Summary
Enten senescence hindrer eller fremmer tumorigenesis fortsatt kontroversielt. Siden chemotherapeutical medikamenter kan indusere kreft celler til å senesce, studere senescence er avgjørende for å foreslå nye behandlingsformer. Imidlertid presenterer standard og bredt brukes β-galaktosidase-analyse store ulemper. Det foreslås her en hurtig og følsom flowcytometri-basert assay for å kvantifisere senescens.
Abstract
Menneskeceller ikke ubestemt tid sprer. Ved eksterne og / eller indre signaler, kan celler dør eller angi en stabil cellesyklus arrest kalt senescence. Mange cellulære mekanismer, for eksempel telomerer forkortes og unormal ekspresjon av mitogene onkogener, har vist seg å forårsake begynnende alderdom. Senescence er ikke begrenset til normale celler, kreftceller har også blitt rapportert å senesce.
Chemotherapeutical narkotika har vist seg å indusere senescence i kreftceller. Imidlertid er det fortsatt kontroversielt hvorvidt senescence hindrer eller fremmer tumorigenesis. Som det kan eventuelt være pasient-spesifikke, vil en hurtig og følsom metode for å vurdere senescens i kreftcelle snart være nødvendig.
For dette formål, presenterer standard β-galaktosidase-analyse, den for tiden brukte metode, store ulemper: det er tidkrevende og ikke følsom. Vi foreslår her en flowcytometri-baserte analysen for å studere senescence på live celler. Denne analysen har fordelen av å være hurtig, sensitiv og kan kobles sammen med den immunolabeling av ulike cellulære markører.
Introduction
Siden begynnelsen av sekstitallet og sin oppdagelse av Hayflick og Moorhead, forblir senescence fortsatt en mobil nysgjerrighet en. Menneskeceller ikke ubestemt tid spre seg og, etter senescence, Hayflick og Moorhead innførte mobilnettet aldringsprosessen. Senescence er en stabil cellesyklus-stans i hvilken celler forblir metabolsk aktive i motsetning til cellulær død. Hittil har fire cellulære mekanismene vist seg å indusere senescence: telomerer forkortes, DNA-skade, kromatin uro og unormal uttrykk for mitogene oncogenes to. Dette indikerer at ikke bare normale celler, men også kreftceller er i stand til å gjennomgå senescens 3.. Som et spørsmål om Faktisk ble kreftceller gjennomgår senescens vist seg å utgjøre en barriere mot ytterligere tumor progresjon 4-5. Imidlertid har flere rapporter nå påpekt at, under visse omstendigheter, kan cellular senescence også fremme malignitet 6-7. Studerer senescence av kreft cells er i ferd med å bli en trang i kreftforskning som i dag brukes cellegifter kan føre til senescence av kreftceller ikke bare in vitro, men også in vivo åtte.
Master analyse for å undersøke for tilstedeværelse av senescent celler er β-galaktosidase-analyse ved sur pH. Dette histochemical analysen reflekterer økt i lysosomalt biogenesis forekommer i de fleste senescent celler. Kort fortalt blir eksogene X-gal, anvendt på celler, spaltet ved β-galaktosidase anriket på lysosomene til senescent celler, gir opphav til en blå farge 9.. De blå senescent cellene kan da kvantifiseres under et sterkt felt mikroskop. Selv om svært populært, presenterer β-galaktosidase analysen store ulemper. Først blir denne analysen utført på faste celler. For det andre er det tidkrevende, fordi det innebærer å kvantifisere graden av senescence ved å telle en betydelig høyt antall senescent cellene under et mikroskop. Tredje, denne analysener ikke følsom som diskriminering mellom senescent og ikke-senescent celler helt avhengig av observatøren.
Vi diskuterer her et uutnyttet, rask og følsom cytometry-baserte analysen å vurdere for tilstedeværelse av levende senescent celler. Denne analysen er basert på hydrolyse av en permeabel membran molekyl, 5-di-dodecanoylaminofluorescein β-D-galaktopyranosid (C 12 FDG), ved β-galaktosidase anriket på senescent celler. Etter hydrolyse og laser-eksitasjon, avgir C 12 FDG grønn fluorescens og kan derfor påvises ved flyt-cytometri 10, 11 sammen. Påvisning av senescent celler via flow cytometri byr den store fordel av å være hurtig og følsom. I tillegg kan påvisning av senescent celler ved flow cytometri være kombinert med påvisning av andre cellulære markører. Denne analysen kan brukes til å detektere senescent celler i en populasjon av kreftceller behandlet med kjemoterapi og kan rutinemessig sattopp på vevsdelene, etter mobilnettet dissosiasjon, i klinikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Utarbeidelse av C12FDG, Bafilomycin A1, og cellekultur
- Oppløs C 12 FDG pulver i dimetylsulfoksyd (DMSO) til en sluttkonsentrasjon på 20 mM. Delmengde og oppbevar ved -20 ° C. DMSO bør brukes med passende sikkerhetsforhold.
