Summary
노화가 방지하거나 종양 논란이 계속 추진할지 여부를 지정합니다. chemotherapeutical 마약 senesce하는 암 세포를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 새로운 치료법을 제안 필수적이다. 그러나, 표준 및 널리 사용되는 β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 우리는 여기에서 노화를 정량화 할 수있는 신속하고 민감한 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다.
Abstract
인간의 세포는 무한정 증식하지 않는다. 외부 및 / 또는 내재적 단서에 따라, 세포는 죽거나 노화라는 안정적인 세포주기 정지를 입력 할 수 있습니다. 이러한 텔로미어 단축과 세포 분열 종양 유전자의 이상 발현 등 여러 세포 메커니즘은, 노화를 유발하는 것으로 알려져있다. 노화는 정상 세포에 국한되지 않고, 암 세포는 senesce보고되었다.
Chemotherapeutical 약물은 암 세포의 노화를 유발하는 것으로 알려져있다. 그러나 노화를 방지하거나 종양을 촉진하는지 논란이 남아있다. 그것은 결국 환자 특정 할 수 있듯이, 암 세포의 노화를 평가하기 위해 신속하고 민감한 방법은 빨리해야합니다.
이를 위해, 표준 β-갈 락토시다 분석, 현재 사용되는 방법은 주요 단점을 제공합니다 : 그것은 시간이 걸리고 문자를 구분하지 않습니다. 우리는 여기에서 리튬의 노화를 연구하는 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다세포를 쉬게. 이 분석은 민감하고 신속하다는 장점을 제공하며, 다양한 세포 마커의 immunolabeling의에 결합 할 수 있습니다.
Introduction
60 년대 초반과 헤이 플릭 및 무어 헤드의 발견 이후, 노화는 여전히 휴대 호기심 1 남아있다. 인간의 세포는 무한정 노화에 의해, 헤이 플릭 및 무어 노화의 세포 프로세스를 만들어 낸, 확산되지 않습니다. 노화는 세포의 죽음에 반대하는 세포 대사 활성 상태로 유지하는 안정적인 세포주기 정지됩니다. 텔로미어 단축, DNA 손상, 염색질 교란 및 세포 분열 종양 유전자의 이상 발현 2 일에 네 개의 세포 메커니즘은 노화를 유발하는 것으로 알려져있다. 이것은 정상 세포뿐만 아니라 의미뿐만 아니라 암 세포가 노화 3을받을 수 있습니다. 사실, 노화가 진행 암 세포는 더욱 종양의 진행 4-5 장벽을 구성하는 표시했다. 그러나 몇몇 보고서는 이제 특정 상황에서, 세포의 노화는 악성 6-7을 촉진 할 수 있다고 지적했다. 암 CEL의 노화를 연구LS는 현재 화학 요법 약물은 체외에서뿐만 아니라 생체 8뿐만 아니라 암 세포의 노화로 이어질 수 있습니다 사용되는 암 연구 충동이되기에 관하여이다.
노화 세포의 존재 여부를 조사하기 위해 마스터 분석은 산성 pH에서 β-갈 락토시다 분석이다. 이 조직 화학적 분석은 대부분 노화 세포에서 발생하는 리소좀 생합성 증가를 반영합니다. 간단히, 세포에 적용 외생 X-GAL는, 파랑 색 9 상승을주는, 노화 세포의 리소좀에 풍부한 β-갈 락토시다 제에 의해 절단되어있다. 블루 노화 세포는 그 시야 현미경으로 정량화 할 수있다. 매우 인기가 있지만, β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 첫째,이 분석은 고정 된 세포에서 수행됩니다. 그것은 현미경으로 노화 세포의 상당히 높은 숫자를 계산하여 노화의 정도를 정량화하는 것을 의미하기 때문에 둘째, 시간이 소요됩니다. 셋째,이 분석노화 및 비 - 노화 세포 사이의 차별은 전적으로 관찰자에 의존로 구분하지 않습니다.
