Summary
我们开发了一种定量的DNA结合，基于ELISA的测定法来测量与DNA的转录因子相互作用。高特异性的RUNX2蛋白与共识的DNA寡核苷酸识别和特异性单克隆抗体来实现。比色检测用酶偶联抗体底物反应的实时监测。
Abstract
许多DNA结合测定法，如电泳迁移率变动分析（EMSA），化学发光测定法，染色质免疫沉淀（ChIP）为基础的检测，和多孔基测定法用于测量转录因子的活性。然而，这些测定是非定量，缺乏特异性，可能涉及使用放射性标记的寡核苷酸，并且可能并不适用于DNA结合的抑制剂的筛选。另一方面，用一个定量的DNA结合的酶联免疫吸附测定法（D-ELISA）测定中，我们展示了核蛋白质相互作用与DNA的使用依赖于特定的关联与存在于生物素共有DNA结合序列的RUNX2转录因子标记的寡核苷酸。细胞的制备，提取核蛋白，和双链寡核苷酸的设计进行说明。抗生物素蛋白包被的96孔板中是固定的碱性缓冲液，温育在核苷酸封闭缓冲液中的核蛋白质。傅杰仕由于板的彻底清洗，特定的一抗和二抗孵育，随后加入比色反应的辣根过氧化物酶底物和发展。停止反应模式或连续动力学监测被用来定量测量与DNA蛋白相互作用。我们讨论了相应的特异性控制，包括与非特异性IgG或无蛋白质或初级抗体治疗。该测定的申请中描述，包括其在药物筛选程序和代表正和负的结果进行了讨论。
Introduction
DNA结合分析在测量转录因子与DNA相互作用的能力效用。检测DNA结合包括电泳迁移率变动分析（EMSA）依赖于放射性标记的寡核苷酸1或化学发光检测2。染色质immuneprecipitation（芯片）为基础的分析3以及测定使用96孔格式4也被描述。然而，EMSA是一个非定量测定要求使用放射性标记的寡核苷酸。当核的蛋白质相关联的特定核苷酸序列的启动子，结合复合体是滞后于聚丙烯酰胺凝胶和特定的转录因子可与抗体“超迁移”进行验证。我们已经开发出利用酶联免疫格式（D-ELISA），它能够测量与对应于所定义的启动子元件的DNA结合序列，RUNX2的相互作用的定量DNA结合测定法我ÑRUNX2靶基因。使用防RUNX2抗体提供了特异性的检测和缺乏放射性标记的从传统的凝胶迁移实验5分辨这个实验。检测结合复合体是可能的使用结合到辣根过氧化物酶（HRP），它的HRP底物四甲基联苯胺（TMB）转化成有色产物进行分光光度分析的二次抗体。本文报道的测定可以合并使用突变的DNA的寡核苷酸作为对照，并可以用于检测的DNA的竞争性或非竞争性抑制剂结合。新颖的抗肿瘤化合物的筛选，也可以用此试验。
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Protocol
的时间被执行几个步骤前进，几个试剂制备和储存的过程之前：（1）细胞培养和蛋白质分离，（2）制备的寡核苷酸，（3）制备的96孔板，（4）核提取孵育过夜。程序要求，因为核蛋白质与DNA寡核苷酸孵育过夜2天。
1。缓冲液的制备
1.1核蛋白分离
- 低渗缓冲液：要制备100ml的低渗缓冲液中，加入1 ml（1M的HEPES，pH值7.9），150微升（1μM的MgCl 2）中，333微升（3M KCl）中，以98.3毫升H 2 O。终浓度：10毫米肝素钠，1.5毫米氯化镁2，10毫米氯化钾。对于低渗缓冲液+ NP40（在步骤2.11使用）：加入0.5毫升（10％NP40），以9.5毫升低渗缓冲液进行最后的0.5％NP40。
- 低盐缓冲液：要制备100ml低盐缓冲液（在步骤2.15使用），加入1 ml（1M的HEPES，pH值7.9），25米升甘油，加入150μl（1μM的MgCl 2）中，666微升（3M KCl）中，加入40μl（0.5M EDTA）至73毫升水2 O。终浓度：10毫米的HEPES，25％甘油，1.5毫米氯化镁2，20毫米氯化钾，0.2毫米EDTA。
