Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell'espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

Abbiamo sviluppato un DNA-binding, dosaggio quantitativo basato su ELISA per misurare le interazioni tra fattori di trascrizione con il DNA. Alta specificità per la proteina RUNX2 è stato raggiunto con un consenso DNA riconoscimento oligonucleotide e anticorpo monoclonale specifico. Rilevamento colorimetrico con una reazione substrato anticorpo enzimatico accoppiato stata monitorata in tempo reale.

Abstract

Molti legano il DNA test come test di spostamento mobilità elettroforetica (EMSA), saggi chemiluminescenti, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) a base di saggi e saggi pozzetti-based sono utilizzati per misurare attività del fattore di trascrizione. Tuttavia, questi saggi sono nonquantitative, mancano di specificità, possono comportare l'uso di oligonucleotidi radiomarcati, e non possono essere adattabile per lo screening di inibitori di legame al DNA. D'altra parte, utilizzando un saggio quantitativo di legame al DNA immunoenzimatico (ELISA-D) Test, dimostriamo interazioni proteina nucleare con DNA utilizzando il fattore di trascrizione RUNX2 che dipendono specifica associazione con consenso DNA-binding sequenze presenti sulla biotina- oligonucleotidi etichettati. Preparazione delle cellule, estrazione di proteine ​​nucleari, e la progettazione di oligonucleotidi a doppio filamento sono descritti. Piastre a 96 pozzetti rivestite di avidina sono fissati con tampone alcalino e incubate con proteine ​​nucleari a nucleotide tampone di bloccaggio. Follgrazie lavaggio estensivo delle piastre, l'anticorpo primario specifico e incubazioni anticorpi secondari sono seguiti dall'aggiunta di substrato perossidasi di rafano e lo sviluppo della reazione colorimetrica. Modalità di reazione di arresto o il monitoraggio continuo cinetica sono stati utilizzati per misurare quantitativamente l'interazione delle proteine ​​con il DNA. Discutiamo adeguati controlli specificità, compreso il trattamento con i non-IgG specifiche o senza proteine ​​o anticorpo primario. Applicazioni del saggio sono descritte compresa la sua utilità in screening di farmaci e risultati positivi e negativi rappresentativi sono discussi.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-binding saggi hanno utilità nel misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame al DNA includono elettroforetici saggi mobility shift (EMSA) che dipendono da oligonucleotidi radioattivi 1 o saggi chemiluminescenza 2. Saggi cromatina immuneprecipitation (chip) basate 3 e saggi che impiegano formati da 96 pozzetti 4 sono state descritte. Tuttavia, l'EMSA è un'analisi non quantitativa che richiede l'uso di oligonucleotidi radiomarcati. Quando le proteine ​​nucleari associano con le specifiche sequenze promotrici nucleotide, complessi vincolanti sono ritardati su gel di poliacrilammide e il fattore di trascrizione specifico possono essere convalidati con un anticorpo "supershift". Abbiamo sviluppato un saggio di legame al DNA quantitativa utilizzando un formato di immunoassorbimento enzimatico (ELISA-D), che è in grado di misurare l'interazione di RUNX2 con DNA-binding sequenze corrispondenti ad elementi promotori definiti igeni bersaglio n Runx2. Uso di un anticorpo anti-RUNX2 fornisce specificità per il dosaggio e la mancanza di radiotracciante distinguere questo saggio dal tradizionale saggio di spostamento gel 5. Rilevamento di complessi di legame è possibile con l'uso di un anticorpo secondario accoppiato a perossidasi di rafano (HRP), che converte un substrato HRP, tetrametil benzidina (TMB) in un prodotto colorato per l'analisi spettrofotometrica. Il saggio qui riportato può incorporare l'uso di oligonucleotidi di DNA mutati i controlli e può essere utilizzato per il rilevamento di inibitori competitivi e non competitivi di DNA vincolanti. Lo screening di nuovi composti antitumorali è possibile anche con questo test.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Diverse fasi vengono eseguite in anticipo e diversi reagenti vengono preparate e conservate prima della procedura: (1) cultura e proteine ​​cella di isolamento, (2) preparazione di oligonucleotide, (3) Preparazione di piastre a 96 pozzetti, (4) estratto nucleare notte di incubazione. Procedura prevede due giorni a causa della notte di incubazione della proteina nucleare con oligonucleotidi di DNA.

