Summary
Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.
Abstract
Menselijke cellen niet onbeperkt vermenigvuldigen. Bij externe en / of extrinsieke factoren, kan cellen sterven of voer een stabiele celcyclus genoemd senescentie. Verschillende cellulaire mechanismen, zoals telomere verkorting en abnormale expressie van oncogenen mitogene, is aangetoond dat veroudering veroorzaken. Senescentie is niet beperkt tot normale cellen, kankercellen ook gerapporteerd senesce.
Chemotherapeutische geneesmiddelen is aangetoond senescentie induceren in kankercellen. Het blijft echter controversieel of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan van tumoren. Omdat het uiteindelijk misschien patiëntspecifieke, zal een snelle en gevoelige methode voor senescentie in kankercel beoordelen binnenkort nodig.
Daartoe de standaard β-galactosidase assay, de gebruikelijke methode nog voor grote nadelen: het is tijdrovend en ongevoelig. We stellen hier een doorstroomcytometrie-gebaseerde test senescentie op li bestuderenve cellen. Deze test heeft het voordeel dat snelle, gevoelige, en kan worden gekoppeld met de immunokleuring van verschillende cellulaire markers.
Introduction
Sinds begin jaren zestig en de ontdekking door Hayflick en Moorhead, veroudering blijft een cellulair nieuwsgierigheid 1. Menselijke cellen niet onbeperkt groeien en, door veroudering, Hayflick en Moorhead bedacht de cellulaire proces van veroudering. Senescentie is een stabiel celcyclus waarbij cellen metabool actief blijven in tegenstelling tot celdood. Tot op heden hebben vier cellulaire mechanismen aangetoond dat veroudering veroorzaken: telomeerverkorting, DNA-schade, chromatine verstoring, en abnormale expressie van mitogene oncogenen 2. Dit geeft aan dat niet alleen normale cellen maar ook kankercellen kunnen ondergaan senescentie 3. Als een zaak van de feiten, werden kankercellen ondergaan veroudering aangetoond dat een barrière voor verdere progressie van de tumor 4-5 vormen. Toch hebben verschillende rapporten nu op gewezen dat, onder bepaalde omstandigheden, kan cellulaire veroudering ook bevorderen maligniteit 6-7. Studeren veroudering van kanker cells is ongeveer om een drang in kankeronderzoek zoals momenteel gebruikte chemotherapeutische geneesmiddelen kan leiden tot veroudering van kankercellen niet alleen in vitro, maar ook in vivo 8 geworden.
De master assay te onderzoeken op de aanwezigheid van verouderde cellen is β-galactosidase assay bij zure pH. Dit histochemische test weerspiegelt de toegenomen lysosomale biogenese zich in de meeste verouderde cellen. Kort exogene X-gal, toegepast op cellen, wordt gesplitst door β-galactosidase verrijkt in lysosomen van verouderde cellen, waardoor een blauwe kleur 9. De blauwe verouderde cellen kunnen vervolgens worden gekwantificeerd onder een helder veld microscoop. Hoewel zeer populair, de β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. Eerst wordt deze test uitgevoerd op gefixeerde cellen. Ten tweede is tijdrovend omdat het impliceert de mate van senescentie kwantificeren door telling significant groot aantal verouderde cellen onder een microscoop. Ten derde, het assayis niet gevoelig als de discriminatie tussen verouderde en niet-verouderde cellen vertrouwt volledig op de waarnemer.
We bespreken hier een onontgonnen, snelle en gevoelige cytometrie-gebaseerde test om te beoordelen op de aanwezigheid van levende verouderde cellen. Deze test is gebaseerd op de hydrolyse van een doorlatend membraan molecuul, de 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (FDG C 12), door β-galactosidase verrijkt in verouderde cellen. Na hydrolyse en laser excitatie, de C 12 FDG zendt groene fluorescentie en derhalve worden gedetecteerd door flow cytometrie 10, 11. De detectie van verouderde cellen via flowcytometrie biedt het grote voordeel dat snelle en gevoelige. Bovendien kan detectie van verouderde cellen door flowcytometrie worden gekoppeld aan de detectie van andere cellulaire markers. Deze test kan worden gebruikt om verouderde cellen te detecteren in een populatie van kankercellen behandeld met chemotherapie en kan routinematig wordenup op weefselcoupes, na cellulaire dissociatie, in de kliniek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van C12FDG, bafilomycine A1 en Cultuur van de Cel
- Los de C 12 FDG poeder in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van 20 mM. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. DMSO moet worden gebruikt met de juiste veiligheidsvoorschriften.