- Oppløs bafilomycin A1 pulver i DMSO til en endelig konsentrasjon på 0,1 mM. Delmengde og oppbevares ved - 20 ° C. Bafilomycin bør brukes med passende sikkerhetsforhold.
- Dyrk RPMI 8226-cellelinjen, eller andre cellelinjer heftende eller ikke, i media inneholdende 10% føtalt bovint serum og 1% antibiotika, ved 37 ° C, 5% CO2. Estimer antall celler som er nødvendig for forsøket. For å kunne ta opp et tilstrekkelig antall hendelser i løpet av strømningscytometri-analyse, er 5 x 10 5 celler som kreves. Å fastslå hvor stor prosentandel av senescent celler, er tre celleprøver kreves: umerket prøve, ubehandlede celler farget med C 12 FDG, behandlede celler farget medC 12 FDG.
- Seed cellene 24 timer før å utføre forsøket, slik at cellene er i log-fasen av cellulær proliferasjon kurve.
2. Induksjon av Senescence
- Indusere senescence av kreftceller ved å legge en chemotherapeutical narkotika. Medikament-konsentrasjonen og varigheten av behandlingen bør være tilpasset den celletype testet. Begynn med en 48 timers behandling ved endelig konsentrasjon på 50 nM doksorubicin for en konsentrasjon av celler på omtrent 10 6 celler / ml. Ikke glem å ta med ubehandlet prøve (negativ kontroll).
3. Bafilomycin A1 Treatment
- Kontroller cellenes levedyktighet ved å blande cellene med trypan blå (v / v), som chemotherapeutical stoffet som brukes i det foregående trinn kunne føre til celle-apoptose. Fyll inn et Malassez kammer og telle antall blå celler (døde hudceller) og hvite celler (levende celler). Hvis prosentandelen av levedyktigheten er mindre enn 70%, kan være døde celler removed med et passende kit for å sikre at døde celler vil ikke forspenne påfølgende analyse.
- Fjern kultur media og erstatte med forvarmet frisk kultur media. Behandle cellene med en sluttkonsentrasjon på 100 nM av bafilomycin A1. Bafilomycin A1 brukes for å nøytralisere den sure pH i lysosomene. Inkuber 1 time ved 37 ° C, 5% CO 2.
4. C 12 FDG Farging
- Oppløs C 12 FDG i forvarmet friskt kulturmedium til en sluttkonsentrasjon på 2 mM.
- Tilsett forbindelsen til cellene ved en sluttkonsentrasjon på 33 mM og inkuberes 2 timer ved 37 ° C, 5% CO2. Ved hjelp av ikke-adherente celler, sentrifuger cellene ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C (hastighet kan måtte justeres til den celletype som brukes), vaskes 2 ganger med PBS. Cellepelleten suspenderes i 500 mL av kald PBS. Hvis du bruker heftende celler, fjerner media og vask 2x med PBS. Høste heftende celler ved hjelp av trypsin løsning og sentrifugercellene ved 300 xg i 5 min ved 4 ° C (hastighet kan måtte justeres til den celletype som brukes). Cellepelleten suspenderes i 500 mL av kald PBS. I begge tilfeller bør cellekonsentrasjonen være omtrent 10 6 celler / ml.
- Utfør en co-immunolabeling til videre karakterisere bestanden av senescent celler.
5. Flowcytometrisystemer Analysis
- Kalibrere strømningscytometeret hjelp kontrollperlene anbefalt av produsenten av strømningscytometeret. For alle trinn, minst 10 fire hendelser må tas opp.
- Kjør den første prøve som inneholdt ikke-karakteriserte celler. Forbered en to-parameter grafisk visning Forward Scatter Channel (FSC) versus sidespredning Channel (SSC). Still fotomultiplikatorrør (PMTs) og definerer et område av interesse unntatt døde celler og cellulære rusk som kan ha dukket opp i løpet av prøveopparbeidelse. Gate denne regionen av interesse i en en-parameter histogrammet viser FL1 på logskalaenav x-aksen og antallet hendelser i y-aksen. Det totale antall hendelser representerer det antall celler som ble analysert. Still inn PMT slik at umerkede celler vises i det første tiåret på loggen omfanget av x-aksen. Bestem autofluorescence av cellene ved behov.