1. Preparazione del buffer

1.1 isolamento delle proteine ​​nucleari

  1. Ipotonica Buffer: Per preparare 100 ml di tampone ipotonico, aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 150 ml (1 M MgCl 2), 333 ml (3 M KCl) a 98,3 ml H 2 O. Concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 1,5 mM MgCl 2, KCl 10 mM. Per tampone ipotonico + NP40 (per l'utilizzo in fase 2.11): Aggiungere 0,5 ml (10% NP40) per 9,5 ml di tampone ipotonico per la finale dello 0,5% NP40.
  2. Salt Buffer Bassa: Per preparare 100 ml di tampone sale basso (per l'utilizzo in fase 2.15), aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml glicerolo, 150 ml (1 M MgCl 2), 666 ml (3 M KCl), 40 ml (0,5 M EDTA) a 73 ml di H 2 O. Le concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 25% glicerolo, 1,5 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
  3. Buffer di sale: Per preparare 100 ml di tampone sale alto (per l'utilizzo in fase 2.15), aggiungere 1 ml (1 M HEPES, pH 7.9), 25 ml di glicerina, 150 ml (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 microlitri (0.5M EDTA) a 47 ml di H 2 O. Concentrazioni finali: HEPES 10 mM, 25% glicerolo, 1,5 mM MgCl 2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
  4. 10% NP40 detergente: 10 ml NP40 a 90 ml H 2 O
  5. Gli inibitori della proteasi e fosfatasi [aggiunto al buffer ipotonico + NP40 (passo 2.11), al buffer basso contenuto di sale (punto 2.15), e al buffer di sale (punto 2.15) appena prima dell'uso]: Aggiungere 2,5 microlitri (1 M DTT) e 50 microlitri di inibitori delle proteasi (100x) a 5 ml di tampone per ciascuna concentrazione finale di 0,5 mM DTT e inibitori della proteasi 1x. Il 100x magazzino miscela di inibitori della proteasi comprende:fluoruro di sodio (Ser / Thr, fosfatasi acida), orthovanadate sodio (Tyr, fosfatasi alcalina), β-glicerofosfato (fosfatasi Ser / Thr), pirofosfato di sodio (fosfatasi Ser / Thr), aprotinina (Servizi proteasi), Bestatin (amino-peptidasi ), E64 (proteasi cisteina), leupeptina (proteasi Ser / Cys), EDTA (metalloproteasi).

1.2 Preparazione delle piastre di saggio

  1. Piatto soluzione di fissaggio: Per preparare 500 ml di soluzione, aggiungere 5,25 g di carbonato di sodio per 500 ml H 2 O, mescolare bene e aggiustare il pH a 9,7 per una concentrazione finale di 0,1 M di carbonato di sodio.
  2. Piatto soluzione di blocco: Per preparare magazzino poli dI / dC oligonucleotide, risospendere 1 Unit (~ 50 mg) di poli dI / DC in 1 ml di 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 contenente 1 mM EDTA per una concentrazione di scorta di 50 mg / microlitri. Stock è diluita a 1 mg / mL prima dell'uso.

1.3 tamponi di lavaggio e diluizioni di anticorpi

NOTA: tampone di lavaggio Streptavidin è utilizzato per lavare piatti tra aggiunte e per diluire anticorpi primari e secondari.

  1. Per preparare 1 L di tampone di lavaggio Streptavidin, aggiungere 2,4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), a 1 L di acqua filtrata Millipore sterile , pH 7.18. Conservare a 4 ° C. Le concentrazioni finali: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 tampone di legame al DNA

NOTA: Questo tampone è conservato a -20 ° C.

  1. Per preparare 15 ml di DNA binding buffer, aggiungere 180 microlitri (1 M HEPES, pH 7.9), 300 ml (3 M KCl), 12 ml (0.5 M EDTA, pH 8.0), 7.5 ml (1 M DTT), 3,0 ml (60% glicerolo), 300 ml (50 mg / ml poly dI / dC) diluito con acqua deionizzata / distillata H 2 O (12 ml). Concentrazioni finali: 12 mM HEPES / pH 7.9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, DTT 0,5 mm, 12% glicerolo, 1 mg / ml poly dI / DC.