우리는 여기에 살고 노화 세포의 존재 여부를 평가하기 위해 개발되지 않은, 빠른, 민감한 세포 계측법 기반의 분석을 설명합니다. 이 분석은 막 투과 분자의 분해, 5 dodecanoylaminofluorescein 디-β-D-갈 락토 피 라노 (C 12 FDG)을 기반으로, β-갈 락토시다 아제에 의해 노화 세포 충실. 가수 분해 및 레이저 여기 후, C 12 FDG 녹색 형광을 방출하기 때문에 유동 세포 계측법 10, 11에 의해 감지 할 수 있습니다. 유동 세포 계측법을 통해 노화 세포의 검출은 신속하고 민감의 큰 장점을 제공합니다. 또한, 유동 세포 계측법에 의한 노화 세포의 검출은 다른 세포 마커의 검출과 결합 할 수 있습니다. 이 분석은 화학 요법으로 치료 암 세포의 인구 내에서 노화 세포를 감지하는 데 사용할 수 있으며, 정기적으로 설정할 수 있습니다최대 조직 절편에서 세포 분리 후, 진료소합니다.
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Protocol
1. C12FDG, Bafilomycin A1, 및 세포 배양의 준비
- 20 mm의 최종 농도로 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 C 12 FDG 가루를 녹여. -20 ° C.에서 나누어지는 및 저장 DMSO는 적절한 안전 조건을 사용해야합니다.
- 0.1 mm의 최종 농도로 DMSO에 bafilomycin A1 가루를 녹여. 에서 나누어지는 및 저장 - 20 ° C. Bafilomycin는 적절한 안전 조건을 사용해야합니다.
- 37 10 % 소 태아 혈청과 1 % 항생제, ° C, 5 % CO 2를 포함하는 미디어, RPMI 8226 세포주 또는 부착하거나되지 않은 다른 세포 라인을 육성. 실험에 필요한 세포의 수를 추정한다. 유동 세포 계측법 분석 중에 이벤트의 충분한 수를 기록하기 위해, 5 × 10 5 세포가 필요합니다. 노화 세포의 비율을 결정하는 세 가지 세포 샘플이 필요합니다 : 레이블 샘플, 치료 세포가 C 12 FDG와 염색 처리 된 세포는 염색C 12 FDG.
- 세포가 세포 증식 곡선의 로그 상에 있도록 씨앗 세포를 24 시간 전에 실험을 수행.
2. 노화의 유도
- chemotherapeutical 약물을 추가하여 암 세포의 노화를 유도. 약물 농도와 치료 기간은 시험 세포 유형에 적응해야한다. 약 10 6 세포 / ML에 세포의 농도를 50 nm의 독소루비신의 최종 농도에서 48 시간 처리를 시작합니다. (대조군) 치료 샘플을 포함하는 것을 잊지 마십시오.
3. Bafilomycin A1 치료
- 이전 단계에서 사용 chemotherapeutical 약이 세포 사멸로 이어질 수도로, 판 블루 (V / V)로 혼합 세포에 의해 세포 생존을 확인합니다. Malassez 챔버를 입력하고 파란색 셀 (죽은 세포)와 백혈구 (살아있는 세포)의 수를 계산합니다. 생존의 비율이 70 % 미만인 경우 죽은 세포는 REM 수 있습니다보장하기 위해 적절한 장비를 사용하여 oved 죽은 세포 편견 후속 분석을하지 것이다.
- 문화 미디어를 제거하고 prewarmed 신선한 배양액으로 교체합니다. bafilomycin A1 100 nm의 최종 농도로 세포를 처리합니다. Bafilomycin A1은 리소좀의 산성 산도를 중화하는 데 사용됩니다. 37 ° C, 5 % CO 2에서 1 시간을 품어.
4. C 12 FDG 염색법
- 2 mm의 최종 농도 prewarmed 신선한 문화 매체에 C 12 FDG를 녹입니다.
