Summary
Vare senescence förhindrar eller främjar tumörbildning förblir kontroversiell. Eftersom chemotherapeutical droger kan framkalla cancerceller att senesce, studera åldrande är viktigt för att föreslå nya terapier. Presenterar emellertid standard och välanvända β-galaktosidas-analysen stora nackdelar. Vi föreslår här en snabb och känslig flödescytometri-baserad analys för att kvantifiera senescens.
Abstract
Mänskliga celler inte på obestämd tid föröka sig. Vid externa och / eller inneboende ledtrådar, kan celler dör eller ange en stabil cellcykelstopp kallas åldrande. Flera cellulära mekanismer, såsom telomerförkortning och onormalt uttryck av mitogena onkogener, har visat sig orsaka åldrande. Åldrande är inte begränsad till normala celler, cancerceller har också rapporterats att senesce.
Chemotherapeutical läkemedel har visats inducera åldrande i cancerceller. Det är dock fortfarande kontroversiellt om åldrande hindrar eller främjar tumörbildning. Eftersom det kan så småningom vara patient-specifika, kommer en snabb och känslig metod för att bedöma senescence i cancercellen snart krävas.
För detta ändamål uppvisar den vanliga β-galaktosidas-analysen, det för närvarande använda metoden, stora nackdelar: det är tidskrävande och inte känsliga. Vi föreslår här en flödescytometri-baserad analys för att studera åldrande på live celler. Denna analys erbjuder fördelen av att vara snabb, känslig och kan vara kopplat till immunomärkning av olika cellulära markörer.
Introduction
Sedan början av sextiotalet och dess upptäckt av Hayflick och Moorhead, återstår senescence fortfarande en cellulär nyfikenhet 1. Mänskliga celler inte på obestämd tid föröka sig och genom åldrande, Hayflick och Moorhead myntade cellulära åldrandet. Åldrande är ett stabilt cellcykelstopp vid vilka celler förblir metaboliskt aktiva i motsats till celldöd. Hittills har fyra cellulära mekanismer visats inducera åldrande: telomerförkortning, DNA-skador, kromatin störning, och onormalt uttryck av mitogena onkogener 2. Detta tyder inte bara på normala celler men också cancerceller kan genomgå åldrande 3. I själva verket var cancerceller genomgår senescence visat sig utgöra ett hinder för att ytterligare tumörprogression 4-5. Dock har flera rapporter pekat nu att, under vissa omständigheter, kan cellulärt åldrande också främja malignitet 6-7. Studera åldrande av cancer CELls är på väg att bli en längtan inom cancerforskning som för närvarande används cellgifter kan leda till åldrande av cancerceller inte bara in vitro utan också in vivo 8.
Det stora analys för att undersöka med avseende på närvaro av åldrande celler är β-galaktosidas-analysen vid surt pH. Denna histokemisk analys avspeglar ökade i lysosomala biogenesis förekommer i de flesta åldrande celler. Kortfattat är exogen X-gal, som tillämpas på celler, spjälkas av β-galaktosidas anrikas i lysosomer åldrande celler, vilket ger upphov till en blå färg 9. De blå åldrande celler kan därefter kvantifieras under en ljus fält mikroskop. Även om mycket populär presenterar β-galaktosidasanalysen stora nackdelar. Det första är denna analys utförs på fixerade celler. Det andra, det är tidskrävande eftersom det innebär att kvantifiera graden av åldrande genom att räkna ett signifikant högt antal åldrande celler i mikroskop. Tredje, denna analysär inte känslig som diskriminering mellan åldrande och icke-åldrande celler helt förlitar sig på betraktaren.
Vi diskuterar här en outnyttjad, snabb och känslig flödescytometri-baserad analys för att bedöma om de innehåller levande åldrande celler. Denna analys är baserad på hydrolys av ett membran permeabelt molekyl, den 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galaktopyranosid (C 12 FDG), genom β-galaktosidas anrikas i åldrande celler. Efter hydrolys och laserexcitation avger C 12 FDG grön fluorescens och kan därför detekteras genom flödescytometri 10, 11. Detekteringen av åldrande celler via flödescytometri erbjuder den stora fördelen av att vara snabb och känslig. Dessutom kan detektering av åldrande celler genom flödescytometri kopplas med upptäckten av andra cellulära markörer. Denna analys kan användas för att detektera åldrande celler i en population av cancerceller behandlade med kemoterapi och kan rutinmässigt ställaupp på vävnadssnitt, efter cellulär dissociation, i klinik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Framställning av C12FDG, bafilomycin A1, och Cell Culture
- Lös upp C 12 FDG pulver i dimetylsulfoxid (DMSO) till en slutlig koncentration av 20 mM. Fördela och förvara vid -20 ° C. DMSO bör användas med lämpliga säkerhetsanordningar villkor.