- 高盐缓冲液：要制备100ml高盐缓冲液（用于在步骤2.15使用），加入1 ml（1M的HEPES，pH值7.9），将25ml甘油，加入150μl（1μM的MgCl 2）中，26.7毫升（3M KCl）中，加入40μl（0.5M EDTA）的47毫升H 2 O。终浓度：10毫米的HEPES，25％甘油，1.5毫米氯化镁2，800毫米氯化钾，0.2毫米EDTA。
- 10％NP40洗涤剂：10毫升NP40〜90毫升水2 O
- 蛋白酶和磷酸酶抑制剂[加入低渗缓冲液+ NP40（步骤2.11），以低盐缓冲液（步骤2.15），并以高盐缓冲液（步骤2.15），在使用前才]：添加2.5微升（1 M DTT）和50微升蛋白酶抑制剂（100倍）的至5ml每个缓冲区为0.5mM的DTT和1x蛋白酶抑制剂的最终浓度。蛋白酶抑制剂100X库存混合物包括：氟化钠（丝氨酸/苏氨酸，酸性磷酸酶），原钒酸钠（酪氨酸，碱性磷酸酯酶），β-磷酸甘油（丝氨酸/苏氨酸磷酸酶），焦磷酸钠（丝氨酸/苏氨酸磷酸酶），抑酶肽（丝氨酸蛋白酶），苯丁抑制素（氨基肽酶），E64（半胱氨酸蛋白酶），亮抑酶肽（丝氨酸/半胱氨酸蛋白酶），EDTA（金属蛋白酶）。
1.2制备测定板的
- 板固定的解决方案：要准备500ml溶液，加5.25克碳酸钠至500ml H 2 O，拌匀，调节pH值至9.7为0.1M的碳酸钠的终浓度。
- 板封闭液：制备聚股票的dI / DC寡核苷酸，重悬1单位（〜50毫克），聚DI / DC在1毫升10毫米的Tris /盐酸，含1毫米EDTA的股票浓度为50微克pH值7.9 /微升。股票稀释到1微克/使用微升前。
1.3洗涤缓冲液和抗体稀释液
注：链霉亲和洗涤缓冲液是用于在添加之间洗涤板并以稀释初级和次级抗体。
- 以制备1升的链霉亲和洗涤缓冲液中，添加2.4克的Tris /盐酸，37.5毫升（4M NaCl）中，将10毫升（10％BSA）中，加入5ml（10％的Tween-20），以1升Millipore公司的无菌过滤的水，pH值为7.18。贮存于4℃。终浓度：20毫摩尔Tris /盐酸，150 mM氯化钠，0.1％BSA，0.05％Tween-20的。
1.4 DNA结合缓冲液
注意：这个缓冲区存放于-20℃。
- 为了制备将15ml DNA结合缓冲液中，添加180微升（1M的HEPES，pH值7.9），300微升（3M KCl）中，12微升（0.5M EDTA，pH值8.0），7.5微升（1 M DTT），3.0毫升（60％甘油）中，加入300μl（50微克/微升聚的dI / DC）稀释用的去离子/蒸馏水H 2 O的（12毫升）中。终浓度：12mM的HEPES / pH值7.9，60mM的氯化钾，0.4mM的EDTA，0.5mM的DTT，12％甘油，1微克/微升聚的dI / DC。
2。细胞培养和核蛋白质分离
T“>注：编制，需要约3小时细胞的刺激将取决于实验中使用的每一个实验的细胞数量会有所不同，所有卷反映了一个典型的实验中使用3×10 7细胞/点调整量，以适应。在实验6中实际使用的细胞数目。- 为了准备核蛋白质的DNA结合实验，培养人细胞表达RUNX2（内皮细胞，骨肉瘤，乳腺癌细胞）在合适的介质6。
- 治疗会合细胞与噻氨酯哒唑（0.2微克/毫升16小时）逮捕细胞在G2 / M期细胞周期边界6。在这些条件下，本RUNX2蛋白是稳定的和最大的DNA结合得以实现。以这种方式，为多个测定和抑制剂可从同一制剂相比足够核蛋白是可用的。
- 对于每个步骤，预冷却离心机4℃，制备缓冲液和细胞收获前放松20分钟，在4℃下。
- 寒冷细胞（4℃）和在冰上进行的程序。
- 离心细胞以1,000 rpm离心5分钟在15毫升聚丙烯圆底试管中。
- 洗1X与冰冷的PBS（的Ca 2 +和Mg 2 +免费）。
- 再次离心，弃PBS上清液。
