opbevares ved - 20 ° C. Bafilomycin bør anvendes med passende sikkerhedsbetingelser.
- Dyrke RPMI 8226 cellelinie eller andre cellelinier adhærente eller ikke, i medier indeholdende 10% kalvefosterserum og 1% antibiotika ved 37 ° C, 5% CO2. Estimere antallet af celler, der er nødvendige for eksperimentet. For at optage et tilstrækkeligt antal hændelser under flowcytometri analyse, er 5 x 10 5 celler påkrævet. For at bestemme den procentdel af senescentceller er tre celleprøver påkrævet: umærket prøve ubehandlede celler farvet med C 12 FDG, behandlede celler farvet medC 12 FDG.
- Frø cellerne 24 timer før udførelse af eksperimentet så cellerne er i log-fase af celleproliferation kurven.
2.. Induktion af Ældning
- Fremkalde ældning af cancerceller ved at tilføje en kemoterapeutiske lægemiddel. Stofkoncentration og varigheden af behandlingen bør tilpasses til cellen prøvet type. Start med en 48 timers behandling ved den endelige koncentration på 50 nM doxorubicin til en koncentration af celler på omkring 10 6 celler / ml. Glem ikke at medtage ubehandlet prøve (negativ kontrol).
3.. Bafilomycin A1 Treatment
- Tjek cellelevedygtighed ved at blande celler med trypanblåt (v / v), som det kemoterapeutiske stof, der anvendes i det foregående trin kan føre til celle apoptose. Fyld i en Malassez kammer og tælle antallet af blå celler (døde celler) og hvide blodlegemer (levende celler). Hvis den procentvise levedygtighed er mindre end 70%, kan døde celler være removed anvendelse af et passende kit til at sikre, at døde celler vil ikke bias efterfølgende analyse.
- Fjern dyrkningsmedier og erstattes af forvarmede friske dyrkningsmedier. Behandle cellerne med en slutkoncentration på 100 nM bafilomycin A1. Bafilomycin A1 anvendes til at neutralisere den sure pH i lysosomer. Inkuber 1 time ved 37 ° C, 5% CO2.
4.. C 12 FDG Farvning
- Opløs C 12 FDG i forvarmede friske dyrkningsmedier til en slutkoncentration på 2 mM.
- Tilsæt forbindelsen til celler i en slutkoncentration på 33 uM og inkuber 2 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Hvis der anvendes ikke-adhærente celler, centrifugeres cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved 4 ° C (hastigheden måske skal tilpasses den anvendte celletype), vaskes 2x med PBS. Resuspender cellepelleten i 500 pi kold PBS. Hvis du bruger adhærente celler, fjerne mediet og vaskes 2x med PBS. Høste adhærente celler ved hjælp af en trypsinopløsning og centrifugeresceller ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C (hastigheden måske skal tilpasses den anvendte celletype). Resuspender cellepelleten i 500 pi kold PBS. I begge tilfælde bør cellekoncentrationen være omkring 10 6 celler / ml.
- Udfør en co-immunolabeling til yderligere at karakterisere populationen af senescentceller.
5.. Flowcytometri Analyse
- Kalibrer flowcytometeret hjælp af kontrol-perler anbefalet af producenten af flowcytometeret. For alle trin, have mindst 10 4 begivenheder, der skal registreres.
- Kør den første prøve, der indeholder umærkede celler. Forbered en to-parameter grafisk visning Forward Scatter Channel (FSC) versus Side Scatter Channel (SSC). Indstil fotomultiplikatorrør (PMT'er) og definere et område af interesse eksklusive døde celler og celleaffald, der kunne have vist sig under prøven forberedelse. Gate denne region af interesse i en én-parameter histogram viser FL1 om logskalaenaf x-aksen og antallet af begivenheder i y-aksen. Det samlede antal hændelser repræsenterer antallet af analyserede celler. Indstil PMT så umærkede celler i det første tiår for logaritmisk skala af x-aksen. Bestem autofluorescens af cellerne om nødvendigt.
- Kør den anden prøve, der indeholder ubehandlede celler. På den ene-parameter histogram viser FL1 (fluorescens C 12 FDG), skal du placere markøren efter svagt mærkede befolkning. Denne tærskel vil tillade forskelsbehandlingen mellem ikke-senescentceller (dunkelt mærkede celler) og senescentceller (lyst mærkede celler).