- 33 μM의 최종 농도에서 세포에 화합물을 추가하고 37 2 시간을 품어 ° C, 5 % CO 2. 비 부착 세포를 사용하는 경우, 4 ° C (속도는 사용되는 세포 유형에 따라 조정해야 할 수도 있습니다)에서 5 분 300 XG에서 세포를 원심 분리, PBS로 2 배 씻는다. 차가운 PBS 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend. 자기편 세포를 사용하는 경우, 미디어를 제거하고 PBS로 2 배 씻는다. 트립신 용액 원심 분리기를 사용하여 부착 세포를 수확4시 5 분 300 XG에 세포 ° C (속도는 사용되는 세포 유형에 따라 조정해야 할 수도 있습니다). 차가운 PBS 500 μL에있는 세포 펠렛을 resuspend. 두 경우 모두, 세포 농도는 6 10 세포 / ㎖이어야한다.
- 또한 노화 세포의 인구의 특성을 공동 immunolabeling의를 수행합니다.
5. 유동 세포 계측법 분석
- 흐름 cytometer에의 제조업체에서 권장하는 제어 구슬을 사용하여 흐름 cytometer에를 보정합니다. 모든 단계는 적어도 10 4 이벤트가 기록되어야한다.
- 레이블이없는 세포를 포함하는 첫 번째 샘플을 실행합니다. 두 매개 변수가 그래픽 표시 앞으로 분산 형 채널 (FSC) 대 사이드 분산 형 채널 (SSC)를 준비합니다. 광전 튜브 (PMTS) 설정 및 샘플 준비 중에 등장했을 수 있습니다 죽은 세포와 세포 파편을 제외하고 관심 영역을 정의합니다. 로그 스케일에 FL1를 표시 한 매개 변수 히스토그램 게이트 관심이 지역을x 축과 y 축에서 이벤트의 수. 이벤트의 총 수는 분석 세포의 수를 나타냅니다. 레이블이 지정되지 않은 세포가 X 축 로그 규모에 첫 10 년에 나타나도록 PMT를 설정합니다. 필요한 경우 세포의자가 형광을 결정합니다.
- 치료 세포를 포함하는 두 번째 샘플을 실행합니다. FL1을 (C 12 FDG의 형광)를 표시 한 매개 변수 히스토그램에서 희미하게 표시 인구 후 커서를 놓습니다. 이 임계 값은 비 - 노화 세포 (희미하게 표시 셀) 및 노화 세포 (밝게 표시된 셀) 사이의 차별을 허용합니다.
- 치료 세포를 포함하는 세 번째 샘플을 실행합니다. 밝게 셀 라벨, 즉 노화 세포는 이전 단계에서 결정된 임계 값 이상으로 나타납니다. 이벤트의 총 수 당 밝은 이벤트의 수를 나누어 노화 세포의 비율을 평가한다. 필요한 경우, β-갈 락토시다 제의 활성은 평균 형광을 사용하여 추정 할 수있다강도.
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Representative Results
다발성 골수종, 혈액 악성 종양은 chemotherapeutical 절차에 의해 유도 된 노화를 평가하기 위해 사용되었다. 상업적으로 이용 가능한 MM 세포 라인 (RPMI 8226) 독소루비신, chemotherapeutical 약 2 일 동안 처리 하였다 이렇게하려면. 세포는 다음 bafilomycin A1 치료를 받게하고 추가 C 12 FDG와 함께 배양 하였다. 세포 유동 세포 계측법에 의해 분석 하였다. 그림 1은 노화 세포의 비율이 C 12 FDG의 사용 일 이내에 결정할 수있는 여러 단계와 쇼를 보여줍니다. 레이블이없는 세포는 흐름 cytometer에 최초로 실행되었다. 같은 그림 2a에서와 같이 관심 영역은 죽은 세포와 세포 파편을 제외 그래픽 FSC 대 SSC에 설정되었습니다. 관심이 지역에있는 세포는 x 축과 y 축에 이벤트의 수에 C 12 FDG (FL1)의 형광을 표시하는 막대 그래프에 다음 문이었다. 치료 세포를 분석 하였다.빨간색 커서가 묘사 그림으로 희미하게 표시 인구 후 설정 한 2B : 노화 세포가 지역에 존재합니다 V. 치료 세포가 이후 흐름 cytometer에에서 실행 된 반면, 비 노화 세포가 지역 U에 표시됩니다. 그림 2C (왼쪽 패널)와 같이 밝게 표시된 세포의 인구는 지역 V에서 이전에 설정 한 빨간색 커서 위에 나타났다. 이 인구는 노화 세포를 나타내며, 그 비율이 연속적으로 계산할 수 있습니다. 병렬로 같은 세포의 샘플 그림 (오른쪽 패널)와 같은 β-갈 락토시다 분석을 사용하여 염색 하였다. 이 대표 그림에서 완전히 파란색 셀 부분적으로 파란색 셀은 진정한 블루 노화 세포를 구별하는 데 어려움을 설명하기 위해 표시됩니다.