- 加入500μl低渗缓冲的无蛋白酶抑制剂，小心翼翼地完全重悬细胞沉淀。
- 传送内容到1.5ml的Eppendorf管中。
- 立时离心机在5,500转5.5分钟，弃去上清液，并保持细胞沉淀。
- 重悬细胞沉淀于500μl低渗缓冲液中含有0.5％NP40的。添加蛋白酶和磷酸酶抑制剂和0.5mM DTT（如在步骤1.1.5中描述）。
- 使样品休息在冰上30分钟。
- 离心机以13,000 rpm离心10分钟。
- 弃上清（含有胞质蛋白）。
- 重悬细胞核沉淀在每个低SAL的60微升吨缓冲液（向其中蛋白酶抑制剂和0.5mM DTT已经加入从步骤1.1.5）和高盐缓冲液（向其中蛋白酶抑制剂和0.5mM DTT已经加入从步骤1.1.5），总共120微升。加60微升低盐缓冲液中的沉淀物的第一和重悬，然后加入60微升的高盐缓冲液中。 VORTEX颗粒的悬浮帮助。
注：此步骤有助于摆脱一些核膜蛋白和设立裂解步骤：低盐第一（重悬沉淀，涡旋），然后高盐（涡流）优化这一步骤。保持提取物置于冰上30分钟，在第一10分钟后涡旋。
- 离心机以12,000 rpm离心15分钟;保持含有核蛋白质的上清液。
- 测量蛋白质浓度（尽量保持样品在2-5毫克/毫升），分装在合适的量（10μL/管），并储存在-80°C。
注：预计产量：30×10 6 CELLS将产生5微克/微升蛋白120微升。 5×10 6个细胞将产生2.2微克/微升的蛋白质在40微升。
3。的双链寡核苷酸的制备
- 设计互补的寡核苷酸与兼容的半位点上的两端。为RUNX2这些是：5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-生物素（有义）和5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTATŦGTGGTT AATACG-3'-生物素（反义）。
注：确定有三种RUNX2结合位点和单端标记生物素产生的最重复性的结果试点实验。
- 准备5X退火缓冲液：加入300微升（1米的Tris-HCl，pH值为7.6），30微升（1米氯化镁2），10微升（1 M DTT），以260微升H 2 O的（最终600微升）。
- 到200皮摩尔各单链OLIG的onucleotide（3微升），加入12微升的5倍退火缓冲液和45微升H 2 O的共60微升（200 pmol/60微升）。
- 热在加热块95℃下5-10分钟。
- 冷却至65℃，缓慢地（通过温度设定为65℃时，需要15分钟），然后冷却至室温缓慢地通过关闭加热块（或通过放置在50毫升的65℃的水的动力在冰的烧杯中，这需要15-20分钟）。
4。 96孔板准备
注意：不要用牛奶蛋白质的洗涤缓冲液。
- 固定板与固定溶液（0.1M碳酸钠）：加300微升/孔。
- 通过摇摆在室温（RT），或在4°C（O / N）无摇动孵育2小时。
- 与链霉亲和洗涤缓冲液（WB）洗板3次：每次加300微升/孔。
- 添加生物素标记的双链寡核苷酸（每3个核苷酸共有结合位点），2小时瓦特第i个摆动（1.25纳摩尔/孔;100μl/孔）。
- 洗涤3次用冷WB：加300微升/孔，然后立即颠倒板放入一个水槽和印迹在纸巾上的边缘每次加入后。
注意：不要使用移液器吸头从板块中删除流体，因为这可能会刮抗生物素蛋白：生物素：从井DNA复合物。这样做对所有后续的洗涤步骤。
5。孵化与核提取物
注意：请不要用鲑鱼或鲱鱼精DNA的聚DI / DC阻断缓冲区。避免阻塞板与牛奶蛋白质。这两种封闭剂的导致高背景值。
- 孵育核提取物（90微升/孔）制备特异性转录因子。制备含核提取物的母液（DNA结合蛋白; 3-9微克/孔）+聚DI / DC在1x的DNA（1微克/微升从50微克/微升股票）结合缓冲液。体积根据需要为总数所需的井（90微升/孔）。