- Lös upp bafilomycin A1 pulver i DMSO till en slutlig koncentration av 0,1 mM. Fördela och förvara vid - 20 ° C. Bafilomycin bör användas med lämpliga säkerhetsanordningar villkor.
- Cultivate RPMI 8226-cellinjen, eller andra cellinjer vidhäftande eller inte, i medier innehållande 10% fetalt bovint serum och 1% antibiotika, vid 37 ° C, 5% CO2. Uppskatta antalet celler som behövs för experimentet. För att spela in ett tillräckligt antal händelser under flödescytometrianalys, är 5 x 10 5 celler krävs. För att bestämma procenttalet för åldrande celler, är tre cellprover krävs: omärkt prov, obehandlade celler färgade med C 12 FDG, behandlade celler färgade medC 12 FDG.
- Seed cellerna 24 hr utför innan experimentet så att cellerna är i log-fasen av cellulär proliferation kurvan.
2. Induktion av Åldrande
- Inducera åldrande av cancerceller genom att lägga till en kemoterapeutisk drog. Drug koncentration och behandlingstiden bör anpassas till cellen testade typen. Börja med en 48 h behandling vid slutkoncentration av 50 nM doxorubicin för en koncentration av celler vid ca 10 6 celler / ml. Glöm inte att inkludera obehandlat prov (negativ kontroll).
Tre. Bafilomycin A1 Behandling
- Kontrollera cellviabiliteten genom att blanda celler med trypanblått (volym / volym), som den kemoterapeutisk drog som användes i föregående steg kan leda till cell apoptos. Fyll i en Malassez kammare och räkna antalet blå celler (döda celler) och vita blodkroppar (levande celler). Om andelen lönsamheten är lägre än 70%, kan döda celler vara removed användning av ett lämpligt kit för att se till att döda celler inte kommer att förspänna den efterföljande analysen.
- Ta bort odlingsmedier och ersätta med förvärmda färskt odlingsmedium. Behandla cellerna med en slutlig koncentration av 100 nM bafilomycin A1. Bafilomycin A1 används för att neutralisera det sura pH lysosomer. Inkubera 1 timme vid 37 ° C, 5% CO2.
4. C 12 FDG färgning
- Lös C 12 FDG i förvärmda färskt odlingsmedium till en slutlig koncentration av 2 mM.
- Tillsätt föreningen till celler vid en slutlig koncentration av 33 | iM och inkubera 2 h vid 37 ° C, 5% CO2. Vid användning av icke vidhäftande celler, centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C (hastigheten kan behöva justeras för att den cell som används typ), tvätta 2x med PBS. Resuspendera cellpelleten i 500 | il kall PBS. Om du använder vidhäftande celler, ta bort materialet och tvätta 2x med PBS. Skörda de vidhäftande cellerna med användning av en trypsinlösning och centrifugeraceller vid 300 xg under 5 min vid 4 ° C (hastigheten kan behöva justeras för att den cell som används typ). Resuspendera cellpelleten i 500 | il kall PBS. I båda fallen bör cellkoncentrationen vara ca 10 6 celler / ml.
- Utför en co-immunomärkning att ytterligare karakterisera populationen av åldrande celler.
Fem. Flödescytometrianalys
- Kalibrera flödescytometer genom de styr pärlor som rekommenderas av tillverkaren av flödescytometern. För alla steg, minst 10 4 händelser skall registreras.
- Kör det första provet innehållande omärkta celler. Förbered en två-parameter grafisk visning Forward Scatter Channel (FSC) kontra Side Scatter Channel (SSC). Ställ fotomultiplikatorrören (PMT) och definiera ett område av intresse exklusive döda celler och cellulära skräp som kan ha dykt upp under beredningen av proverna. Gate denna region av intresse i en en-parameter histogram visar FL1 på loggskalanav x-axeln och antalet händelser i y-axeln. Det totala antalet händelser representerar antalet analyserade celler. Ställ in PMT så att omärkta celler visas i det första årtiondet på log-skala för x-axeln. Bestäm autofluorescensen av cellerna vid behov.