노화 세포의 비율의 결정에 C 12 FDG의 특이성을 설명하기 위해, 세포는 doxorubicin의 다양한 농도로 처리 하였다. 의 비율노화 세포는 그림 2B와 같이 결정 하였다. 사용되는 독소루비신 농도의 함수로 밝은 세포 증가의 비율은 그림 3과 같이. 이 C 12 FDG 라벨은 노화 세포에 특정한 것을 보여줍니다.
그림 1. 실험 계획 전반. 세포는 1 일 전에 24 시간 chemotherapeutical 약 2 치료를 파종 하였다. 실험의 날, 세포 Bafilomycin A1 3에서 다음 C12FDG 4 배양 하였다. 세포는 그 흐름 cytometer에 5에서 분석 하였다.
그림 2. 유동 세포 계측법 분석.이자 워싱턴 (A) 지역의 죽은 세포와 세포 파편을 제외 플롯 FSC 대 SSC를 결정했다. (B) 치료 세포가 흐름 cytometer에에서 실행되었으며 빨간 커서가 설정되었습니다. (C) 처리 세포가 흐름 cytometer에에서 실행되었다. 노화 세포는 빨간색 커서 위에 나타났다. U와 V는 각각의 관심 영역, 즉 비 노화 및 노화 세포를 나타냅니다. (D) 병행 (같은 샘플 같은 치료), 세포는 β-갈 락토시다 분석을 사용하여 염색 하였다. 노화 세포의 차별을 허용하는 임계 값을 설정하는 데 어려움을 보여 세포의 염색의 다양한 학위를 (완전히 파란색 셀, 부분적으로 파란색 셀) 있습니다. 앞으로 분산 형 채널 (FSC), 사이드 분산 형 채널 (SSC), 형광 1 (FL1).
그림 3. C 12의 특이성FDG 표시. 세포는 5 (어두운 회색 막대 그래프), 25 (밝은 회색 막대 그래프) 및 독소루비신의 50 nm의 (흰색 히스토그램)으로 처리 하였다. U이 아닌 노화 세포를 포함하는 영역을 나타냅니다. 노화 세포의 비율이 이벤트의 총 수 당 밝은 이벤트의 수를 나누어 계산됩니다. 노화 세포의 비율은 각각 0.8 %, 15.78 %, 5, 25의 선량 26.31 %, 50 nm의 독소루비신이다.
| 분석을 C12FDG | β-갈 락토시다 아제 분석 | |
| 감광도 | + | - |
| 비용 | = | = |
| 처리량 | + | - |
| 분석 기간 | - | + |
| 세포 유형에 적용 | = | = |
| 세포 | 셀을 라이브 | 고정 셀 |
| 전문 장비에 대한 요구 사항 | 흐름 cytometer에 | 시야 현미경 |
표 1. (-)와 (=)가 각각 부와 동등한 정도에 해당합니다. 반면 C 12 FDG의 세포 계측법 기반 분석 및 β-갈 락토시다 분석 (+)의 장점과 단점은 높은 수준에 해당합니다.