- 任何潜在的抑制剂，如维生素D 3（ 图2）或CADD化合物5221975（ 图3），或者适当的稀释溶剂对照，如乙醇，在此步骤中加入。
- 在摇摆平台，O / N在4°C的地方板
- 洗3次与巴菲特：加入300微升/孔
6。另外一抗
注：一抗稀释液应新鲜配制 - 存储是不推荐。
- 稀RUNX2特异性单克隆抗体（股票1微克/微升）的1/5，在链霉亲和000洗缓冲区。准备足够的用于添加到96孔平板（90微升/孔）以一式三份的每个孔中。
- 孵育1小时，在室温下在摇动平台上。
- 洗3次与世行，加300微升/孔。
7。此外二级抗体
注：二级抗体稀释液可以是申通快递红色，在4℃过夜，如果需要的第二天。
- 稀F AB-特异性亲和纯化，HRP标记抗体（7.1 mg / ml的股票），以1:1,400的链霉亲和清洗缓冲液：3.5微升antibody/5.0毫升洗涤缓冲液。准备足够的用于添加到96孔平板（90微升/孔）以一式三份的每个孔中。
- 孵育在室温下在摇动平台上30分钟。
- 洗涤6次以WB由反相板放入水槽（300微升/孔）。
8。 HRP基质及产品开发
- 从股票瓶加入50微升TMB底物，每孔直接。
- 在黑暗中孵育10-20分钟，在室温（停止反应法）或直接测量吸光度（连续动力学监测）。
9。反应测量
- 停止反应的方法：对于Visual停止反应，检查从清晰的彩色变为蓝色，并停止与50微升硫酸反应。
- 测量450nm处的吸光度与该Biotrak二可见酶标仪分光光度计（Amersham Biosciences社制; GE医疗集团生物科技股份有限公司皮斯卡塔韦NJ，USA）或类似的仪器。
- 连续动力学监测方法：在最后一次洗涤后，加入底物，只是在此之前放置在分光光度计（不停止反应）。
- 测量吸光度在635 nm处的生物康协同HT多反应酶标仪分光光度计（BIO-Tek仪器，公司，威努斯基，VT，USA）或类似的仪器。
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Representative Results
对D-ELISA法是高度特异性的针对指定的DNA结合蛋白，只要使用含有共识RUNX2结合位点（ACACCA）的三个拷贝的序列特异性双链寡核苷酸。第一抗体识别的蛋白因子也提高了特异性。二次抗体包含共价连接的辣根过氧化物酶（HRP），一个透明基底（四甲基联苯胺）转换为有色产物，便于检测（ 图1）。出于这些原因，一些重要的背景控制需要被包括在每个测定板，以确保特定的DNA结合。这些包括：测量从在含有任一（1）没有核蛋白质，（2）无第一抗体，或（3）非特异性小鼠IgG而非特异性单克隆抗体孔中的第二抗体-HRP反应的比色产物。在我们的日常测量，无蛋白对照是从特定蛋白质的减去ND表示为净反应产物。此外，当计算机辅助药物设计（CADD），用于发现化合物和药物中的DNA结合测定法进行测试，所用溶剂的效果用于溶解的化合物必须在单独的井来确定。通常，药物筛选，需要使用水，乙醇或二甲亚砜中溶解的化合物。这些溶剂单独和在适当的浓度下测试。一些药物屏幕确定了没有什么效果上的DNA结合，如图所示为维生素D受体的配体，1α，25 -羟基维生素D3（ 图2）的化合物。该化合物不抑制DNA甚至在较高浓度（100nM至100μM）的结合。其他药物屏幕检测到的抑制蛋白的化合物：DNA结合（ 图3）。基于动力学测量7的分析中，增加了CADD5221975抑制剂的量导致剂量依赖性的，S形抑制曲线，瓦特第i抑制剂浓度高于10 -3 M有效地抑制DNA结合，而低于10 -11 M的浓度表现出非常小的抑制作用。欧盟委员会50（浓度在哪个抑制剂引起RUNX2与DNA的结合减少了50％）为10纳米的这种化合物。用于该测定的统计分析先前已经6发表，而为简化起见，只有一个孔的一式三份一组井的示于代表图2和图3。