2. Coltura cellulare e isolamento proteina nucleare

t "> NOTA: La preparazione richiede circa 3 ore La stimolazione di cellule dipenderà esperimento Il numero di cellule utilizzate per ciascun esperimento varierà e tutti i volumi riflette un tipico esperimento utilizzando 3 x 10 7 cellule / punto Regolare volumi per accogliere... il numero di cellule effettivamente utilizzato nell'esperimento 6.

  1. Per preparare proteina nucleare di DNA saggi di legame, le cellule umane cultura che esprimono RUNX2 (endoteliali, osteosarcoma, le cellule del cancro al seno) nelle matrici appropriate 6.
  2. Trattare le cellule subconfluenti con nocodazole (0,2 mg / ml per 16 ore) per arrestare le cellule al confine ciclo cellulare G2 / M 6. In queste condizioni, la proteina RUNX2 viene stabilizzato e vincolante DNA massimali si ottengono. In questo modo, proteina nucleare sufficiente è disponibile per analisi multiple e inibitori possono essere confrontati dalla stessa preparazione.
  3. Per ogni passo, pre-raffreddare la centrifuga a 4 ° C e preparare buffer e chill 20 min a 4 ° C prima della raccolta delle cellule.
  4. Cellule freddo (4 ° C) e le procedure condotta su ghiaccio.
  5. Centrifugare le cellule a 1000 rpm per 5 minuti in 15 ml di polipropilene tubo tondo a fondo.
  6. Lavare 1x con PBS freddo (Ca 2 + e Mg 2 + libero).
  7. Centrifuga di nuovo e scartare PBS surnatante.
  8. Aggiungere 500 ml di tampone ipotonico senza inibitori della proteasi, facendo attenzione a risospendere completamente il pellet cellulare.
  9. Trasferire contenuto in una provetta da 1,5 ml Eppendorf.
  10. Subito centrifugare a 5.500 rpm per 5,5 min; scartare il surnatante e mantenere il pellet di cellule.
  11. Risospendere il pellet di cellule in 500 microlitri di tampone ipotonico contenente 0,5% NP40. Aggiungi proteasi e gli inibitori della fosfatasi e DTT 0.5 mM (come descritto al punto 1.1.5).
  12. Lasciare il campione a riposo in ghiaccio per 30 min.
  13. Centrifugare a 13.000 rpm per 10 min.
  14. Scartare il surnatante (contiene le proteine ​​citosoliche).
  15. Risospendere il pellet nucleare in 60 ml ciascuna di bassa saltampone t (per cui gli inibitori della proteasi e DTT 0,5 mM sono stati aggiunti dal punto 1.1.5) e tampone salina (a cui gli inibitori della proteasi e DTT 0,5 mM sono stati aggiunti dal punto 1.1.5) per un totale di 120 microlitri. Aggiungere 60 ml di tampone sale basso per il pellet e risospendere prima, quindi aggiungere 60 ml di tampone di sale. Agitare il pellet per facilitare la risospensione.

NOTA: Questo passaggio aiuta a sbarazzarsi di alcune delle proteine ​​di membrana nucleare e predisposto per la fase di lisi: basso contenuto di sale per primo (risospendere pellet, vortex), poi di sale (vortex) ottimizza questo passo. Mantenere estratto in ghiaccio per 30 min, con vortex dopo i primi 10 min.

  1. Centrifugare a 12.000 rpm per 15 min; conservare il surnatante contenente la proteina nucleare.
  2. Misurare la concentrazione di proteine ​​(cercare di mantenere i campioni a 2-5 mg / ml), aliquota in quantità adeguate (10 ml / tubo) e conservare a -80 ° C.

NOTA: rendimento stimato: 30 x 10 6 cells produrranno 5 mg / ml di proteine ​​in 120 microlitri. 5 x 10 6 cellule produrranno 2,2 mg / ml di proteine ​​in 40 microlitri.

3. Preparazione di Double Stranded oligonucleotide

  1. Progettare oligonucleotidi complementari con siti metà compatibili alle estremità. Per RUNX2 questi sono: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-biotina (senso) e 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-biotina (antisenso).

NOTA: esperimenti pilota determinato che tre siti di legame Runx2 e single-end biotina marcata hanno prodotto i risultati più riproducibili.