- Los het poeder bafilomycine A1 in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM. Aliquot en bewaar bij - 20 ° C. Bafilomycine moet worden gebruikt met de juiste veiligheidsvoorschriften.
- Cultiveren RPMI 8226 cellijn of andere cellijnen hechtende of niet, in medium dat 10% foetaal runderserum en 1% antibiotica, bij 37 ° C, 5% CO2. Schat het aantal cellen nodig voor het experiment. Om een voldoende aantal gebeurtenissen vast tijdens de flowcytometrie-analyse, worden 5 x 10 5 cellen vereist. Om het percentage van verouderde cellen te bepalen, worden drie mobiele monsters vereist: unlabeled monster onbehandelde cellen gekleurd met C 12 FDG, behandelde cellen gekleurd metC 12 FDG.
- Zaad van de cellen 24 uur voorafgaande uitvoeren van de proef zodat cellen zijn in de log-fase van de cellulaire proliferatie curve.
2. Inductie van Senescentie
- Induceren senescentie van kankercellen door toevoeging van een chemotherapeutische middel. Geneesmiddelconcentratie en duur van de behandeling moeten worden afgestemd op het soort cel getest. Begin met een 48 uur behandeling in de uiteindelijke concentratie van 50 nM doxorubicine een concentratie van cellen op ongeveer 10 6 cellen / ml. Vergeet niet om onbehandelde monster bevatten (negatieve controle).
3. Bafilomycine A1 Behandeling
- Controleer cellevensvatbaarheid door het mengen cellen met trypan blauw (v / v), als chemotherapeutische geneesmiddel die in de vorige stap kan leiden tot apoptose. Vullen in een Malassez kamer en tel het aantal blauwe cellen (dode cellen) en witte bloedcellen (levende cellen). Indien het percentage van de levensvatbaarheid is minder dan 70%, zou dode cellen rem zijnoved met een geschikte kit om ervoor te zorgen dat de dode cellen zal niet vooringenomenheid de daaropvolgende analyse.
- Verwijder de cultuur media en vervangen door voorverwarmde verse voedingsbodems. Behandel de cellen met een uiteindelijke concentratie van 100 nM van bafilomycine A1. Bafilomycine A1 wordt gebruikt om de zure pH van lysosomen neutraliseren. Incubeer 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
4. C 12 FDG kleuring
- Los C 12 FDG in voorverwarmde verse kweekmedia tot een eindconcentratie van 2 mM.
- Voeg de verbinding aan cellen in een eindconcentratie van 33 uM en incubeer 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Bij gebruik van niet-hechtende cellen, de cellen gecentrifugeerd bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C (de snelheid zou moeten worden aangepast aan het gebruikte celtype), 2x wassen met PBS. Resuspendeer de celpellet in 500 ul koude PBS. Bij gebruik van hechtende cellen, verwijder de media en was 2x met PBS. Oogst de hechtende cellen met behulp van een trypsine-oplossing en centrifugecellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C (de snelheid zou moeten worden aangepast aan het gebruikte celtype). Resuspendeer de celpellet in 500 ul koude PBS. In beide gevallen moet de celconcentratie ongeveer 10 6 cellen / ml.
- Voer een co-immunokleuring om verder te karakteriseren van de bevolking van verouderde cellen.
5. Flowcytometrieanalyse
- Kalibreer de flowcytometer met de controlekorrels aanbevolen door de fabrikant van de flowcytometer. Voor alle stappen, minstens 10 4 events moeten worden geregistreerd.
- Voer het eerste monster dat niet-gemerkte cellen. Bereid een twee-parameter grafische weergave Forward Scatter Channel (FSC) versus Side Scatter Channel (SSC). Stel de fotovermenigvuldigingsbuizen (PMT) en definiëren een van belang zonder dode cellen en celresten dat tijdens de monsterbereiding kunnen zijn verschenen. Gate deze regio van belang in een een-parameter histogram weergave VT1 op de log-schaalde x-as en het aantal gebeurtenissen in de y-as. Het totale aantal gebeurtenissen is het aantal geanalyseerde cellen. Stel de PMT zodat ongelabelde cellen worden weergegeven in de eerste tien op de log schaal van de x-as. Bepaal de autofluorescentie van de cellen indien nodig.
- Voer het tweede monster met onbehandelde cellen. Op de een-parameter histogram weergave FL1 (fluorescentie van C 12 FDG), plaatst u de cursor na de schaars label bevolking. Deze drempel zal het onderscheid tussen niet-verouderde cellen (slecht gelabelde cellen) en verouderde cellen (fel gelabelde cellen) toestaan.
