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Biology

जीन एक्सप्रेशन का डीएनए बातचीत, डिस्कवर transcriptional नियामकों, और उपन्यास विरोधी ट्यूमर एजेंटों की पहचान: प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक मात्रात्मक परख

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

हम डीएनए के साथ प्रतिलेखन कारक बातचीत को मापने के लिए एक मात्रात्मक डीएनए बाध्यकारी, एलिसा आधारित परख विकसित की है. RUNX2 प्रोटीन के लिए उच्च विशिष्टता एक आम सहमति डीएनए मान्यता oligonucleotide और विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ हासिल की थी. एक एंजाइम युग्मित एंटीबॉडी सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के साथ वर्णमिति पता लगाने के वास्तविक समय में नजर रखी थी.

Abstract

ऐसे electrophoretic गतिशीलता पारी assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (चिप) आधारित assays, और multiwell आधारित assays के रूप में कई डीएनए बाध्यकारी assays प्रतिलेखन कारक गतिविधि को मापने के लिए किया जाता है. हालांकि, इन assays, nonquantitative हैं विशिष्टता की कमी है, radiolabeled oligonucleotides के इस्तेमाल को शामिल कर सकते हैं, और बाध्यकारी डीएनए के inhibitors की स्क्रीनिंग के लिए अनुकूल नहीं हो सकता है. दूसरी ओर, एक मात्रात्मक डीएनए बाध्यकारी एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (डी एलिसा) परख का उपयोग कर, हम बायोटिन पर मौजूद आम सहमति डीएनए बाध्यकारी दृश्यों के साथ विशेष सहयोग पर निर्भर करती है कि RUNX2 प्रतिलेखन कारक का उपयोग डीएनए के साथ परमाणु बातचीत प्रोटीन का प्रदर्शन लेबल oligonucleotides. कोशिकाओं की तैयारी, परमाणु प्रोटीन, और डबल असहाय oligonucleotides के डिजाइन की निकासी वर्णित हैं. Avidin में लिपटे 96 अच्छी तरह प्लेटें क्षारीय बफर के साथ तय की और न्यूक्लियोटाइड अवरुद्ध बफर में परमाणु प्रोटीन के साथ incubated हैं. Follप्लेटों की व्यापक धोने, विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी और माध्यमिक एंटीबॉडी incubations कारण वर्णमिति प्रतिक्रिया की हॉर्सरैडिश peroxidase सब्सट्रेट और विकास के अलावा द्वारा पीछा कर रहे हैं. बंद करो प्रतिक्रिया मोड या निरंतर गतिज निगरानी मात्रात्मक डीएनए के साथ प्रोटीन बातचीत को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया. हम गैर विशिष्ट आईजीजी साथ या प्रोटीन या प्राथमिक एंटीबॉडी के बिना उपचार सहित उपयुक्त विशिष्टता नियंत्रण, पर चर्चा की. परख के आवेदन इसकी दवा स्क्रीनिंग में उपयोगिता और प्रतिनिधि सकारात्मक और नकारात्मक परिणामों पर चर्चा कर रहे हैं सहित वर्णित हैं.

Introduction

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डीएनए बाध्यकारी assays के डीएनए के साथ बातचीत करने के लिए प्रतिलेखन कारक की क्षमता को मापने में उपयोगिता है. बंधन डीएनए के लिए assays radiolabeled oligonucleotides 1 या chemiluminescence assays 2 पर निर्भर है कि electrophoretic गतिशीलता पारी assays (EMSA) शामिल हैं. 96 अच्छी तरह स्वरूपों 4 रोजगार chromatin immuneprecipitation (चिप) आधारित assays 3 के साथ ही assays भी वर्णन किया गया है. हालांकि, EMSA radiolabeled oligonucleotides के उपयोग की आवश्यकता है कि एक गैर मात्रात्मक परख है. परमाणु प्रोटीन विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड प्रमोटर दृश्यों के साथ संबद्ध करते हैं, बंधन परिसरों polyacrylamide जैल पर मंद कर रहे हैं और विशिष्ट प्रतिलेखन कारक एक एंटीबॉडी "supershift" के साथ मान्य किया जा सकता है. हम परिभाषित प्रमोटर तत्वों को इसी डीएनए बाध्यकारी दृश्यों के साथ RUNX2 की बातचीत के उपाय करने में सक्षम है जो एक एंजाइम से जुड़ी immunosorbent प्रारूप (डी एलिसा), का उपयोग कर एक मात्रात्मक डीएनए बाध्यकारी परख विकसित किया है मैंn RUNX2 लक्ष्य जीन. एक विरोधी RUNX2 एंटीबॉडी का प्रयोग परख करने के लिए विशिष्टता प्रदान करता है और radiolabel की कमी परंपरागत जेल शिफ्ट परख 5 से इस परख भेद. बंधन परिसरों की जांच spectrophotometric विश्लेषण के लिए एक रंग उत्पाद के लिए एक एचआरपी सब्सट्रेट, tetramethyl बैन्जीडाइन (TMB) धर्मान्तरित जो हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी), मिलकर माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के साथ संभव है. यहां बताया परख नियंत्रण के रूप में उत्परिवर्तित डीएनए oligonucleotides के इस्तेमाल को शामिल कर सकते हैं और बाध्यकारी डीएनए की प्रतियोगी या गैर प्रतिस्पर्धी inhibitors का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उपन्यास विरोधी ट्यूमर यौगिकों की स्क्रीनिंग इस परख के साथ भी संभव है.