图1。流程图在D-ELISA协议。 （一）从哺乳动物细胞中分离细胞核蛋白。生长的细胞被裂解洗涤剂和高盐的方法来提取紧紧地与DNA相关的蛋白质分级分离（B）准备ðOUBLE链寡核苷酸。一式三份的RUNX2结合位点ACACCAA与在3'-末端生物素标记准备。（C）准备96孔板。板与抗生物素蛋白涂层获得，但添加生物素标记的寡核苷酸之前，必须固定具有高pH值（D）孵育的核提取物与DNA。板之前，除了核提取蛋白质的阻断非特异性poly-dI/dC（E）添加第一抗体。抗体的制备孵化前用盘子新鲜。（F）加入第二抗体。第二抗体之后是充分洗涤（G）添加HRP底物和开发产品。色度产品是可见上盘。（H）测量的分光光度计产品的吸收。吸光度要么是450纳米（反应停）或635纳米（连续监测）。（一）典型的连续读数在635 nm处。显示的是具体的反应和巴ckground（无蛋白质）一式三份控制。
图2。 1α，25 -羟基维生素D3有对RUNX2 DNA的影响不大结合，在这种有代表性的例子中，生物活性维生素D3，1α，25 -羟基维生素D3，有对RUNX2 DNA结合的影响不大。其他维生素D3的化合物，但是，对DNA结合6戏剧性的效果。
图3。抑制DNA由推定RUNX2结合：DNA活性药物在这种有代表性的例子，从一个计算机辅助药物设计（CADD）的屏幕，鉴定该化合物表现出RUNX2 DNA的剂量依赖性抑制结合从1纳米到100微米。利用建立的方法结合抑制计算7并且得到的EC 50（抑制的浓度，导致DNA的50％抑制结合）的10纳米。
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Discussion
DNA结合测定法来测量的转录因子与DNA的相互作用的能力。检测DNA结合包括电泳迁移率（EMSA）1和染色质immuneprecipitation（芯片）为基础的分析3以及检测采用96孔格式4，如化学发光检测2。该EMSA是非定量和使用放射性标记（32 P）的寡核苷酸。这些孵育核蛋白质和结合复合体上分离的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶。与此相反，定量的D-ELISA是能够测量对应于在RUNX2靶基因中定义的启动子元件的DNA结合序列，RUNX2的相互作用。使用抗RUNX2抗体的增加检测的特异性和区分该测定中由传统的凝胶移位分析5。而D-ELISA是在体外测定的，不能探测子占用活细胞中，这是可能的ChIP实验，它可以用来定量地筛选抑制DNA结合复合物的化合物。这些分析仅限于DNA相互作用的分析和无法预测的特定启动子是否被激活或抑制。进一步的方法，如启动子 - 荧光素酶报告测定中，是必要的，以定义特定的转录因子的转录活性。
这里所描述的D-ELISA法的一般协议改编自用于测定活性Nfkappa-B 8的前一方法。这个D-ELISA方案提供了用于定量测定蛋白质的方法：DNA结合是序列特异性的，并且不涉及使用放射性。如果需要的话，反应速度（V 最大 ），也可以从连续动力学监测反应的计算，这可提供测试化合物7的额外鉴别。
RUNX2和它的辅助因子发现CBF SS将与生物素标记的寡核苷酸6相关联，从而验证了该测定的特异性和还强调这是可能的，以确定可能与特定的DNA结合的转录因子相关联的辅助因子。与连续动力学监测，孵育可扩展和更少的核蛋白质，可能需要检测DNA的变化的结合。因此，动力学监测预计比停止反应的方法更敏感。这种动力学方法的一个重要应用包括筛选药物，抑制或激活的转录因子的DNA结合6。
可能出现在该测定的执行，其他可能的问题包括高背景值的存在。高背景值可能是由于：（1）高的第二抗体的浓度，（2）不充分阻挡，（3）使用的鲑鱼精子DNA作为阻断剂，（4）由于没有阻挡蛋白或步骤（5）的初级或次级抗体与特异性低。如果这些都遇到一些补救措施是可能的，包括：（1）（3）使用的dI优化次级抗体的浓度在试验性研究，并使用每孔的抗体量较低，（2）阻断板与碱性碳酸钠溶液/ DC作为非特异性的DNA，而不是鲑鱼精子，其中可能包含启动子与转录结合位元素，或（4）使用不同的对来自不同源的初级或次级抗体。