- Voer het derde monster dat behandelde cellen. Helder gemerkte cellen, dwz verouderde cellen worden boven de drempelwaarde in het voorgaande stap. Evalueer het percentage van verouderde cellen door het aantal lichte events per het totale aantal gebeurtenissen. Indien nodig, kan de activiteit van de β-galactosidase worden geschat met behulp van de gemiddelde fluorescentieintensiteit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multiple Myeloma, een hematologische maligniteit, werd gebruikt om de senescentie geïnduceerd door chemotherapeutische methoden te beoordelen. Daartoe is een commercieel beschikbare MM cellijn (RPMI 8226) werd behandeld voor 2 dagen met doxorubicine, een chemotherapeutische geneesmiddelen. De cellen werden vervolgens onderworpen aan bafilomycine A1 behandeling en verder geïncubeerd met C 12 FDG. Cellen werden geanalyseerd door flow cytometrie. Figuur 1 toont de verschillende stappen en laat zien dat het percentage verouderde cellen kan worden bepaald binnen een dag met gebruik van C 12 FDG. Ongelabelde cellen werden voor het eerst uitgevoerd in de flowcytometer. Zoals weergegeven in figuur 2A, werd een gebied van belang te stellen op de grafische FSC versus SSC om dode cellen en cellulaire puin te sluiten. Cellen in dit gebied plaats werden vervolgens afgesloten in het histogram weergeven van de fluorescentie van C 12 FDG (FL1) op de x-as en het aantal gebeurtenissen op de y-as. De onbehandelde cellen werden geanalyseerd. Eenrode cursor werd ingesteld na de schaars bestempeld bevolking zoals afgebeeld Figuur 2B: niet verouderde cellen zal verschijnen in de regio U, terwijl verouderde cellen aanwezig zullen zijn in regio V. De behandelde cellen werden daarna uitgevoerd in de flowcytometer. Een populatie van helder gelabelde cellen verscheen boven de rode cursor eerder hebt ingesteld, in de regio V, zoals weergegeven figuur 2C (linker paneel). Deze populatie vertegenwoordigt verouderde cellen en hun percentage kan vervolgens worden berekend. Daarnaast werd hetzelfde celmonster gekleurd met de β-galactosidase assay zoals voorgesteld (rechter paneel). In deze representatief beeld, zijn volledig blauwe cellen en gedeeltelijk blauwe cellen aangetoond dat de moeilijkheid om echt blauw verouderde cellen discrimineren illustreren.
Om de specificiteit van C 12 FDG in de bepaling van het percentage van verouderde cellen te illustreren, werden de cellen behandeld met verschillende concentraties van doxorubicine. Het percentageverouderde cellen werd bepaald zoals in figuur 2B. Het percentage lichte cellen toeneemt als functie van de concentratie doxorubicine als getoond in figuur 3. Dit toont aan dat C 12 FDG labeling specifiek voor verouderde cellen.
Figuur 1. Algemene opzet van het experiment. Cellen werden uitgezaaid 1 24 uur vóór de behandeling met de chemotherapeutische geneesmiddelen 2. Op de dag van het experiment werden cellen geïncubeerd met bafilomycine A1 3 en vervolgens met C12FDG 4. Cellen werden vervolgens geanalyseerd op de flowcytometer 5.
Figuur 2. Flowcytometrie-analyse. (A) Een regio van belang was bepaald op het perceel FSC versus SSC om dode cellen en cellulaire puin te sluiten. (B) De onbehandelde cellen werden uitgevoerd in de flowcytometer en de rode cursor is ingesteld. (C) De behandelde cellen werden uitgevoerd in de flowcytometer. De verouderde cellen verscheen boven de rode cursor. U en V geven de gebieden van belang, dwz niet verouderde en verouderde cellen. (D) Parallel (hetzelfde monster, dezelfde behandeling) werden de cellen gekleurd met de β-galactosidase assay. Let op de verschillende mate van kleuring van de cellen (blauwe cellen volledig, gedeeltelijk blauwe cellen), die de moeilijkheid om een drempel waardoor de discriminatie van verouderde cellen vastgesteld illustreert. Forward Scatter Channel (FSC), Side Scatter Channel (SSC), Fluorescentie 1 (FL1).