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Protocol

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कई कदम आगे समय के प्रदर्शन कर रहे हैं और कई अभिकर्मकों प्रक्रिया से पहले तैयार और संग्रहीत हैं: (1) सेल संस्कृति और प्रोटीन अलगाव, (2) oligonucleotide की तैयारी, (3) 96 अच्छी तरह से प्लेटों की तैयारी, (4) परमाणु निकालने ऊष्मायन रातोंरात. प्रक्रिया क्योंकि डीएनए oligonucleotides के साथ परमाणु प्रोटीन की रात ऊष्मायन के 2 दिनों की आवश्यकता है.

1. बफ़र की तैयारी

1.1 परमाणु प्रोटीन अलगाव

  1. Hypotonic बफर: hypotonic बफर के 100 मिलीलीटर तैयार करते हैं, 98.3 मिलीलीटर एच 2 ओ 1 एमएल (1 एम HEPES, 7.9 पीएच), 150 μl (1 एम MgCl 2), 333 μl (3 एम KCl) जोड़ अंतिम सांद्रता: 10 मिमी HEPES, 1.5 मिमी 2 MgCl, 10 मिमी KCl. Hypotonic बफर + NP40 (कदम 2.11 में उपयोग के लिए) के लिए: अंतिम 0.5% NP40 के लिए 9.5 मिलीलीटर Hypotonic बफर करने के लिए 0.5 मिलीलीटर (10% NP40) जोड़ें.
  2. कम नमक बफर: (कदम 2.15 में उपयोग के लिए) कम नमक बफर के 100 एमएल तैयार करने के लिए, 1 मिलीलीटर (1 एम HEPES, 7.9 पीएच), 25 मीटर जोड़एल ग्लिसरॉल, 150 μl (1 एम MgCl 2), 666 μl (3 एम KCl), 40 μl (0.5 एम EDTA) 73 मिलीलीटर एच 2 ओ के लिए अंतिम सांद्रता: 10 मिमी HEPES, 25% ग्लिसरॉल, 1.5 मिमी 2 MgCl, 20 मिमी KCl, 0.2 मिमी EDTA.
  3. उच्च नमक बफर: (कदम 2.15 में उपयोग के लिए) उच्च नमक बफर के 100 एमएल तैयार करने के लिए, 1 मिलीलीटर (1 एम HEPES, 7.9 पीएच), 25 एमएल ग्लिसरॉल, 150 μl (1 एम MgCl 2), 26.7 मिलीलीटर जोड़ने (3 एम KCl), 40 μl (0.5M EDTA) 47 मिलीलीटर एच 2 ओ के लिए अंतिम सांद्रता: 10 मिमी HEPES, 25% ग्लिसरॉल, 1.5 मिमी 2 MgCl, 800 मिमी KCl, 0.2 मिमी EDTA.
  4. 10% NP40 डिटर्जेंट: 10 मिलीलीटर NP40 90 मिलीलीटर एच 2 हे
  5. प्रोटीज और फॉस्फेट inhibitors [hypotonic बफर करने के लिए जोड़ा + NP40 (कदम 2.11), कम नमक बफर (कदम 2.15) के लिए, और उच्च नमक बफर (कदम 2.15) का उपयोग करने के लिए सिर्फ पूर्व]: 2.5 μl (1 एम डीटीटी) जोड़ें और 50 0.5 मिमी डीटीटी और 1x protease inhibitors का अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक बफर के 5 मिलीलीटर protease inhibitors (100x) की μl. protease अवरोध 100x स्टॉक मिश्रण में शामिल हैं:सोडियम फ्लोराइड (सर्विसेज / THR, अम्लीय फास्फेटेजों), सोडियम orthovanadate (Tyr, क्षारीय फास्फेटेजों), β-glycerophosphate (सर्विसेज / Thr फास्फेटेजों), सोडियम पाइरोफॉस्फेट (सर्विसेज / Thr फास्फेटेजों), Aprotinin (सर्विसेज proteases), Bestatin (एमिनो peptidases ), E64 (सिस्टीन proteases), Leupeptin (सर्विसेज / Cys proteases), EDTA (metalloproteases).

परख प्लेटों के 1.2 तैयारी

  1. प्लेट समाधान फिक्सिंग:, समाधान की 500 मिलीलीटर तैयार 500 मिलीलीटर एच 2 ओ के लिए 5.25 ग्राम सोडियम कार्बोनेट जोड़ने, मिश्रण अच्छी तरह से और 0.1 एम सोडियम कार्बोनेट के अंतिम एकाग्रता के लिए 9.7 पीएच को समायोजित करने के लिए.
  2. प्लेट अवरुद्ध समाधान: शेयर पाली तैयार करने के लिए डि / डीसी oligonucleotide, resuspend 1 यूनिट (~ 50 मिलीग्राम) में पाली डि / डीसी का 1 10 मिमी Tris / एचसीएल, 50 ग्राम के एक शेयर एकाग्रता के लिए 1 मिमी EDTA युक्त पीएच 7.9 मिलीग्राम / μl. शेयर 1 ग्राम / उपयोग करने के लिए μl से पहले पतला है.

