Bu DNA ile transkripsiyon faktörü etkileşimi ölçmek için nicel bir DNA-bağlayıcı ELISA bazlı bir deney geliştirilmiştir. Runx2 protein için yüksek spesifikliği, bir konsensüs DNA tanıma oligonükleotid ve özel bir monoklonal antikor ile elde edilmiştir. Bir enzim-bağlı antikor alt tabaka reaksiyonu ile kolorimetrik tespit gerçek zamanlı olarak izlenmiştir.
Örneğin elektroforetik hareketlilik kayma deneyleri (EMSA), kemilüminesan deneyleri, kromatin immünopresipitasyon (çip) dayalı tahliller ve çukurlu bazlı tahliller gibi birçok DNA-bağlama deneyleri, transkripsiyon faktörü aktivitesinin ölçülmesi için kullanılır. Bununla birlikte, bu deneyler, nonquantitative olan özgüllük eksikliği, radyo-etiketli oligonükleotit kullanılmasını içerebilir ve bağlayıcı bir DNA inhibitörlerinin taranması için adapte olmayabilir. Öte yandan, bir sayısal DNA bağlayıcı enzim bağlı immünosorbent deneyi (ELISA D-) analizi kullanarak, biyotin-üzerinde mevcut olan konsensüs DNA-bağlayıcı dizileri ile özel bir birlikte bağlıdır Runx2 transkripsiyon faktörü kullanılarak DNA ile nükleer protein etkileşimlerini göstermek etiketli oligonükleotidler. Hücrelerin hazırlanması, nükleer protein ve çift sicimli oligonükleotidlerin tasarım çıkarma açıklanmıştır. Avidin kaplı 96 oyuklu plakalar, alkalin tampon maddesi ile tespit edilmiş ve nükleotid bloke edici tamponu içinde nükleer protein ile inkübe edilir. FollPlakaların geniş yıkama, spesifik birincil antikor ve ikincil antikor inkübasyonlar bağlı kolorimetrik reaksiyonun yaban turpu peroksidaz substrat ve gelişme eklenmesi ile takip edilmektedir. Reaksiyon durdurma modu veya sürekli kinetik izleme kantitatif protein DNA ile etkileşimi ölçmek için kullanıldı. Bu non-spesifik IgG ile ya da protein ya da primer antikor olmadan tedavisi dahil olmak üzere, uygun özgüllük kontroller, tartışır. Analizin Uygulamaları onun uyuşturucu taraması programı ve temsilci olumlu ve olumsuz sonuçlar tartışılmıştır dahil açıklanmıştır.
DNA-bağlama deneyleri, DNA ile etkileşime transkripsiyon faktörlerinin yeteneğini ölçmek kullanılabilmektedir. DNA bağlanması için tahliller, radyo-etiketli oligonükleotidler 1 ya da kemiluminesan tahliller 2 bağlıdır elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) içerir. 96 oyuklu biçimleri kullanılarak 4 Kromatin immuneprecipitation (çip) dayalı tahliller 3 hem de deneyler de tarif edilmiştir. Bununla birlikte, radyo-etiketli EMSA oligonükleotitlerin kullanımını gerektirir olmayan bir kantitatif deneyidir. Nükleer proteinler, spesifik nükleotid promotör sekansları ile ortak olduğunda, bağlanma kompleksleri poliakrilamid jelleri üzerinde geciktirilir ve spesifik transkripsiyon faktörü, bir antikor "süperkayma" ile doğrulanabilir. Bu tanımlanan promotör elemanlara tekabül eden DNA-bağlayıcı dizileri ile Runx2 etkileşimini ölçmek mümkün olan bir enzim-bağlı immünosorbent biçimi (D-ELISA) kullanılarak kantitatif bir DNA-bağlama deneyi geliştirdik in Runx2 hedef genler. Bir anti-Runx2 antikorun kullanımı tahlile özgüllük sağlar ve radyo-etiketin yokluğu geleneksel jel kayma deneyi 5 Bu tahlil ayırt eder. Bağlayıcı komplekslerinin tespiti spektrofotometrik analiz için bir renkli ürüne bir HRP alt-tabaka, tetrametil benzimidin (TMB) dönüştürür turp peroksidaz (HRP) bağlı ikinci bir antikorun kullanılması ile mümkündür. Burada bildirilen deney, kontroller olarak mutasyona uğramış DNA oligonükleotitlerin kullanımı dahil olabilir ve bağlayıcı DNA rekabetçi veya rekabetçi olmayan inhibitörleri tespiti için de kullanılabilir. Yeni anti-tümör bileşiklerinin bu deneyde tarama ile de mümkündür.
DNA-bağlama deneyleri, DNA ile etkileşime transkripsiyon faktörlerinin yeteneğini ölçmek için kullanılır. DNA bağlanması için tahliller, elektroforetik mobilite kaydırma (EMSA) 1 ve kromatin immuneprecipitation (çip) dayalı tahliller, 3 ve 96 oyuklu formatları bu chemiluminescent 2 ile 4 kullanan tahliller bulunmaktadır. EMSA olmayan nicel ve radyo-etiketli (32 P) oligonükleotitler kullanılır. Bu, nükleer protein ile inkübe edilir ve bağlayıcı kompleks…
The authors have nothing to disclose.
Teknik yardım ve University of Maryland Greenebaum Kanser Merkezi Translational Core Tesisleri'nde, özellikle Dr enstrümantasyon. Rena Lapidus ve Mariola SADOWSKA, müteĢekkiriz. Bu testin geliştirilmesi için sorumlu çalışma NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, AP bir VA Merit Ödülü, tarafından ve Maryland Sigara İade Fonlarının Üniversitesi (CRF) Marlene & Stewart sağlanan tarafından kısmen finanse edildi Greenebaum Kanser Merkezi.
Name of the Reagent | Company | Catalogue Number | Comments (optional) |
Poly dI/dC | GE Healthcare, Piscataway, NJ | US20539-5UN | 1 U ~50mg |
RUNX2 antibody | MBL International Corp., Woburn, MA | D130-3 | 1 mg/ml |
Fab-specific peroxidase conjugated antibody | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A9917 | 7.1 mg/ml |
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) | EXALPHA Biologicals, Shirley, MA | X1189S | 100 ml |
Sodium carbonate | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 57995 | Plate-fixing |
Sulfuric Acid | VWR, West Chester, PA | BDH-39922-1 | Stop solution |
Multi-well plates | Greiner Bio-One, Basel, Switzerland | 655996 | Avidin-coated, black sides |
HALT | Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL | 78440 | Protease and phosphatase inhibitors |
Chemicals | Various manufacturers | Laboratory grade | |
Table 1. Reagents | |||
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader | Amersham Biosciences | For use with stop reaction method | |
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader | Bio-Tek Instruments, Inc. | For use with continuous kinetic monitoring | |
Table 2. Equipment |