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Discussion
우리는 여기에서 살아있는 암세포의 세포 노화를 정량화하는 유동 세포 계측법 기반 방법을 제시 하였다. 이 방법은 막 투과 화합물 C 12 FDG의 사용을 기반으로하며, 화합물은 세포에 의해 촬영 그러므로 어떤 종류의 세포와 장기 등 다양한 치료 후 사용할 수 있습니다. 세포 흡수시, C 12 FDG는 노화 세포의 리소좀에 풍부한 β-갈 락토시다 아제에 의해 가수 분해됩니다. 레이저 여기 후, 화합물은 노화 세포의 정량화를 허용, 녹색 형광을 방출한다. 녹색 형광이 정량화도 유동 세포 계측법에 의해 또는 형광 현미경으로 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 경우, 형광 세포는 시간이 필요 관찰자에 의해 계산해야합니다. C 12 FDG는 β-갈 락토시다 아제로 가수 분해 때문에,이 메소드는 β-갈 락토시다 제의 활성을 정량화하기 위해, 노화 세포의 정량화에 추가, 수및 효소의 현지화 대부분 리소좀 소포에 제시한다. 방법은 간단하지만,주의 3 단계에 그려해야합니다. 노화 세포의 성공적인 탐지는 대부분 리소좀의 오른쪽 산도에 의존합니다. 이렇게하려면, 우리는 리소좀의 산성 산도를 중화하는 bafilomycin A1을 사용했다. 사용되는 세포의 종류에 따라이 단계가 필요하지 않을 수 있습니다. 노화가 예상되며 염색이 감지되지 않을 경우, 우리는 bafilomycin A1에 대한 부정적인 컨트롤 (없음 bafilomycin)를 포함하고 bafilomycin A1의 농도를 증가하는 것이 좋습니다. 이렇게하면,이 증가는 세포 죽음을 유도하지 않는 것을 확인합니다. 또한, bafilomycin A1은 클로로퀸이나 리소좀의 pH를 증가시킬 수있는 다른 물질로 대체 할 수 있습니다.
설명 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적 일에서 doxorubicin의 처리에 따라 다발성 골수종 세포에서 노화 세포의 비율을 정량화. 이 프로토콜은 OTH에서 사용할 수 있습니다어 암 세포 유형뿐만 아니라 비 암 세포 유형한다. 세포 산도도 제어해야하는 인기 남용 β-갈 락토시다 분석은 최소 2 일이 필요합니다. 실제로 β-갈 락토시다 아제에 의해 X-GAL의 절단 후 얻은 최대 파란 색깔은, 12 후에 이루어집니다 - 배양 9 16 시간을. 이 분석은 따라서 제안 된 세포 계측법 기반의 분석보다 더 많은 시간이 소요됩니다. 진정한 노화하지하면서 푸른 빛이 도는 셀 노화 세포로 간주 될 수 있기 때문에 또한,이 분석은 문자를 구분하지 않습니다. 두 가지 방법으로 표 1 recapitulates은 장점과 단점.
이 방법의 또 다른 장점은 세포 표면 제조 업체의 면역 염색과 결합 할 수 있다는 것입니다. 다발성 골수종의 경우, 이것은 우리가 그 이외의 암 줄기 세포가 12 수행하는 동안 다발성 골수종 암 줄기 세포가 다음 doxorubicin의 치료를 senesce하지 않는 표시 할 수 있습니다. 노화는 할 프로 및 안티 종양을 보였다. chemotherapeutical 약물이 노화를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 병원에서 중요한 될 수 있습니다. 이를 위해, 신속하고 민감한 분석은 우리가 여기에서 기술 분석으로 사용되어야한다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 세포 계측법 시설의 사용을위한 SF 4206 ICORE을 (캉 대학교) 감사합니다. JC는 헌법위원회 데 방사선 방호 디 EDF와 노르망디의 헌법위원회 지역에서 박사 후 장학금을 받았다. Comités 드 난 Orne의 등 뒤 칼바도스 - 해당 데이터는 리그 국립 contre 르 암에 의해 투자 프로젝트의 일환이었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
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