1.3 धो buffers और एंटीबॉडी dilutions

नोट: Streptavidin धोने बफर है परिवर्धन के बीच में प्लेटें धोने के लिए और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी पतला करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

  1. Streptavidin धोने बफर के 1 एल तैयार करने के लिए, 2.4 ग्राम Tris / एचसीएल, 37.5 मिलीलीटर (4 एम NaCl), 10 मिलीलीटर (10% बीएसए), 5 एमएल (10% बीच 20), 1 एल Millipore बाँझ पानी फ़िल्टर को जोड़ने , पीएच 7.18. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर अंतिम सांद्रता: 20 मिमी Tris / एचसीएल, 150 मिमी NaCl, 0.1% बीएसए, 0.05% बीच 20.

1.4 डीएनए बाध्यकारी बफर

नोट: यह बफर -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाता है

  1. डीएनए बाध्यकारी बफर के 15 मिलीलीटर की तैयारी करने के लिए, 180 μl (1 एम HEPES, 7.9 पीएच), 300 μl (3 एम KCl), 12 μl (0.5 एम EDTA, पीएच 8.0), 7.5 μl (1 एम डीटीटी), 3.0 मिलीलीटर जोड़ने (60% ग्लिसरॉल), 300 μl (50 माइक्रोग्राम / μl पाली डि / डीसी) आसुत / विआयनीकृत एच 2 ओ (12 एमएल) के साथ पतला. अंतिम सांद्रता: 12 मिमी HEPES / 7.9 पीएच, 60 मिमी KCl, 0.4 मिमी EDTA, 0.5 मिमी डीटीटी, 12% ग्लिसरॉल, 1 ग्राम / μl पाली डि / डीसी.

2. सेल संस्कृति और परमाणु प्रोटीन अलगाव

टी "> ध्यान दें:.. तैयारी प्रत्येक प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया कोशिकाओं की संख्या अलग अलग होंगे कोशिकाओं की उत्तेजना प्रयोग पर निर्भर करेगा के बारे में 3 घंटे की आवश्यकता है और सभी संस्करणों 3 x 10 7 कोशिकाओं / बिंदु का उपयोग कर एक ठेठ प्रयोग प्रतिबिंबित को समायोजित करने के संस्करणों को समायोजित करें. वास्तव में प्रयोग 6 में इस्तेमाल सेल नंबर.

  1. डीएनए बाध्यकारी assays, उपयुक्त मीडिया 6 में RUNX2 (endothelial, ऑस्टियो सार्कोमा, स्तन कैंसर की कोशिकाओं) व्यक्त कि संस्कृति मानव कोशिकाओं के लिए परमाणु प्रोटीन तैयार करने के लिए.
  2. G2 / एम सेल चक्र सीमा 6 में कोशिकाओं को गिरफ्तार करने nocodazole (16 घंटे के लिए 0.2 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ subconfluent कोशिकाओं का इलाज. इन शर्तों के तहत, RUNX2 प्रोटीन स्थिर है और बाध्यकारी अधिक से अधिक डीएनए हासिल की है. कई assays और inhibitors ही तैयारी से तुलना की जा सकती के लिए इस तरह, पर्याप्त परमाणु प्रोटीन उपलब्ध है.
  3. हर कदम के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र पूर्व शांत और बफ़र्स तैयार करने और सेल फसल से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट सर्द.
  4. सर्द कोशिकाओं (4 डिग्री सेल्सियस) और बर्फ पर आचरण प्रक्रियाओं.
  5. एक 15 मिलीलीटर polypropylene दौर नीचे ट्यूब में 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं.
  6. ठंडा पीबीएस के साथ धो 1x (सीए 2 + और ​​2 मिलीग्राम + मुक्त).
  7. फिर अपकेंद्रित्र और पीबीएस सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  8. पूरी तरह से सेल गोली resuspend करने के लिए सावधान किया जा रहा है, protease inhibitors के बिना hypotonic बफर के 500 μl जोड़ें.
  9. एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब के लिए सामग्री हस्तांतरण.
  10. इसके तत्काल बाद 5.5 मिनट के लिए 5500 rpm पर अपकेंद्रित्र, सतह पर तैरनेवाला त्यागने और सेल गोली रखें.
  11. 0.5% NP40 युक्त hypotonic बफर के 500 μl में सेल गोली Resuspend. प्रोटीज और फॉस्फेट inhibitors और 0.5 मिमी डीटीटी (चरण 1.1.5 में वर्णित है) में जोड़ें.
  12. नमूना 30 मिनट के लिए बर्फ पर आराम करने की अनुमति.
  13. 10 मिनट के लिए 13,000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
  14. सतह पर तैरनेवाला (साइटोसोलिक प्रोटीन होता है) त्यागें.
  15. 60 μl कम साल में से प्रत्येक में परमाणु गोली Resuspendटी बफर (जो करने के लिए protease inhibitors और 0.5 मिमी डीटीटी कदम 1.1.5 से जोड़ दिया गया है) और 120 μl की कुल के लिए उच्च नमक बफर (जो करने के लिए protease inhibitors और 0.5 मिमी डीटीटी कदम 1.1.5 से जोड़ दिया गया है). पहली गोली और resuspend करने के लिए कम नमक बफर के 60 μl जोड़ें, तो उच्च नमक बफर के 60 μl जोड़ें. मेजबान में सहायता करने के लिए गोली भंवर.

