Мы разработали количественный ДНК-связывающий, ИФА на основе анализа для измерения фактора транскрипции взаимодействия с ДНК. Высокая специфичность для белка Runx2 была достигнута с консенсусной олигонуклеотида ДНК-распознавания и специфического моноклонального антитела. Колориметрические обнаружения с реакции с субстратом антитела с ферментом в сочетании контролировали в реальном времени.
Многие ДНК-связывающие анализы, такие как электрофоретическая сдвига мобильность анализов (EMSA), хемилюминесцентных анализов, иммунопреципитации хроматина (чип) основе анализов и многолуночных основе анализов используются для измерения активность фактора транскрипции. Тем не менее, эти анализы неколичественные, отсутствие специфичности, может включать в себя использование меченных олигонуклеотидов, и не могут быть адаптированы для скрининга ингибиторов связывания ДНК. С другой стороны, с помощью количественного ДНК-связывающий иммуноферментного анализа (D-ELISA) анализа, мы демонстрируем ядерных белковых взаимодействий с ДНК, используя Runx2 транскрипционный фактор, что зависит от конкретной ассоциации с консенсус-ДНК-связывающих последовательностей, присутствующих на биотин- меченных олигонуклеотидов. Подготовка клеток, добыча ядерного белка, и дизайн двухцепочечных олигонуклеотидов описаны. Покрытые авидином 96-луночные планшеты с фиксированной щелочного буфера и инкубируют с ядерными белками в нуклеотидной блокирующем буфере. Фоллявследствие интенсивного промывания пластин, конкретной первичного антитела и вторичного антитела инкубации следуют добавлением субстрата пероксидазы хрена и развития колориметрической реакции. Режим реакция Стоп или непрерывный кинетическая мониторинга были использованы для количественного измерения взаимодействия белка с ДНК. Мы обсуждаем соответствующие элементы управления специфичности, в том числе лечения неспецифического IgG или без белка или первичного антитела. Применение анализа описаны в том числе его полезности в скрининге лекарственных и представительные положительные и отрицательные результаты обсуждаются.
ДНК-связывающий анализы могут быть использованы при измерения способности факторов транскрипции, чтобы взаимодействовать с ДНК. Анализы на ДНК связывающие включают анализы электрофоретических сдвига подвижности (EMSA), которые зависят от меченных олигонуклеотидов 1 или хемилюминесценции анализов 2. Хроматина immuneprecipitation (чип) на основе анализов 3, а также анализы, использующие форматы 96-луночных 4 также были описаны. Тем не менее, EMSA не является количественный анализ, что требует использования радиоактивно меченных олигонуклеотидов. Когда ядерные белки ассоциируют с конкретными последовательностей нуклеотидов промоутер, связывающие комплексы отсталых на полиакриламидном геле и специфическим фактором транскрипции может быть подтверждено с антителом "supershift". Мы разработали количественный ДНК-анализа связывания с использованием твердофазного иммуноферментного формат (D-ELISA), который способен измерять взаимодействие RUNX2 с ДНК-связывающих последовательностей, соответствующих определенных промоторных элементов ян Runx2 генов-мишеней. Использование анти-антителом Runx2 обеспечивает специфичность анализа и отсутствие радиоактивной метки отличить этот анализ от традиционного анализа гель сдвига 5. Обнаружение связывания комплексов можно с использованием вторичного антитела, соединенного с пероксидазой хрена (HRP), который преобразует в HRP субстрат, тетраметилбензидин (ТМВ) в окрашенный продукт для спектрофотометрического анализа. Анализ сообщалось здесь, могут включать использование мутантных ДНК-олигонуклеотидов в качестве контроля и может быть использован для обнаружения конкурентных или неконкурентные ингибиторы ДНК-связывающий. Скрининг новых соединений противоопухолевых также возможно с этим анализом.
ДНК-связывающий анализы используются для измерения способности факторов транскрипции, чтобы взаимодействовать с ДНК. Анализы на ДНК связывающие включают электрофоретическую сдвиг мобильности (EMSA) 1 и хроматина immuneprecipitation (чип) анализы, основанные 3, а также анализов с испол…
The authors have nothing to disclose.
Техническая помощь и приборы из Университета штата Мэриленд Greenebaum онкологический центр Поступательное основной комплекс, особенно д-ра. Рена Лапидус и Мариола Садовска, которые с благодарностью. Работа отвечает за развитие этого анализа была частично финансируется NIH RO1CA108846, AHA Грант-в-помощь GRNT2130014, заслуга премии В. А. П., и в Университете штата Мэриленд сигарет реституции фондов (ХПН), предоставляемой Марлен & Stewart Greenebaum онкологический центр.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
Table 1. Reagents | |||
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
Table 2. Equipment |