- Kør den tredje prøve indeholdende behandlede celler. Flotte mærkede celler, dvs senescentceller vises over tærsklen bestemmes i det foregående trin. Evaluere den procentdel af senescentceller ved at dividere antallet af lyse hændelser pr det samlede antal hændelser. Hvis det er nødvendigt, kan aktiviteten af β-galactosidase også vurderes ved anvendelse af middelfluorescensintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Myelomatose, en hæmatologisk malignitet, blev anvendt til at evaluere degeneration induceret af en kemoterapeutiske procedure. At gøre en kommercielt tilgængelig MM cellelinje (RPMI 8226) blev behandlet i 2 dage med doxorubicin, et kemoterapeutiske lægemiddel. Cellerne blev derefter underkastet bafilomycin A1 behandling og yderligere inkuberet med C 12 FDG. Celler blev analyseret ved flowcytometri. Figur 1 illustrerer de forskellige trin og viser, at procentdelen af senescentceller kan bestemmes inden for en dag med brugen af C 12 FDG. Umærkede celler blev kørt først i flowcytometeret. Som vist i figur 2A, blev et område af interesse, der på den grafiske FSC versus SSC at udelukke døde celler og cellerester. Celler i denne region af interesse blev derefter gated på histogrammet viser fluorescensen af C 12 FDG (FL1) på x-aksen og antallet af begivenheder på y-aksen. De ubehandlede celler blev analyseret. Ared markør blev sat efter dunkelt mærkede befolkningen som afbildet figur 2B: non senescentceller vises i regionen U, mens senescentceller vil være til stede i regionen, V. De behandlede celler blev derefter kørt i flowcytometret. En population af lyst mærkede celler viste sig over den røde markør tidligere indstillede, i regionen V, som vist Figur 2C (venstre panel). Denne population repræsenterer senescentceller og deres procentvise efterfølgende kan beregnes. Samtidig blev den samme celle prøve farvet under anvendelse af β-galactosidaseanalyse som vist (højre panel). I denne repræsentativt billede, udelukkende blå celler og delvis blå celler vist for at illustrere det er vanskeligt at skelne ægte blå senescentceller.
At illustrere specificitet C 12 FDG i bestemmelse af procentdelen af senescentceller blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af doxorubicin. Den procentdel afsenescentceller blev bestemt som i figur 2B. Procentdelen af lyse celler stiger som en funktion af doxorubicin anvendte koncentration som vist i figur 3.. Dette viser, at C 12 FDG mærkning er specifik for senescentceller.
Figur 1. Samlede ordning af forsøget. Celler blev podet 1 24 hr forudgående behandling med kemoterapeutiske stof 2.. På dagen for forsøget blev cellerne inkuberet med bafilomycin A1 3 og derefter med C12FDG 4.. Cellerne blev derefter analyseret på flowcytometeret 5..
Figur 2. Flowcytometrianalyse. (A) En region af interesse was bestemmes på grunden FSC versus SSC at udelukke døde celler og cellerester. (B) De ubehandlede celler blev kørt i flowcytometeret og den røde markøren var indstillet. (C) de behandlede celler blev kørt i flowcytometeret. De senescentceller optrådte over den røde markør. U og V repræsenterer regioner af interesse, dvs ikke-ældede og ældede celler, hhv. (D) Parallelt (samme prøve, samme behandling) blev cellerne farvet under anvendelse af β-galactosidaseanalyse. Bemærk den forskellige grad af farvning af cellerne (helt blå celler, delvis blå celler), hvilket illustrerer vanskeligheden ved at indstille en tærskel tillader diskrimination af senescentceller. Forward Scatter Channel (FSC), Side Scatter Channel (SSC), Fluorescens 1 (FL1).