- Kjør den andre prøve som inneholdt ubehandlede celler. På den ene-parameter histogrammet viser FL1 (fluorescens av C 12 FDG), plasserer du markøren etter svakt merket befolkningen. Denne terskel vil tillate diskriminering mellom ikke-senescent celler (svakt merkede celler) og senescent celler (lyst merkede celler).
- Kjør den tredje prøven inneholder behandlede celler. Lyst merket celler, dvs. senescent celler vises over terskelen fastsatt i forrige trinn. Vurdere hvor stor prosentandel av senescent celler ved å dividere antall lyse hendelser per totalt antall hendelser. Hvis nødvendig, kan aktiviteten av β-galaktosidase også estimeres ved hjelp av den midlere fluorescensintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multippelt myelom, en hematologisk malignitet, ble brukt til å evaluere senescens indusert av en chemotherapeutical prosedyre. For å gjøre dette en kommersielt tilgjengelig MM cellelinje (RPMI 8226) ble behandlet for to dager med doksorubicin, en chemotherapeutical stoffet. Cellene ble deretter underkastet bafilomycin A1 behandling og videre inkubert med C 12 FDG. Cellene ble analysert ved strømningscytometri. Figur 1 illustrerer de ulike trinnene og viser at prosentandelen av senescent celler kan bestemmes i løpet av en dag med bruk av C-12 FDG. Umerkede celler ble kjørt først i strømningscytometer. Som vist i figur 2A, ble en region av interesse ligger på den grafiske FSC versus SSC å ekskludere døde celler og cellulært avfall. Celler i dette området av interesse ble deretter separert på histogrammet som viser fluorescens C 12 FDG (FL1) på x-aksen og antall hendelser på y-aksen. Den ubehandlede celler ble analysert. Enrød markør ble satt etter svakt merket befolkningen som avbildet figur 2B: ikke senescent celler vises i regionen U, mens senescent cellene vil være til stede i regionen V. De behandlede celler ble deretter kjørt i strømningscytometeret. En populasjon av sterkt merkede celler viste seg over den røde markøren tidligere angitt, i området V, som vist Fig. 2C (venstre panel). Denne populasjonen representerer senescent celler og deres andel i ettertid kan beregnes. Parallelt ble den samme celle prøven farget med β-galaktosidase-analysen som er avbildet (høyre panel). I dette representativt bilde, er helt blå celler og delvis blå celler vist for å illustrere hvor vanskelig å diskriminere virkelig blå senescent celler.
For å illustrere spesifisiteten av C-12 FDG i bestemmelse av prosentandelen av senescent celler, ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av doksorubicin. Andelensenescent-celler ble bestemt som i figur 2B. Prosentandelen av lyse cellene øker som en funksjon av doksorubicin konsentrasjonen som anvendes, som vist i figur 3.. Dette viser at C 12 FDG merking er spesifikk for senescent celler.
Figur 1. Generelle ordningen av forsøket. Celler ble utsådd 1 24 timer før behandling med den chemotherapeutical legemiddel 2. På dagen for eksperimentet, ble cellene inkubert med Bafilomycin A1 3 og deretter med C12FDG 4.. Cellene ble deretter analysert på flowcytometer 5..
Figur 2. Strømningscytometri-analyse. (A) et område av interesse was fast bestemt på tomten FSC versus SSC å utelukke døde celler og cellulære rusk. (B) De ubehandlede celler ble kjørt i strømningscytometeret og den røde markøren var satt. (C) De behandlede celler ble kjørt i strømningscytometeret. De senescent celler dukket opp over den røde markøren. U-og V representerer de regioner av interesse, dvs. ikke senescent og senescent celler, respektivt. (D) Parallelt (samme prøve, samme behandling), ble cellene farget med β-galaktosidase-analyse. Legg merke til den varierende grad av farging av cellene (helt blå celler, delvis blå celler), som illustrerer vanskeligheten med å sette en terskel som tillater diskriminering av senescent celler. Forward Scatter Channel (FSC), Side Scatter Channel (SSC), en fluorescens (FL1).