- Kör det andra provet innehållande obehandlade celler. Å ena-parameter histogram visar FL1 (fluorescens av C 12 FDG), placera markören efter det dunkelt märkta populationen. Denna gräns kommer att tillåta diskriminering mellan icke-åldrande celler (svagt märkta celler) och åldrande celler (ljust märkta celler).
- Kör det tredje provet innehållande behandlade celler. Ljust märkta celler, dvs åldrande celler visas ovanför tröskelvärdet bestäms i det föregående steget. Utvärdera andelen åldrande celler genom att dividera antalet av ljusa händelser per det totala antalet händelser. Om det behövs, kan aktiviteten av β-galaktosidas också uppskattas genom användning av medelvärdet fluorescensintensitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Multipelt myelom, en hematologisk malignitet, användes för att utvärdera senescens framkallas av en kemoterapeutisk procedur. Att göra en kommersiellt tillgänglig MM cellinje (RPMI 8226) behandlades under 2 dagar med doxorubicin, en kemoterapeutisk drog. Cellerna utsattes sedan för bafilomycin A1 behandling och inkuberades ytterligare med C 12 FDG. Celler analyserades genom flödescytometri. Figur 1 illustrerar de olika stegen och visar att den procentandel av åldrande celler kan bestämmas inom en dag med användning av C12-FDG. Omärkta celler kördes först i flödescytometern. Såsom visas i figur 2A, har en region av intresse som på den grafiska FSC kontra SSC för att utesluta döda celler och cellulärt skräp. Celler i denna region av intresse var då gated på histogrammet visar fluorescensen hos C 12 FDG (FL1) på x-axeln och antalet händelser på y-axeln. De obehandlade celler analyserades. ETTröda markören sattes efter svagt märkta populationen som avbildas Figur 2B: icke åldrande celler visas i regionen U, medan åldrande celler kommer att vara närvarande i region V. De behandlade cellerna därefter köras i flödescytometern. En population av ljust märkta celler visades ovanför den röda markören tidigare fastställda, i regionen V, såsom visas Figur 2C (till vänster). Denna population motsvarar åldrande celler och deras andel kan därefter beräknas. Parallellt utfördes samma cellprov färgades med användning av β-galaktosidas-analysen såsom visas (höger panel). I detta representativ bild, är helt blå celler och delvis blå celler visat att illustrera svårigheten att diskriminera riktigt blå åldrande celler.
För att illustrera de särskilda egenskaperna hos C 12 FDG vid bestämningen av den procentuella andelen av åldrande celler, behandlades cellerna med olika koncentrationer av doxorubicin. Andelenåldrande celler bestämdes såsom i figur 2B. Andelen av ljusa celler ökar som en funktion av den använda doxorubicin koncentration såsom visas i figur 3. Detta visar att C 12 FDG märkningen är specifik för åldrande celler.
Figur 1. Övergripande syftet med försöket. Celler såddes 1 24 h före behandling med kemoterapeutisk drog 2. På dagen för experimentet, inkuberades celler med bafilomycin A1 3 och därefter med C12FDG 4. Cellerna analyserades därefter på flödescytometern 5.
Figur 2. Flödescytometrianalys. (A) ett område av intresse was bestäms på tomten FSC kontra SSC att utesluta döda celler och cellulära skräp. (B) De obehandlade celler kördes i flödescytometern och den röda markören fastställdes. (C) De behandlade cellerna kördes i flödescytometern. De åldrande celler visades ovanför den röda markören. U och V representerar regioner av intresse, det vill säga icke åldrade och åldrande celler, resp. (D) Parallellt, (samma prov, samma behandling) färgades cellerna med hjälp av β-galaktosidas-analysen. Notera de olika grad av färgning av cellerna (helt blå celler, delvis blå celler), vilket illustrerar svårigheten att fastställa ett tröskelvärde tillåter diskriminering av åldrande celler. Forward Scatter Channel (FSC), Side Scatter Channel (SSC), fluorescens 1 (FL1).
Figur 3. Specificitet av C 12FDG märkning. Cellerna behandlades med 5 (mörkgrå histogram), 25 (ljusgrå histogram) och 50 nM (vit histogram) av doxorubicin. U representerar den region som innehåller icke-åldrande celler. Den procentuella andelen åldrande celler utvärderas genom att dividera antalet ljusa händelser per det totala antalet händelser. Procentandelen åldrande celler är 0,8%, 15,78%, 26,31% för en dos av 5, 25, och 50 nM doxorubicin, respektive.