नोट: यह कदम परमाणु झिल्ली प्रोटीन से कुछ से छुटकारा पाने में मदद करता है और सेल कदम के लिए स्थापित: कम नमक पहले (resuspend गोली, भंवर), तो उच्च नमक (भंवर) इस कदम का अनुकूलन. पहले 10 मिनट के बाद vortexing के साथ 30 मिनट के लिए बर्फ पर निकालने रखें.

  1. 15 मिनट के लिए 12,000 rpm पर अपकेंद्रित्र, परमाणु प्रोटीन युक्त सतह पर तैरनेवाला रखना.
  2. सी. ° -80 में प्रोटीन एकाग्रता (2-5 मिग्रा / मिली पर नमूने रखने की कोशिश), उचित मात्रा में (10 μl / ट्यूब) में विभाज्य और दुकान उपाय

नोट: अनुमानित उपज: 30 x 10 6 सीईएलLS 120 μl में 5 ग्राम / μl प्रोटीन निकलेगा. 5 x 10 6 कोशिकाओं 40 μl में 2.2 माइक्रोग्राम / μl प्रोटीन निकलेगा.

3. डबल असहाय प्रोटोकॉल की तैयारी

  1. सिरों पर संगत आधा साइटों के साथ पूरक oligonucleotides डिजाइन. RUNX2 के लिए ये हैं: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC टीसीजी-3'-बायोटिन (भावना) और 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT टी GTGGTT AATACG-3'-बायोटिन (antisense).

नोट: तीन RUNX2 बाध्यकारी साइटों और एक अंत लेबल बायोटिन सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सामने आए निर्धारित किया है कि पायलट प्रयोगों.

  1. 5x annealing बफर तैयार: 260 μl एच 2 ओ (अंतिम 600 μl) को 300 μl (1 एम Tris-एचसीएल, पीएच 7.6), 30 μl (1 एम MgCl 2), 10 μl (1 एम डीटीटी) जोड़ें.
  2. प्रत्येक एकल असहाय olig की 200 pmol करेंonucleotide (3 μl), 5x annealing बफर के 12 μl और 60 μl (200 pmol/60 μl) की कुल के लिए 45 μl एच 2 हे जोड़ें.
  3. एक हीटिंग ब्लॉक में 5-10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर हीट.
  4. 65 डिग्री के लिए कूल धीरे धीरे हीटिंग ब्लॉक (या 65 डिग्री सेल्सियस पानी के 50 एमएल में रखकर की बिजली बंद करके धीरे से कमरे के तापमान को शांत तो, (65 डिग्री सेल्सियस तक तापमान की स्थापना करके, यह 15 मिनट लगते हैं) सी बर्फ पर एक बीकर में, इस) 15-20 मिनट लगते हैं.

4. 96 अच्छी तरह प्लेटें की तैयारी

नोट: धो बफ़र्स में दूध प्रोटीन का उपयोग न करें.

  1. फिक्सिंग समाधान (0.1 एम सोडियम कार्बोनेट) के साथ प्लेट फिक्स: 300 μl / अच्छी तरह से जोड़ें.
  2. कमरे के तापमान (आर टी) में कमाल, या कोई 4 डिग्री सेल्सियस (ओ / एन) में कमाल से 2 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. Streptavidin धोने बफर (पश्चिम बंगाल) के साथ थाली 3x धो लें: 300 μl / अच्छी तरह से हर समय जोड़ने.
  4. डब्ल्यू 2 घंटे के लिए बायोटिन लेबल डबल असहाय oligonucleotide (न्यूक्लियोटाइड प्रति 3 आम सहमति बाध्यकारी साइटों) जोड़ेंith (1.25 nmol / अच्छी तरह से, 100 μl / अच्छी तरह से) कमाल.
  5. ठंड पश्चिम बंगाल के साथ 3X धो: 300 μl / अच्छी तरह से जोड़ सकते हैं और फिर तुरंत एक सिंक में थाली पलटना और इसके अतिरिक्त प्रत्येक के बाद एक कागज तौलिया पर किनारों दाग.

नोट: इस avidin नोच सकता है प्लेटों से तरल पदार्थ को निकालने के लिए पिपेट सुझावों का उपयोग न करें: बायोटिन: कुओं से डीएनए परिसरों. बाद के सभी धोने कदम के लिए यह करो.