  1. Preparare buffer di ricottura 5x: Aggiungere 300 ml (1 M Tris-HCl, pH 7.6), 30 ml (1 M MgCl 2), 10 ml (1 M DTT) a 260 ml H 2 O (finale di 600 microlitri).
  2. Per 200 pmol di ogni olig singolo filamentoonucleotide (3 ml), aggiungere 12 ml di tampone 5x ricottura e 45 ml H 2 O per un totale di 60 microlitri (200 pmol/60 microlitri).
  3. Riscaldare a 95 ° C per 5-10 minuti su una piastra riscaldante.
  4. Raffreddare a 65 ° C lentamente (impostando la temperatura a 65 ° C, ci vogliono 15 min), poi raffreddare lentamente a temperatura ambiente spegnendo l'alimentazione del blocco riscaldante (o mettendo in 50 ml di acqua 65 ° C in un becher su ghiaccio; questo richiede 15-20 min).

4. Preparazione di piastre con 96 pozzetti

NOTA: non utilizzare proteine ​​del latte nei buffer di lavaggio.

  1. Fissare la piastra con la soluzione di fissaggio (0.1 M carbonato di sodio): aggiungere 300 microlitri / pozzetto.
  2. Incubare per 2 ore agitando a temperatura ambiente (RT), o nessuna dondolo a 4 ° C (O / N).
  3. Lavare 3x piastra con tampone di lavaggio streptavidina (WB): aggiungere 300 microlitri / bene ogni volta.
  4. Aggiungi a doppio filamento oligonucleotide marcato con biotina (3 consensus siti di legame per nucleotide) per 2 ore wesimo dondolo (1,25 nmol / e; 100 microlitri / pozzetto).
  5. Lavare 3x con freddo WB: aggiungere 300 microlitri / bene e poi invertire immediatamente la piastra in un lavandino e macchia i bordi su un tovagliolo di carta dopo ogni aggiunta.

NOTA: non utilizzare puntali delle pipette per rimuovere il liquido dalle piastre in quanto ciò potrebbe raschiare avidina: biotina: complessi di DNA dai pozzetti. Fate questo per tutte le fasi di lavaggio successive.

5. Incubazione con estratto nucleare

NOTA: Non sostituire salmone o aringa DNA di sperma per la poli tampone di bloccaggio dI / dC. Evitare di bloccare piatti con proteine ​​del latte. Entrambi questi agenti bloccanti come risultato valori di fondo alti.

  1. Incubare con fattore di trascrizione specifico elaborato da estratto nucleare (90 microlitri / pozzetto). Preparare una master mix contenente estratto nucleare (DNA binding protein; 3-9 mg / pozzetto) + poly dI / DC (1 mg / mL da un mcg / magazzino ul 50) nel DNA 1x tampone di legame. Volume è come necessario per il numero totale dipozzetti necessari (90 microlitri / pozzetto).
  2. Qualsiasi inibitore potenziale, come la vitamina D3 (figura 2) o CADD composto 5.221.975 (Figura 3), o la diluizione appropriata di controllo solvente, come etanolo, viene aggiunto in questa fase.
  3. Luogo piastra su piattaforma oscillante, O / N a 4 ° C.
  4. Lavare 3x con WB: aggiungere 300 microlitri / pozzetto

6. L'aggiunta di anticorpo primario

NOTA: diluizioni anticorpo primario deve essere preparato fresco - lo stoccaggio non è raccomandato.

  1. Diluire specifico RUNX2 anticorpo monoclonale (magazzino 1 mg / mL) 1/5, 000 in Streptavidin tampone di lavaggio. Preparare sufficiente per aggiunta a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti (90 microlitri / pozzetto) in triplicato.
  2. Incubare per 1 ora a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.
  3. Lavare 3x con WB, aggiungere 300 ml / pozzetto.

7. L'aggiunta di anticorpo secondario

NOTA: diluizioni di anticorpi secondari possono essere STOrosso a 4 ° C durante la notte se necessario il giorno successivo.