Figur 3. Specificitet C12FDG mærkning. Celler blev behandlet med 5 (mørkegrå histogram), 25 (lysegrå histogram) og 50 nM (hvide histogram) af doxorubicin. U betegner den region, der indeholder ikke-senescentceller. Procentdelen af senescentceller vurderes ved at dividere antallet af lyse hændelser pr det samlede antal hændelser. De procentdele af senescentceller er 0,8%, 15,78%, 26,31% for en dosis på 5, 25 og 50 nM doxorubicin, hhv.
| C12FDG assay | β-galactosidaseanalyse | |
| Følsomhed | + | - |
| Omkostninger | = | = |
| Throughput | + | - |
| Assay varighed | - | + |
| Anvendelse på celletype | = | = |
| Celler | Levende celle | Fast celle |
| Krav om specialudstyr | Flowcytometer | Bright field mikroskop |
Tabel 1. . Fordele og ulemper af C 12 FDG cytometri assay og β-galactosidaseanalyse (+) svarer til højere grad, mens (-) og (=) svarer til mindre og tilsvarende grader hhv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi præsenteres her en flowcytometri-baserede metode til at kvantificere cellulær degeneration i levende kræftceller. Denne metode er baseret på anvendelsen af membranen permeabel substans, C 12 FDG, og kan derfor anvendes i alle celletyper og efter forskellige behandlinger, så længe forbindelsen er taget op af cellerne. Efter cellulær optagelse, er C 12 FDG hydrolyseres af β-galactosidase, beriget i lysosomer af senescentceller. Efter laserexcitation, udsender forbindelsen grøn fluorescens, der giver mulighed for kvantificering af senescentceller. Denne kvantificering af grøn fluorescens kan enten ske ved flowcytometri eller ved fluorescensmikroskopi. Men i dette tilfælde, vil fluorescerende celler skal tælles af observatøren, der kræver tid. Da C 12 FDG hydrolyseres ved β-galactosidase, denne metode giver, foruden kvantificering af senescentceller, at kvantificere aktiviteten af β-galactosidaseog lokalisering af enzymet, for det meste til stede i lysosomal vesikel. Selv om metoden er enkel, bør man være opmærksom på trin 3.. Den vellykkede påvisning af senescentceller meste afhængig af højre pH lysosomerne. For at gøre det, vi brugte bafilomycin A1 til at neutralisere den sure pH i lysosomer. Afhængigt af den anvendte celletype, kan dette trin ikke nødvendigt. Hvis degeneration forventes og ingen farvning detekteres, foreslår vi at inkludere en negativ kontrol af bafilomycin A1 (ingen bafilomycin) og at øge koncentrationen af bafilomycin A1. Hvis Herved sikres, at denne stigning ikke inducerer celledød. Alternativt kan bafilomycin A1 være substitueret med chloroquin eller andre forbindelser, der er i stand til at forøge pH-værdien af lysosomer.
Anvendelse af den beskrevne protokol vi succesfuldt kvantificeret procentdelen af senescentceller i myelomatose celler efter behandling med doxorubicin inden for en dag. Denne protokol kan bruges i othis cancer celletyper, men også i ikke-cancer celletyper. Den populære og overused β-galactosidaseanalyse, hvor den cellulære pH skal også kontrolleres, kræver mindst 2 dage. Faktisk den maksimale blå farve, opnået efter spaltning af X-gal ved β-galactosidase, der opnås efter 12 - 16 timer af inkubation 9.. Dette assay er derfor mere tidskrævende end den foreslåede cytometri assay. Desuden dette assay er ikke følsomme, fordi en blålig celle kan tælles som senescentcelleantigen samtidig være ikke rigtig ældede. Tabel 1 redegør for de fordele og ulemper til de to teknikker.
Den anden fordel ved denne metode er, at det kan kobles med immunfarvning af celleoverflade beslutningstagere. I tilfælde af myelomatose, har dette tilladt os at vise, at myelomatose cancerstamceller ikke senesce efter behandling med doxorubicin, mens ikke-cancerstamceller do 12. Ældning har vist sig at være pro-og anti-tumorigene. Da chemotherapeutical stoffer kan fremkalde degeneration kan studium ældning bliver vigtige i klinikken. Til dette formål har hurtige og følsomme assays, der skal anvendes, såsom assayet vi beskrevet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi takker SF 4206 Icore (Université de Caen) for anvendelsen af cytometri facilitet. JC modtog ph.d.-stipendier fra Conseil de Radioprotection d'EDF og Conseil Régional i Basse-Normandie. Disse data var en del af projekter finansieret af Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