Figur 3. Spesifisitet av C 12FDG merking. Celler ble behandlet med 5 (mørk grå histogram), 25 (lys grå histogram) og 50 nM (hvit histogram) doksorubicin. U representerer region inneholder ikke-senescent celler. Prosentandelen av senescent cellene er evaluert ved å dividere antall lyse hendelser per totalt antall hendelser. Prosentandelene av senescent celler er 0,8%, 15,78%, 26,31% ved en dose på 5, 25, og 50 nM doksorubicin, henholdsvis.
| C12FDG analysen | β galaktosidase-assay | |
| Følsomhet | + | - |
| Koste | = | = |
| Gjennomstrømming | + | - |
| Analysen varighet | - | + |
| Anvendbarhet til celletype | = | = |
| Celler | Lever celle | Fast celle |
| Krav til spesialisert utstyr | Strømningscytometer | Bright-feltet mikroskop |
Tabell 1. . Fordeler og ulemper ved den C-12 FDG cytometri baserte analysen og den β-galaktosidase-analyse (+) tilsvarer høyere grad, mens (-) og (=) tilsvarer mindre og tilsvarende grader, henholdsvis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenteres her en flowcytometri-basert metode for å kvantifisere mobilnettet senescence i levende kreftceller. Denne metoden er basert på bruk av membranen permeabel forbindelse, C 12 FDG, og kan derfor benyttes i alle celletyper og etter forskjellige behandlinger så lenge forbindelsen blir tatt opp av cellene. Ved cellulært opptak, er C 12 FDG hydrolysert ved β-galaktosidase, anriket på lysosomene til senescent celler. Etter laser eksitasjon, avgir det sammensatte grønn fluorescens, noe som åpner for kvantifisering av senescent celler. Denne kvantifisering av grønn fluorescens kan enten gjøres ved strømningscytometri eller ved fluorescens mikroskopi. Men i dette tilfellet vil fluorescerende celler må regnes med ved den observatør, noe som krever tid. Siden C 12 FDG hydrolyseres ved β-galaktosidase gir denne metoden, i tillegg til kvantifisering av senescent celler, for å kvantifisere aktiviteten av β-galaktosidaseog lokalisering av enzymet, for det meste er tilstede i lysosomal vesikkel. Selv om metoden er enkel, bør man også være oppmerksom på trinn 3. Den vellykkede påvisning av senescent celler sterkt avhengig av den riktige pH i lysosomene. For å gjøre dette, brukte vi bafilomycin A1 å nøytralisere den sure pH i lysosomer. Avhengig av hvilken celletype som brukes, kan dette trinnet ikke være nødvendig. Hvis senescence er forventet og ingen farging blir oppdaget, foreslår vi å inkludere en negativ kontroll for bafilomycin A1 (ingen bafilomycin) og øke konsentrasjonen av bafilomycin A1. Hvis du gjør det, sørge for at denne økningen ikke indusere celledød. Alternativt kan bafilomycin A1 være substituert med klorokin eller eventuelle andre forbindelser som er i stand til å øke pH i lysosomene.
Ved hjelp av den beskrevne protokollen, vi får tallfestet andelen av senescent celler i myelomatose celler etter doksorubicin behandling innen en dag. Denne protokollen kan brukes i otheh typer cancerceller, men også i ikke-typer cancerceller. Den populære, og det brukes for mye β-galaktosidase-assay, hvor den cellulære pH må også styres, krever minst 2 dager. Faktisk er den maksimale blå farge, som ble oppnådd etter spaltning av X-gal ved β-galaktosidase, oppnås etter 12-16 timer med inkubering 9.. Denne analysen er derfor mer tidkrevende enn den foreslåtte cytometri baserte analysen. Dessuten er denne analysen ikke sensitive fordi en blålig celle kan bli regnet som senescent celle mens den er ikke virkelig senescent. De Tabell 1 sammenfatter de fordeler og ulemper for de to teknikkene.
Den annen fordel med denne metoden er at den kan kobles med den farging av celleoverflaten brett. I tilfelle av multiple myelom, dette har tillatt oss å vise at multippel myelom kreft stamceller ikke senesce følgende doksorubicin behandling, mens ikke-kreft stamceller gjøre 12.. Senescence har vist seg å være pro-og anti-tumorigent. Siden chemotherapeutical medikamenter kan indusere senescence kan studere senescence bli viktig i klinikken. For dette formål, raske og sensitive analyser har til å bli brukt, for eksempel analysen som beskrives her, vi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker SF 4206 icore (Université de Caen) for bruk av cytometry anlegget. JC fikk postdocs fra Conseil de strålevern d'EDF og Conseil Régional av Basse-Normandie. Disse data var en del av prosjekter finansiert av Ligue Nationale contre le Cancer - comites de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