5. परमाणु निकालने के साथ ऊष्मायन

नोट: पाली डि / डीसी अवरुद्ध बफर के लिए सामन या हेरिंग शुक्राणु डीएनए विकल्प नहीं है. दूध प्रोटीन के साथ प्लेटों को अवरुद्ध करने से बचें. इन अवरुद्ध एजेंटों के दोनों उच्च पृष्ठभूमि मूल्यों में परिणाम.

  1. परमाणु निकालने (90 μl / अच्छी तरह से) से तैयार विशिष्ट प्रतिलेखन कारक के साथ सेते हैं. परमाणु निकालने युक्त एक मास्टर मिश्रण तैयार (डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन, 3-9 ग्राम / अच्छी तरह से) पाली डि / डीसी 1x डीएनए में (एक 50 माइक्रोग्राम / उल स्टॉक से 1 ग्राम / μl) बफर बंधन. मात्रा के रूप में की कुल संख्या के लिए आवश्यक हैआवश्यक वेल्स (90 μl / अच्छी तरह से).
  2. विटामिन डी 3 (चित्रा 2) या सी ए यौगिक 5221975 (चित्रा 3), या इथेनॉल जैसे विलायक नियंत्रण के उचित कमजोर पड़ने के रूप में किसी भी संभावित अवरोध, इस चरण में जोड़ा जाता है.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन, मंच का घोड़ा पर जगह थाली
  4. पश्चिम बंगाल के साथ 3X धो: 300 μl / अच्छी तरह से जोड़

6. प्राथमिक एंटीबॉडी के अलावा

नोट: प्राथमिक एंटीबॉडी dilutions नए सिरे से तैयार किया जाना चाहिए - भंडारण की सिफारिश नहीं है.

  1. RUNX2 विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (शेयर 1 ग्राम / μl) 1/5, Streptavidin में 000 बफर धोने पतला. 96 अच्छी तरह से थाली (90 μl / अच्छी तरह से) तीन प्रतियों में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के अलावा के लिए पर्याप्त तैयारी.
  2. एक कमाल मंच पर आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
  3. पश्चिम बंगाल के साथ 3X धो, 300 μl / अच्छी तरह से जोड़ें.

7. माध्यमिक एंटीबॉडी के अलावा

नोट: माध्यमिक एंटीबॉडी dilutions sto किया जा सकता हैअगले दिन की जरूरत है यदि रात में 4 डिग्री सेल्सियस पर लाल.

  1. Streptavidin में 1:1,400 एफ एबी विशेष आत्मीयता शुद्ध किया एचआरपी संयुग्मित एंटीबॉडी (7.1 मिलीग्राम / एमएल शेयर) पतला बफर धोने: 3.5 μl antibody/5.0 मिलीलीटर धोने बफर. 96 अच्छी तरह से थाली (90 μl / अच्छी तरह से) तीन प्रतियों में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के अलावा के लिए पर्याप्त तैयारी.
  2. एक कमाल मंच पर आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  3. सिंक (300 μl / अच्छी तरह से) में थाली inverting द्वारा पश्चिम बंगाल के साथ धो 6x.

8. एचआरपी सब्सट्रेट और उत्पाद विकास

  1. शेयर बोतल से अच्छी तरह से सीधे प्रति TMB सब्सट्रेट के 50 μl जोड़ें.
  2. अंधेरे में आरटी पर 10-20 मिनट सेते (प्रतिक्रिया विधि रोक) या सीधे (निरंतर गतिज निगरानी) absorbance के उपाय.

9. रिएक्शन मापन

  1. प्रतिक्रिया पद्धति बंद करो: दृश्य स्टॉप प्रतिक्रिया के लिए, नीले रंग के लिए स्पष्ट से रंग बदलने के लिए जाँच और 50 μl सल्फ्यूरिक एसिड के साथ प्रतिक्रिया बंद करो.
  2. साथ 450 एनएम पर absorbance के उपायBiotrak द्वितीय दर्शनीय प्लेट रीडर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (Amersham बायोसाइंसेज, जीई हेल्थकेयर बायोसाइंसेज कार्पोरेशन Piscataway न्यू जर्सी, संयुक्त राज्य अमरीका) या ऐसे ही एक साधन.
  3. सतत गतिज निगरानी विधि: पिछले धोने के बाद सब्सट्रेट जोड़ें और बस से पहले स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में रखने के लिए (प्रतिक्रिया रोक नहीं है).
  4. बायो टेक सिनर्जी एचटी मल्टी प्रतिक्रिया microplate रीडर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ 635 एनएम पर absorbance के उपाय (बायो टेक उपकरण, इंक, Winooski, वीटी, यूएसए) या ऐसे ही एक साधन.