  1. Diluire F ab-specifica affinità purificato HRP-anticorpo coniugato (7,1 mg / ml di magazzino) per 1:1,400 in Streptavidin lavare buffer: buffer di 3,5 microlitri antibody/5.0 ml lavaggio. Preparare sufficiente per aggiunta a ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti (90 microlitri / pozzetto) in triplicato.
  2. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.
  3. Lavare 6x con WB invertendo piastra nel lavandino (300 microlitri / pozzetto).

8. HRP substrato e Sviluppo Prodotti

  1. Aggiungere 50 ml di substrato TMB per pozzetto direttamente dal magazzino bottiglia.
  2. Incubare 10-20 min a RT al buio (fermata metodo di reazione) o misurare l'assorbanza direttamente (monitoraggio cinetica continuo).

9. Misura di reazione

  1. Fermare metodo della reazione: Per la reazione di arresto visiva, verificare la presenza di cambiamento di colore dal chiaro al blu e smettere di reazione con 50 ml di acido solforico.
  2. Misurare l'assorbanza a 450 nm conil Biotrak II lettore di piastre visibile Spettrofotometro (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp. Piscataway NJ, USA) o uno strumento simile.
  3. Continuo metodo di monitoraggio cinetico: Aggiungere substrato dopo l'ultimo lavaggio e appena prima messa in spettrofotometro (non fermare la reazione).
  4. Misurare l'assorbanza a 635 nm con il Bio-Tek Synergy HT Multi-reazione lettore di micropiastre spettrofotometro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, USA) o uno strumento simile.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Il metodo D-ELISA è altamente specifico per la proteina legante il DNA designato finché viene utilizzato un oligonucleotide a doppio filamento sequenza-specifica, contenente tre copie del sito di legame consenso RUNX2 (ACACCA). L'anticorpo primario che riconosce la proteina che migliora anche la specificità. L'anticorpo secondario contiene covalentemente legata perossidasi di rafano (HRP) che converte un substrato trasparente (tetrametil benzidina) per un prodotto colorato per facilità di rilevamento (Figura 1). Per questi motivi, alcuni importanti controlli sfondo devono essere inclusi in ogni piastra di saggio di legame al DNA di garantire specifico. Questi includono misurando il prodotto colorimetrico dalla reazione anticorpo-HRP secondario in pozzetti contenenti o (1) nessuna proteina nucleare, (2) nessun anticorpo primario, o (3) un IgG non specifico mouse invece l'anticorpo monoclonale specifico. Nelle nostre misure di routine, i controlli non-proteina sono sottratti dalla proteina specifica unnd espresso come prodotto di reazione netto. Inoltre, quando la progettazione di farmaci assistita da computer (CADD) viene utilizzato per scoprire composti e farmaci sono testati in saggi di legame di DNA, l'effetto del solvente usato per solubilizzare i composti devono essere determinati in pozzetti separati. Tipicamente, screening di farmaci richiede l'impiego di acqua, etanolo, dimetilsolfossido o per solubilizzare composti. Ciascuno di questi solventi è testato separatamente e alle concentrazioni appropriate. Alcuni droga schermi composti che hanno scarso effetto sul legame al DNA, come mostrato per il ligando recettore della vitamina D, 1α ,25-OH vitamina D3 (Figura 2) identificati. Questo composto non ha inibito il legame al DNA anche a concentrazioni più elevate (100 nm a 100 pM). Altri droga schermi composti che inibiscono la proteina rilevate: legame al DNA (Figura 3). Sulla base delle analisi di misure cinetiche 7, aumentando la quantità di inibitore CADD5221975 portato in una curva sigmoidale inibizione dose-dipendente, wesima inibitore concentrazioni superiori a 10 -3 M inibiscono in modo efficace legame al DNA, mentre le concentrazioni inferiori a 10 -11 M ha mostrato molto poco inibizione. Il CE 50 (concentrazione alla quale inibitore causato una riduzione del 50% nel legame al DNA di RUNX2) era di 10 nM per questo composto. Le analisi statistiche per questo test sono stati pubblicati in precedenza 6 e, per semplicità, solo un pozzetto di una serie di pozzi triplice copia è mostrata nelle figure 2 e 3 rappresentativi.