| C12FDG assay | β-galaktosidas-analysen | |
| Känslighet | + | - |
| Kostnad | = | = |
| Genomströmning | + | - |
| Assay varaktighet | - | + |
| Tillämplighet på celltyp | = | = |
| Celler | Levande cell | Fast cell |
| Krav för specialutrustning | Flödescytometer | Bright fält mikroskop |
Tabell 1. . Fördelar och nackdelar med C 12 FDG cytometri baserad analys och β-galaktosidas-analysen (+) motsvarar högre grad medan (-) och (=) motsvarar mindre och likvärdiga examina, respektive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi presenteras här en flödescytometri-baserad metod för att kvantifiera cellulärt åldrande med levande cancerceller. Denna metod är baserad på användningen av membranet permeabel förening, C 12 FDG, och kan därför användas i alla celltyper och efter olika behandlingar så länge som föreningen tas upp av cellerna. Vid cellulärt upptag är C 12 FDG hydrolyseras av β-galaktosidas, anrikas i lysosomer åldrande celler. Efter laser excitation avger föreningen gröna fluorescensen, vilket möjliggör kvantifiering av åldrande celler. Denna kvantifiering av grön fluorescens kan antingen göras genom flödescytometri eller genom fluorescensmikroskopi. Men i detta fall kommer fluorescerande celler måste räknas av observatören, vilket kräver tid. Eftersom C 12 FDG hydrolyseras av β-galaktosidas, tillåter denna metod, förutom att kvantifieringen av åldrande celler, för att kvantifiera aktiviteten av β-galaktosidasoch lokalisering av enzymet, främst finns i lysosomala vesikler. Trots att metoden är enkel, bör uppmärksamhet riktas på steg 3. Den framgångsrika upptäckt av åldrande celler bygger mestadels på rätt pH i lysosomer. För att göra detta, använde vi bafilomycin A1 att neutralisera det sura pH lysosomer. Beroende på den cell som används typ, kan det här steget inte krävas. Om åldrande förväntas och ingen missfärgning upptäcks, föreslår vi att inkludera en negativ kontroll för bafilomycin A1 (ingen bafilomycin) och att öka koncentrationen av bafilomycin A1. Om detta, se till att denna ökning inte inducerar celldöd. Alternativt kan bafilomycin A1 vara substituerad med klorokin eller varje annan förening som är i stånd att öka pH av lysosomer.
Använda den beskrivna protokollet, kvantifieras vi framgångsrikt andelen åldrande celler i multipelt myelom celler efter doxorubicin behandling inom ett dygn. Detta protokoll kan användas i OTHER cancer celltyper, men även i icke-cancer celltyper. Den populära och överutnyttjas β-galaktosidas-analys, för vilken den cellulära pH-värdet måste också kontrolleras, krävs minst två dagar. I själva verket den maximala blå färg, som erhållits efter klyvning av X-gal av β-galaktosidas, uppnås efter 12 - 16 h av inkubation 9. Denna analys är därför mer tidskrävande än den föreslagna cytometri baserad analys. Dessutom är denna analys inte känslig eftersom en blåaktig cell kan räknas som senescentcell samtidigt som inte riktigt åldrande. I tabell 1 recapitulates fördelar och nackdelar med de två teknikerna.
Den andra fördelen med denna metod är att den kan kopplas med immunfärgning av makers på cellytan. I fallet med multipelt myelom, har detta gett oss möjlighet att visa att multipelt myelom cancer stamceller inte senesce efter doxorubicin behandling, medan icke-cancer stamceller do 12. Åldrande har visat sig vara pro-och anti-carcinogen. Eftersom chemotherapeutical droger kan framkalla åldrande, kanske studera åldrande bli viktig i klinik. I detta syfte, snabba och känsliga analyser måste användas, såsom analysen vi beskrivit här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi tackar SF 4206 iCore (Université de Caen) för användningen av cytometry anläggningen. JC fick postdoktorala stipendier från Conseil de strålskydd d'EDF och Conseil Régional av Basse-Normandie. Dessa uppgifter var en del av projekt som finansieras av Ligue Nationale contre le Cancer - Comités de l'Orne et du Calvados.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside | Invitrogen | D-2893 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| Bafilomycin A1 | Sigma | B1793 | |
| Doxorubicin | Sandoz | ||
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| RPMI 1640 cell culture medium | Lonza | BE12-702 | |
| Fetal calf serum | PAA Laboratories GmBH | A15 101 | |
| Antibiotics | Gibco | 5290-018 | |
| Gallios flow cytometer | Beckman Coulter | A94291 |
References
- Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
- Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
- Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
- Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
- Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
- Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
- Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
- Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
- Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
- Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
- Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446 (2012).