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Representative Results

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डी एलिसा विधि के रूप में लंबे समय तक आम सहमति RUNX2 बाध्यकारी साइट (ACACCA) की तीन प्रतियां युक्त एक विशिष्ट अनुक्रम, डबल असहाय oligonucleotide प्रयोग किया जाता है के रूप में नामित डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के लिए अत्यधिक विशिष्ट है. प्रोटीन कारक पहचानने प्राथमिक एंटीबॉडी भी विशिष्टता को बढ़ाता है. माध्यमिक एंटीबॉडी का पता लगाने में आसानी (चित्रा 1) के लिए एक रंग उत्पाद के लिए एक स्पष्ट सब्सट्रेट (tetramethyl बैन्जीडाइन) धर्मान्तरित कि covalently से जुड़े हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) शामिल हैं. इन कारणों के लिए, कई महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि नियंत्रण बंधन विशिष्ट डीएनए सुनिश्चित करने के लिए प्रत्येक परख थाली में शामिल किए जाने की जरूरत है. ये (1) कोई परमाणु प्रोटीन, (2) कोई प्राथमिक एंटीबॉडी, या (3) एक गैर विशिष्ट माउस आईजीजी के बजाय विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी जिसमें या तो कुओं में माध्यमिक एंटीबॉडी एचआरपी प्रतिक्रिया से वर्णमिति उत्पाद मापने शामिल हैं. हमारी दिनचर्या माप में, कोई प्रोटीन नियंत्रण विशिष्ट प्रोटीन एक से घटाया जाता हैएन डी नेट प्रतिक्रिया उत्पाद के रूप में व्यक्त किया. कंप्यूटर की मदद से दवा डिजाइन (सी ए) यौगिकों की खोज करने के लिए प्रयोग किया जाता है और दवाओं डीएनए बाध्यकारी assays में परीक्षण कर रहे हैं इसके अलावा, जब, विलायक के प्रभाव यौगिकों अलग कुओं में निर्धारित किया जाना चाहिए solubilize के लिए इस्तेमाल किया. आमतौर पर, दवा स्क्रीनिंग यौगिकों solubilize लिए पानी, इथेनॉल, या डाइमिथाइल sulfoxide के उपयोग की आवश्यकता होगी. इन विलायकों में से प्रत्येक को अलग से और उचित मात्रा में परीक्षण किया है. कुछ दवा स्क्रीन विटामिन डी रिसेप्टर ligand के लिए के रूप में दिखाया चित्रा (2) ,25-OH विटामिन डी 3 1α, बंधन, डीएनए पर खास असर नहीं कि यौगिकों की पहचान की. इस यौगिक भी उच्च सांद्रता (100 माइक्रोन के लिए 100 एनएम) पर बाध्यकारी डीएनए को बाधित नहीं किया. अन्य दवा स्क्रीन प्रोटीन बाधित यौगिकों कि पता चला: डीएनए बाध्यकारी (चित्रा 3). CADD5221975 अवरोध करनेवाला की बढ़ती मात्रा गतिज माप 7 का विश्लेषण करती है, डब्ल्यू एक खुराक पर निर्भर, sigmoidal निषेध की अवस्था में हुई आधार पर10 -11 एम नीचे सांद्रता बहुत कम निषेध दिखाया जबकि ith, प्रभावी रूप से बाध्यकारी डीएनए बाधा 10 -3 मीटर ऊपर सांद्रता अवरोध करनेवाला. चुनाव आयोग 50 (डीएनए को RUNX2 के बंधन में 50% की कमी के कारण अवरोध करनेवाला, जिस पर एकाग्रता) इस परिसर के लिए 10 एनएम था. इस परख के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण पहले 6 प्रकाशित किया गया है और सादगी के लिए, कुओं की तीन प्रतियों श्रृंखला के सिर्फ एक ही अच्छी तरह से प्रतिनिधि आंकड़े 2 और 3 में दिखाया गया है.

चित्रा 1
चित्रा 1. डी एलिसा प्रोटोकॉल का फ्लो चार्ट. (ए) स्तनधारी कोशिकाओं से परमाणु प्रोटीन पृथक. बढ़ कोशिकाओं डिटर्जेंट सेल और कसकर डीएनए के साथ जुड़े प्रोटीन निकालने के लिए उच्च नमक तरीकों से fractionated कर रहे हैं. (बी) डी तैयार करेंouble फंसे oligonucleotide. तीन प्रतियों में RUNX2 बाध्यकारी साइट ACACCAA 3'-अंत में एक बायोटिन टैग के साथ तैयार किया जाता है. (सी) 96 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें. प्लेट्स avidin कोटिंग के साथ प्राप्त कर रहे हैं, लेकिन बायोटिन लेबल oligonucleotides जोड़ने से पहले उच्च पीएच के साथ तय किया जाना चाहिए. (डी) डीएनए के साथ परमाणु अर्क सेते हैं. प्लेट्स पूर्व परमाणु निकालने प्रोटीन के अलावा गैर विशिष्ट poly-dI/dC साथ अवरुद्ध कर रहे हैं. (ई) प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें. एंटीबॉडी पूर्व थाली के साथ ऊष्मायन के लिए नए सिरे से तैयार किया जाता है. (एफ) माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ें. माध्यमिक एंटीबॉडी व्यापक धोने के बाद है. (जी) एचआरपी सब्सट्रेट जोड़ें और उत्पाद विकास. वर्णमिति उत्पाद थाली पर दिख रहा है. (एच) एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर उत्पाद absorbance के उपाय. Absorbance 450 एनएम (प्रतिक्रिया को रोकने के) या 635 एनएम (सतत निगरानी) या तो है. (मैं) 635 एनएम पर ठेठ निरंतर readout. विशेष प्रतिक्रिया और बीए दिखायाckground (कोई प्रोटीन) तीन प्रतियों में नियंत्रित करता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. 1α ,25-OH विटामिन डी 3 इस प्रतिनिधि उदाहरण में. बंधन RUNX2 डीएनए पर थोड़ा प्रभाव है, जैविक रूप से सक्रिय विटामिन डी 3, 1α ,25-OH विटामिन डी 3, बंधन RUNX2 डीएनए पर थोड़ा प्रभाव है. अन्य विटामिन डी 3 यौगिकों, तथापि, डीएनए 6 बंधन पर नाटकीय प्रभाव है.

