قمنا بتطوير الحمض النووي ملزم، فحص ELISA الكمية استنادا لقياس التفاعلات عامل النسخ مع الحمض النووي. وقد تحقق خصوصية عالية للبروتين RUNX2 مع إجماع قليل النوكليوتيد الحمض النووي الاعتراف والأضداد وحيدة النسيلة محددة. تم رصد الكشف اللونية مع رد فعل الأجسام المضادة الركيزة جانب انزيم في الوقت الحقيقي.
وتستخدم العديد من فحوصات الحمض النووي ملزم مثل فحوصات الكهربي التحول التنقل (EMSA)، المقايسات chemiluminescent، مناعي لونين (رقاقة) القائم على المقايسات، ومقرها المقايسات multiwell لقياس النشاط عامل النسخ. ومع ذلك، فإن هذه المقايسات هي nonquantitative، تفتقر إلى الدقة، قد تنطوي على استخدام أليغنوكليوتيد رديولبلد، وربما لا تكون قابلة للتكيف لفحص مثبطات الحمض النووي ملزمة. من ناحية أخرى، وذلك باستخدام الحمض النووي ملزم انزيم مرتبط المناعي فحص الكمية (D-ELISA) الفحص، ونحن لشرح التفاعلات البروتين النووي مع الحمض النووي باستخدام عامل النسخ RUNX2 التي تعتمد على الجمعيات محددة مع الإجماع تسلسل الحمض النووي ملزم موجودة على البيوتين- [أليغنوكليوتيد المسمى. إعداد الخلايا، وصفت استخراج البروتين النووي، وتصميم أليغنوكليوتيد] الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة. يتم إصلاحها لوحات 96 جيدا المغلفة أفيدين مع العازلة القلوية وحضنت مع البروتينات النووية في النوكليوتيدات عرقلة العازلة. الفلبسبب الغسيل واسعة من لوحات، والأجسام المضادة الأولية محددة وحضانات الضد الثانوية تليها إضافة الركيزة البيروكسيداز الفجل وتطوير رد الفعل اللونية. واستخدمت طريقة تفاعل توقف أو الرصد المستمر لقياس الحركية كميا البروتين التفاعل مع الحمض النووي. نناقش ضوابط خصوصية المناسبة، بما في ذلك العلاج مع مفتش غير محددة أو بدون البروتين أو الأجسام المضادة الأولية. موصوفة التطبيقات للمقايسة بما في ذلك فائدته في فحص المخدرات وتناقش النتائج الإيجابية والسلبية ممثل.
فحوصات الحمض النووي ملزم لها فائدة في قياس قدرة عوامل النسخ للتفاعل مع الحمض النووي. وتشمل فحوصات الحمض النووي لربط الكهربي المقايسات التحول التنقل (EMSA) التي تعتمد على أليغنوكليوتيد رديولبلد 1 أو 2 المقايسات معان كيميائي. كما تم وصفها المقايسات لونين immuneprecipitation (رقاقة) استنادا 3 وكذلك فحوصات توظيف الأشكال 96 جيدا 4. ومع ذلك، فإن EMSA هو فحص غير الكمية التي يتطلب استخدام أليغنوكليوتيد رديولبلد. عندما ربط البروتينات النووية مع تسلسل النوكليوتيدات محددة المروج والمجمعات الملزمة هي المتخلفين على المواد الهلامية بولكرلميد ويمكن التحقق من صحة عامل النسخ محددة مع الأجسام المضادة "supershift". قمنا بتطوير فحص الحمض النووي ملزم الكمي باستخدام شكل انزيم مرتبط المناعي (D-ELISA)، والتي هي قادرة على قياس تفاعل RUNX2 مع تسلسل الحمض النووي ملزم المقابلة لعناصر المروج تعريف طالجينات المستهدفة ن RUNX2. استخدام الأضداد المضادة للRUNX2 يوفر خصوصية للفحص وعدم التمييز radiolabel هذا الاختبار من تحول جل مقايسة التقليدية 5. الكشف عن المجمعات ملزم هو ممكن مع استخدام الأجسام المضادة الثانوية إلى جانب أن الفجل البيروكسيداز (HRP)، والذي يحول الركيزة HRP، ميثيل البنزيدين (تمب) إلى منتج للتحليل الطيفي اللون. مقايسة ذكرت هنا يمكن دمج استخدام أليغنوكليوتيد] الحمض النووي تحور والضوابط، ويمكن استخدامها للكشف عن مثبطات تنافسية أو غير تنافسية من الحمض النووي ملزمة. فحص المركبات المضادة للورم الرواية من الممكن أيضا مع هذا الاختبار.
وتستخدم فحوصات الحمض النووي ملزم لقياس قدرة عوامل النسخ للتفاعل مع الحمض النووي. وتشمل فحوصات الحمض النووي ملزمة للتحول الكهربي التنقل (EMSA) 1 وimmuneprecipitation لونين (رقاقة) المقايسات مقرها 3 وكذلك فحوصات توظيف الأشكال 96-4 بشكل جيد مثل فحوصات chemiluminescent 2.</…
The authors have nothing to disclose.
المساعدة التقنية والأجهزة لمرفق مركز Greenebaum السرطان بالحركة الأساسية جامعة ميريلاند، وخصوصا الدكاترة. رينا لابيدوس ومارايولا Sadowska، واعترف بامتنان. وقد تم تمويل هذا العمل المسؤول عن تطوير هذا الاختبار في جزء من المعاهد الوطنية للصحة RO1CA108846، AHA المنح التي تقدم للمساعدة GRNT2130014، جائزة الاستحقاق VA لAP، وجامعة ماريلاند السجائر صناديق الاسترداد (CRF) التي قدمت إلى ومارلين ستيوارت مركز السرطان Greenebaum.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
Table 1. Reagents | |||
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
Table 2. Equipment |