另一方面，低信号强度可以通过（1）低量的靶蛋白，（2），原发性或继发性的抗体的浓度不是最佳的，（3）激发和/或发射波长不是最佳的，并且（所引起4）抗体对它们的底物亲和性差。几种补救这些问题包括：（1）由于故障排除的一部分，可以使用30μL低盐缓冲液+ 30μL高盐缓冲液，如果较少的细胞都无济于事，能和核转录因子存在于高量。或者人们可以使用90微升低盐缓冲液+90微升低盐缓冲液，如果多个小区是可用的。更多的细胞是有用的，当特定的因子被测试的表达是低的。 （2）优化初级抗体的浓度增加的信号。 （3）监控仪器上的过滤器，以确保它们是正确的激发和发射最大值为TMB底物设置;替代荧光或化学发光底物也可使用。 （4）如果第一抗体是低亲和力的，增加孵育时间上的板。
在药物发现方面，当前RUNX2 DNA结合ELISA法已被用于检测增强的蛋白结合到它的靶DNA和鉴定天然化合物（例如维生素D3），其是DNA的选择性调节剂的结合。一些这些化合物表现出动作的非竞争性机制和改变生物功能具有一致界面抑制范式9。随着基因组DNA测序的最新决议，进一步的应用可能包括发现新的蛋白质与非编码（“垃圾”）的DNA，其中规定编码区10的表达相互作用。
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Disclosures
我们什么都没有透露。
Acknowledgments
技术援助和马里兰大学Greenebaum癌症中心转化核心设施，尤其是博士的仪器。瑞纳拉皮迪和MARIOLA Sadowska，表示诚挚的谢意。负责该实验的发展工作是由美国国立卫生研究院RO1CA108846，AHA格兰特在急救GRNT2130014，一个VA优异奖美联社报道，由马里兰州卷烟归还资金提供给马琳和斯图尔特大学（CRF）的部分资助Greenebaum癌症中心。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
| RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
| Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
| TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
| Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
| Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
| Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
| HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
| Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
| Table 1. Reagents | |||
| Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
| Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
| Table 2. Equipment | |||
References
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