चित्रा 3
चित्रा 3. ख्यात RUNX2 से बाध्यकारी डीएनए का निषेध:. डीएनए सक्रिय दवा इस प्रतिनिधि उदाहरण में, एक कंप्यूटर की मदद से दवा डिजाइन (सी ए) स्क्रीन से पहचान की थी कि एक यौगिक 1 एनएम से 100 माइक्रोन के लिए बाध्य RUNX2 डीएनए की एक खुराक पर निर्भर निषेध का प्रदर्शन किया. बंधन निषेध स्थापित तरीकों का उपयोग कर की गणना की गई 7और 10 एनएम के एक चुनाव आयोग 50 (बंधन डीएनए के एक 50% निषेध के परिणामस्वरूप कि अवरोध करनेवाला की एकाग्रता) झुकेंगे.

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Discussion

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डीएनए बाध्यकारी assays के डीएनए के साथ बातचीत करने के लिए प्रतिलेखन कारक की क्षमता को मापने के लिए किया जाता है. बंधन डीएनए के लिए assays electrophoretic गतिशीलता पारी (EMSA) 1 और chromatin immuneprecipitation (चिप) आधारित assays 3 के साथ ही 96 अच्छी तरह स्वरूपों ऐसे chemiluminescent assays के रूप में 2 से 4 को रोजगार assays शामिल हैं. EMSA गैर मात्रात्मक है और radiolabeled (32 पी) oligonucleotides का उपयोग करता है. ये परमाणु प्रोटीन के साथ incubated हैं और बाध्यकारी परिसरों agarose या polyacrylamide जैल पर अलग हो रहे हैं. इसके विपरीत, मात्रात्मक डी एलिसा RUNX2 लक्ष्य जीन में परिभाषित प्रमोटर तत्वों को इसी डीएनए बाध्यकारी दृश्यों के साथ RUNX2 की बातचीत को मापने के लिए सक्षम है. एक विरोधी RUNX2 एंटीबॉडी का उपयोग परख की विशिष्टता वृद्धि हुई है और पारंपरिक जेल शिफ्ट परख 5 से इस परख अलग. डी एलिसा इन विट्रो परख है और जीवित कोशिकाओं में प्रमोटर अधिभोग सर्वेक्षण नहीं कर सकते हैं,चिप assays के साथ संभव है, जो यह मात्रात्मक डीएनए बाध्यकारी परिसरों कि रोकना यौगिकों के लिए स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये assays का विश्लेषण करती है और एक विशिष्ट प्रमोटर सक्रिय या दमित है कि क्या भविष्यवाणी नहीं कर सकते डीएनए बातचीत तक ही सीमित हैं. ऐसे प्रमोटर-luciferase संवाददाता assays के रूप में आगे दृष्टिकोण, विशिष्ट प्रतिलेखन कारक के transcriptional गतिविधि को परिभाषित करने के लिए आवश्यक हैं.

यहाँ वर्णित डी एलिसा विधि का सामान्य प्रोटोकॉल सक्रिय Nfkappa बी 8 मापने के लिए इस्तेमाल पिछले एक विधि से लिया गया था. इस डी एलिसा प्रोटोकॉल मात्रात्मक प्रोटीन को मापने के लिए एक तरीका प्रदान करता है: डीएनए अनुक्रम कि विशिष्ट है और रेडियोधर्मिता के इस्तेमाल को शामिल नहीं करता है बंधन. यदि आवश्यक हो, प्रतिक्रिया वेग (वी मैक्स) भी प्रतिक्रिया की निरंतर गतिज निगरानी से गणना की जा सकती है और इस परीक्षण यौगिकों 7 के अतिरिक्त भेदभाव प्रदान कर सकता है.

RUNX2 और इसके cofactorCBF एसएस इस प्रकार परख की विशिष्टता मान्य है और यह भी कि यह विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी प्रतिलेखन कारक के साथ संबद्ध हो सकता है कि cofactors की पहचान संभव है कि बल, बायोटिन लेबल oligonucleotides 6 के साथ जुड़ा होना पाया गया. निरंतर गतिज निगरानी के साथ, ऊष्मायन बढ़ाया जा सकता है और कम परमाणु प्रोटीन बाध्यकारी डीएनए में परिवर्तन का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है. इसलिए, गतिज निगरानी बंद करो प्रतिक्रिया तरीकों की तुलना में अधिक संवेदनशील होने की उम्मीद है. इस गतिज विधि का एक महत्वपूर्ण आवेदन 6 बंधन प्रतिलेखन कारक डीएनए रोकना या सक्रिय दवाओं के लिए स्क्रीनिंग में शामिल हैं.