Figura 1
Figura 1. Diagramma di flusso del protocollo D-ELISA. (A) Isolare le proteine ​​nucleari da cellule di mammifero. Cellule in crescita sono frazionati da detersivo lisi e metodi di sali per estrarre le proteine ​​strettamente associate al DNA. (B) Preparare double oligonucleotide filamento. Il RUNX2 sito ACACCAA obbligatorio in triplice copia è preparato con un tag biotina al 3'-end. (C) Preparare piastre da 96 pozzetti. Le piastre vengono ottenuti con rivestimento avidina, ma devono essere fissate con pH alto prima di aggiungere oligonucleotidi marcati con biotina. (D) Incubare estratti nucleari con il DNA. Le piastre vengono bloccate con poly-dI/dC non specifico prima dell'aggiunta di proteine ​​estratto nucleare. (E) Aggiungere anticorpo primario. Anticorpo è preparato fresco prima dell'incubazione con la piastra. (F) Aggiungi anticorpo secondario. Anticorpo secondario è seguito da lavaggio estensivo. (G) Aggiungere substrato HRP e sviluppare il prodotto. Prodotto colorimetrico è visibile sulla piastra. (H) Misurare l'assorbanza prodotto su uno spettrofotometro. L'assorbanza è o 450 nm (fermata reazione) o 635 nm (monitoraggio continuo). (I) Tipico lettura continuo a 635 nm. Vengono mostrati di reazione e ba specificoSFONDO (nessuna proteina) controlla in triplicato.

Figura 2
Figura 2. 1α ,25-OH vitamina D3 ha poco effetto sul DNA RUNX2 vincolante. In questo esempio rappresentativo, la vitamina D3 biologicamente attivo, 1α ,25-OH vitamina D3, ha poco effetto sulla RUNX2 legame al DNA. Altri composti vitamina D3, però, hanno effetti drammatici sul legame al DNA 6.

Figura 3
Figura 3. L'inibizione del legame da RUNX2 putativo DNA. DNA farmaco attivo In questo esempio rappresentativo, un composto che è stato identificato da un (CADD) schermo del computer-assisted drug design esibito una inibizione dose-dipendente del DNA RUNX2 vincolante da 1 nM a 100 micron. Inibizione Binding è stata calcolata usando metodi consolidati 7e prodotto un CE 50 (concentrazione di inibitore che ha provocato una inibizione del 50% di legame al DNA) di 10 nM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-binding saggi vengono utilizzati per misurare la capacità dei fattori di trascrizione per interagire con il DNA. I saggi di legame per DNA includono spostamento elettroforetico mobilità (EMSA) 1 e immuneprecipitation cromatina (ChIP) saggi basati 3 nonché saggi occupata formati da 96 pozzetti 4 come saggi chemiluminescenti 2. L'EMSA è non-quantitativa e utilizza radioattivo (32 P) oligonucleotidi. Questi sono incubati con proteine ​​nucleari e complessi vincolanti sono separati su gel di poliacrilammide o agarosio. Al contrario, il quantitativo D-ELISA è in grado di misurare l'interazione di RUNX2 con DNA-binding sequenze corrispondenti ad elementi promotori definiti in Runx2 geni bersaglio. L'uso di un anticorpo anti-RUNX2 aumentato la specificità del test e distingue questo test dal tradizionale saggio di spostamento gel 5. Mentre il D-ELISA è un test in vitro e non può rilevare occupazione promotore in cellule vive,che è possibile con saggi ChIP, può essere usata per selezionare quantitativamente per i composti che inibiscono i complessi DNA-legame. Questi saggi sono limitate all'interazione analisi DNA e non può prevedere se un promotore specifico viene attivato o repressa. Altri approcci, come saggi di promotore-reporter luciferasi, sono necessari per definire l'attività trascrizionale del fattore di trascrizione specifico.

Il protocollo generale del metodo D-ELISA qui descritto è stato adattato da un precedente metodo utilizzato per misurare attiva Nfkappa B-8. Questo protocollo D-ELISA fornisce un metodo per misurare quantitativamente proteine: DNA obbligatorio che è sequenza-specifica e non comporta l'utilizzo di radioattività. Se necessario, le velocità di reazione (V max) possono essere calcolati dal monitoraggio continuo cinetica della reazione e questo può fornire ulteriori discriminazioni di composti di prova 7.