Figuur 3. Specificiteit van de C 12FDG labeling. Cellen werden behandeld met 5 (donker grijs histogram), 25 (lichtgrijs histogram) en 50 nM (wit histogram) van doxorubicine. U vertegenwoordigt de regio die niet-verouderde cellen. Het percentage verouderde cellen wordt geëvalueerd door het aantal lichte events per het totale aantal gebeurtenissen. De percentages van verouderde cellen zijn 0.8%, 15,78%, 26,31% bij een dosis van 5, 25, en 50 nM doxorubicine, respectievelijk.
| C12FDG assay | β-galactosidase assay | |
| Gevoeligheid | + | - |
| Kosten | = | = |
| Throughput | + | - |
| Assay duur | - | + |
| Toepasselijkheid op celtype | = | = |
| Cellen | Wonen cel | Vaste cel |
| Vereiste voor gespecialiseerde apparatuur | Doorstroomcytometer | Helderveld microscoop |
Tabel 1. . Voordelen en nadelen van de C 12 FDG cytometry gebaseerde test en (+) de β-galactosidase test voldoet aan hogere while (-) en (=) corresponderen met kleine en gelijkwaardige graden respectievelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
We presenteerde hier een flowcytometrie-gebaseerde methode om cellulaire veroudering in levende kankercellen te kwantificeren. Deze methode is gebaseerd op het gebruik van het membraan permeabele stof, de C 12 FDG, en kan daarom worden gebruikt in een cel types en na verschillende behandelingen zolang de verbinding wordt opgenomen door de cellen. Bij cellulaire opname, de C 12 FDG gehydrolyseerd door β-galactosidase, verrijkt in lysosomen van verouderde cellen. Na laser excitatie, de verbinding zendt groene fluorescentie, waardoor kwantificatie van verouderde cellen. Dit kwantificering van de groene fluorescentie kan worden gedaan door middel van flowcytometrie of fluorescentiemicroscopie. In dit geval fluorescerende cellen worden geteld door de waarnemer, die veel tijd. Aangezien de C 12 FDG gehydrolyseerd door β-galactosidase, maakt deze werkwijze, naast de kwantificering van verouderde cellen, de activiteit van de β-galactosidase kwantificerenen de lokalisatie van het enzym, meestal aanwezig in lysosomale vesicle. Hoewel de werkwijze is eenvoudig, zij gewezen op stap 3. Het succesvol opsporen van verouderde cellen berust meestal op de juiste pH-waarde van de lysosomen. Hiervoor gebruikten we bafilomycine A1 de zure pH van lysosomen neutraliseren. Afhankelijk van het gebruikte celtype, kan deze stap niet vereist. Als veroudering wordt verwacht en geen kleuring wordt gedetecteerd, raden wij u aan een negatieve controle voor bafilomycine A1 (geen bafilomycine) op te nemen en de concentratie van bafilomycine A1 verhogen. Als dit zo is, ervoor te zorgen dat deze toename niet celdood. Alternatief kan bafilomycine A1 zijn gesubstitueerd met chloroquine of andere verbindingen die in staat zijn om de pH van lysosomen verhogen.
Met de werkwijze beschreven protocol hebben we met succes gekwantificeerd percentage ouder wordende cellen in multiple myeloma cellen na doxorubicinebehandeling binnen een dag. Dit protocol kan in other typen kankercellen, maar ook in niet-kankercellen celtypen. De populaire en veel gebruikte β-galactosidase assay, waarbij de cellulaire pH moet worden geregeld, zijn minstens 2 dagen. Inderdaad de maximale blauwe kleur, verkregen na de splitsing van X-gal door β-galactosidase, wordt na 12-16 uur incubatie 9. Deze assay is daarom tijdrovend dan de voorgestelde cytometrie gebaseerde test. Bovendien is deze test niet gevoelig omdat een blauwachtige cel zou worden geteld als senescent cel terwijl ze niet echt senescent. De tabel 1 recapituleert de voor-en nadelen van de twee technieken.
Het andere voordeel van deze methode is dat het kan worden gekoppeld met de immunokleuring van celoppervlak makers. In het geval van multiple myeloma, heeft zo konden we zien dat veelvoudige myeloma kanker stamcellen niet volgende doxorubicinebehandeling senesce, terwijl niet-kanker stamcellen doen 12. Senescentie is aangetoond dat pro-en anti-tumorigene. Sinds chemotherapeutische geneesmiddelen kan veroudering veroorzaken, studeren veroudering belangrijk zou kunnen worden in de kliniek. Daartoe snelle en gevoelige testen moeten worden gebruikt, zoals de assay we hier beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de SF 4206 Icore (Universite de Caen) voor het gebruik van de cytometrie faciliteit. JC ontvangen post-doctorale beurzen van Conseil de radioprotectie d'EDF en de Conseil Regional van Basse-Normandie. Die gegevens waren onderdeel van gefinancierd door de Ligue Nationale contre le Cancer projecten - Comites de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