परख के निष्पादन में पैदा हो सकता है कि अन्य संभावित समस्याओं उच्च पृष्ठभूमि मूल्यों की मौजूदगी में शामिल हैं. (1) उच्च माध्यमिक एंटीबॉडी सांद्रता, (2) अपर्याप्त अवरुद्ध, (3) अवरोधक के रूप में सामन शुक्राणु डीएनए का प्रयोग, (4) एक अवरुद्ध प्रोटीन कदम या (5) का अभाव: उच्च पृष्ठभूमि मूल्यों के कारण हो सकता हैकम विशिष्टता के साथ प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी. (1) पायलट अध्ययन में माध्यमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता के अनुकूलन और अच्छी तरह से प्रति एंटीबॉडी का कम मात्रा का उपयोग करते हुए, (2) एक बुनियादी सोडियम कार्बोनेट समाधान के साथ थाली अवरुद्ध (3) DI का उपयोग /: इन सामना कर रहे हैं, तो कई उपायों सहित संभव हैं डीसी बल्कि प्रतिलेखन बंधन तत्वों, या (4) विभिन्न स्रोतों से प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी के विभिन्न जोड़े उपयोग करने के साथ प्रमोटरों भी हो सकते हैं जो सामन शुक्राणु, की तुलना में गैर विशिष्ट डीएनए के रूप में.

दूसरी ओर, कम सिग्नल की शक्ति का लक्ष्य प्रोटीन की (1) कम राशि, (2) प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी की सांद्रता इष्टतम नहीं कर रहे हैं, (3) उत्तेजना और / या उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य (इष्टतम नहीं कर रहे हैं, और की वजह से हो सकता है 4) एंटीबॉडी उनके substrates के लिए गरीब आकर्षण है. इन समस्याओं के लिए कई उपायों में शामिल हैं: कम कोशिकाओं लाभ कर रहे हैं (1) समस्या निवारण के भाग के रूप में, एक 30 μl कम नमक बफर + 30 μl उच्च नमक बफर का उपयोग कर सकते हैंसक्षम और परमाणु प्रतिलेखन कारक उच्च मात्रा में मौजूद है. अधिक कोशिकाओं उपलब्ध हैं या यदि एक कम नमक बफर + 90 μl कम नमक बफर 90 μl इस्तेमाल कर सकते हैं. परीक्षण किया जाना विशिष्ट कारक की अभिव्यक्ति कम होने पर अधिक कक्षों उपयोगी होते हैं. (2) संकेत बढ़ाने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता का अनुकूलन. (3) वे TMB सब्सट्रेट के लिए सही उत्तेजना और उत्सर्जन Maxima के लिए सेट कर रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए साधन पर फिल्टर मॉनिटर, वैकल्पिक फ्लोरोसेंट या chemiluminescent substrates भी इस्तेमाल किया जा सकता है. प्राथमिक एंटीबॉडी कम आत्मीयता की है (4), थाली पर ऊष्मायन के समय में वृद्धि.

दवाओं की खोज के संदर्भ में, वर्तमान RUNX2 डीएनए बाध्यकारी एलिसा इसकी डीएनए लक्ष्य और बाध्यकारी डीएनए के चयनात्मक modulators हैं (जैसे कि विटामिन डी 3) के रूप में पहचान की प्राकृतिक यौगिकों के लिए एक प्रोटीन के बंधन बढ़ाया पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन यौगिकों से कुछ कार्रवाई की गैर प्रतिस्पर्धी तंत्र प्रदर्शन और संगत के साथ जैविक समारोह में परिवर्तनएक interfacial निषेध प्रतिमान 9. जीनोमिक डीएनए अनुक्रमण का हाल संकल्प के साथ, आगे आवेदन कोडन क्षेत्रों में 10 की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करता है, जो गैर कोडन ("जंक") डीएनए, के साथ बातचीत के उपन्यास प्रोटीन की खोज शामिल हो सकते हैं.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

तकनीकी सहायता और मैरीलैंड विश्वविद्यालय के Greenebaum कैंसर केंद्र Translational कोर सुविधा, विशेष रूप से डीआरएस का इंस्ट्रूमेंटेशन. Rena Lapidus और Mariola Sadowska, कृतज्ञता स्वीकार कर रहे हैं. इस परख के विकास के लिए जिम्मेदार काम एनआईएच RO1CA108846, अहा अनुदान सहायता GRNT2130014, एपी के एक वीए मेरिट पुरस्कार, द्वारा और मैरीलैंड सिगरेट क्षतिपूर्ति फंड विश्वविद्यालय (सीआरएफ) मार्लिन और स्टीवर्ट के लिए प्रदान हिस्से में वित्त पोषित किया गया था Greenebaum कैंसर केंद्र.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

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References

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जीन एक्सप्रेशन का डीएनए बातचीत, डिस्कवर transcriptional नियामकों, और उपन्यास विरोधी ट्यूमर एजेंटों की पहचान: प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए एक मात्रात्मक परख
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Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

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