RUNX2 e il suo cofattoreß CBF sono stati trovati per essere associati con gli oligonucleotidi marcati con biotina 6, convalidando in tal modo la specificità del test e anche sottolineare che è possibile identificare cofattori che possono associare a specifici fattori di trascrizione DNA-binding. Con il monitoraggio continuo cinetica, l'incubazione può essere estesa e proteina nucleare meno può essere necessario per rilevare i cambiamenti nel DNA vincolanti. Pertanto, il monitoraggio cinetica dovrebbe essere più sensibile rispetto ai metodi di reazione di arresto. Un'importante applicazione di tale metodo cinetico include screening per farmaci che inibiscono o attivano fattore di trascrizione vincolante 6 DNA.

Altri possibili problemi che potrebbero sorgere nell'esecuzione del test includono la presenza di elevati valori di fondo. Valori elevati di sfondo possono essere dovute a: (1) la concentrazione degli anticorpi secondari elevati, (2) il blocco insufficiente, (3) l'uso di DNA di sperma di salmone come bloccante, (4) l'assenza di una proteina bloccante o passo (5)anticorpi primari o secondari con bassa specificità. Se questi vengono rilevati, diversi rimedi sono possibili tra cui: (1) l'ottimizzazione della concentrazione di anticorpo secondario in studi pilota e con minor volume di anticorpo per pozzetto, (2) bloccando la piastra con una soluzione basica di carbonato di sodio (3) usando dI / dC come DNA non specifico, piuttosto che lo sperma di salmone, che può contenere promotori di trascrizione elementi di associazione, o (4) utilizzando diverse coppie di anticorpi primari o secondari provenienti da fonti diverse.

D'altra parte, bassa intensità potrebbe essere causata da (1) a bassa quantità di proteine ​​bersaglio, (2) le concentrazioni di anticorpi primari o secondari non sono ottimali, (3) eccitazione e / o lunghezze d'onda di emissione non sono ottimali, e ( 4) anticorpi hanno scarsa affinità per i loro substrati. Diversi rimedi a questi problemi includono: (1) Come parte della risoluzione dei problemi, si può usare 30 microlitri di buffer di sale basso + 30 microlitri di buffer di sale se minor numero di cellule sono disponibilifattore di trascrizione e il grado nucleare è presente in quantità elevate. Oppure si potrebbe utilizzare 90 microlitri di buffer di sale basso + 90 microlitri di buffer di sale basso se più celle sono disponibili. Altre cellule sono utili quando l'espressione del fattore specifico da testare è basso. (2) Ottimizzare la concentrazione di anticorpo primario per aumentare il segnale. (3) Monitorare i filtri sullo strumento per assicurarsi che essi siano impostati per una corretta eccitazione e di massimi di emissione per il substrato TMB; fluorescenti alternativi o substrati chemiluminescenti possono anche essere utilizzati. (4) Se l'anticorpo primario è di bassa affinità, aumentare il tempo di incubazione sulla piastra.

In termini di scoperta di farmaci, il RUNX2 DNA-binding ELISA attuale è stata utilizzata per rilevare migliorato legame di una proteina al suo bersaglio DNA e composti naturali identificati (come la vitamina D3) che sono modulatori selettivi di legame al DNA. Alcuni di questi composti presentano meccanismi non competitiva di azione e di alterare la funzione biologica coerente conun paradigma di inibizione interfacciale 9. Con la recente risoluzione del sequenziamento del DNA genomico, ulteriori applicazioni potrebbero includere la scoperta di nuove proteine ​​che interagiscono con i non-codificanti ("spazzatura") del DNA, che regola l'espressione di regioni codificanti 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Non abbiamo nulla da rivelare.

Acknowledgments

L'assistenza tecnica e la strumentazione della University of Maryland Greenebaum Cancer Center traslazionale Nucleo Fondo, in particolare Drs. Rena Lapidus e Mariola Sadowska, sono riconosciuti con gratitudine. Il lavoro di responsabile per lo sviluppo di questo test è stato finanziato in parte dal NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, un VA Merit Award per AP, e l'Università del Maryland sigaretta restituzione Funds (CRF) fornita al Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
  3. Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
  4. Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
  5. D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
  6. Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
  7. Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
  8. Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
  9. Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
  10. Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
Un quantitativo test per studiare proteine: DNA interazioni, Discover trascrizionali regolatori dell'espressione genica, e identificare nuovi agenti anti-tumorali
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter