Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En kvantitativ analyse for å studere Protein: DNA interaksjoner, Discover Transcriptional regulatorer Gene Expression, og identifisere nye anti-tumor Agenter

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

Vi har utviklet en kvantitativ DNA-bindende ELISA-basert assay for å måle transkripsjonsfaktor interaksjon med DNA. Høy spesifisitet for RUNX2 protein ble oppnådd med en konsensus-DNA-gjenkjenning oligonukleotid og spesifikt monoklonalt antistoff. Kolorimetrisk deteksjon med en enzym-koblet antistoff substrat reaksjonen ble overvåket i sann tid.

Abstract

Mange DNA-binding assays slik som elektroforetisk mobilitet shift assay (EMSA), kjemiluminescerende assay, kromatin immunoutfelling (chip)-baserte analyser, og multibrønn-baserte assays blir brukt til å måle transkripsjonsfaktor-aktivitet. Men disse analysene er nonquantitative, mangler spesifisitet, kan innebære bruk av radioaktivt merkede oligonukleotider, og er kanskje ikke kunne tilpasses for screening av inhibitorer av DNA-binding. På den annen side, ved hjelp av en kvantitativ DNA-bindende enzyme-linked immunosorbent assay (D-ELISA)-analyse, demonstrerer vi atom protein interaksjoner med DNA ved hjelp av RUNX2 transkripsjonsfaktor som er avhengig av spesifikk assosiasjon med konsensus-DNA-bindende sekvenser som er tilstede på biotin- merket oligonukleotider. Fremstilling av celler, utvinning av kjerneprotein, og utformingen av dobbelt-trådet oligonukleotider er beskrevet. Avidin-belagte 96-brønners plater er festet med alkalisk buffer og inkubert med nukleære proteiner i nukleotid-blokkerende buffer. Føllpå grunn av omfattende vasking av platene, spesifikk primære antistoff og sekundære antistoff inkubasjoner blir etterfulgt av tilsetning av pepperrot-peroksydase-substrat og utvikling av kolorimetrisk reaksjon. Stopp reaksjonen modus eller kontinuerlig kinetisk overvåkning ble brukt til kvantitativt å måle protein interaksjon med DNA. Vi diskuterer passende spesifisitet kontroller, inkludert behandling med ikke-spesifikk IgG-eller uten protein eller primære antistoff. Anvendelser av analysen er beskrevet blant annet sin nytte i medikamentscreening og representative positive og negative resultater er omtalt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-binding assays kan anvendes for å måle evnen av transkripsjonsfaktorene til å interagere med DNA. Analyser for DNA bindende omfatter elektromobilitet skift analyser (EMSA) som er avhengige av radiomerket oligonukleotider en eller chemiluminescence analyser to. Kromatin immuneprecipitation (chip) baserte analyser 3 samt analyser sysselsetter 96-brønners formater 4 har også blitt beskrevet. Imidlertid er EMSA en ikke-kvantitativ analyse som krever bruk av radioaktivt merkede oligonukleotider. Når kjerneproteiner forbinder med den spesielle nukleotid-promotorsekvensene, bindende komplekser er retardert på polyakrylamidgeler og den spesifikke transkripsjonsfaktor kan bekreftes med et antistoff "supershift". Vi har utviklet en kvantitativ DNA-bindingsanalyse ved bruk av en enzym-bundet immunosorbent-format (D-ELISA), som er i stand til å måle interaksjonen av RUNX2 med DNA-bindende sekvenser som tilsvarer definerte promotorelementer in RUNX2 målgener. Anvendelse av et anti-antistoff RUNX2 gir spesifisitet til analysen og mangel på radiomerket substans skille denne analysen fra den tradisjonelle gel shift assay 5. Påvisning av bindingskomplekser er mulig med bruk av et sekundært antistoff koplet til pepperrotperoksidase (HRP), som omdanner et HRP-substrat, tetrametylbenzidin (TMB) til et farget produkt for spektrofotometrisk analyse. Analysen rapportert her, kan omfatte bruk av muterte DNA-oligonukleotider som kontroller, og kan brukes for deteksjon av konkurrerende eller ikke-konkurrerende hemmere av DNA-binding. Den screening av nye anti-tumorforbindelser er også mulig med denne analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Flere trinn utføres på forhånd, og flere reagenser blir fremstilt og lagret forut for fremgangsmåten: (1) cellekultur og protein isolert, (2) fremstilling av oligonukleotid, (3) Fremstilling av 96-brønners plater (4) kjerneekstrakt inkubasjon over natten. Prosedyren krever to dager på grunn av den over natten inkubasjon av kjerneprotein med DNA-oligonukleotider.

En. Utarbeidelse av buffere

1,1 Nuclear protein isolasjon

  1. Hypotonic Buffer: For å forberede 100 ml av hypoton buffer, tilsett 1 ml (1 M Hepes, pH 7,9), 150 mL (1 M MgCl 2), 333 mL (3 M KCl) til 98,3 ml H 2 O. Sluttkonsentrasjoner: 10 mM HEPES, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl. For hypoton buffer + NP40 (for bruk i trinn 2.11): Tilsett 0,5 ml (10% NP40) til 9,5 ml hypoton buffer for avsluttende 0,5% NP40.
  2. Lav saltbuffer: For å fremstille 100 ml av lav saltbuffer (for bruk i trinn 2.15), tilsett 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml Glyserol, 150 mL (1 M MgCl 2), 666 mL (3 M KCl), 40 mL (0,5 M EDTA) til 73 ml H 2 O. Endelige konsentrasjoner: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl 2, 20 mM KCl, 0.2 mM EDTA.
  3. Høy saltbuffer: For å fremstille 100 ml av høy saltbuffer (for bruk i trinn 2.15), tilsett 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml glyserol, 150 pl (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 pl (0,5 M EDTA) til 47 ml H2O Endelige konsentrasjoner: 10 mM HEPES, 25% glycerol, 1,5 mM MgCl2, 800 mM KCl, 0,2 mM EDTA.
  4. 10% NP40 Oppvaskmiddel: 10 ml NP40 til 90 ml H 2 O
  5. Protease og fosfatase-hemmere [innført i hypotonisk buffer + NP40 (trinn 2.11), til lav saltbuffer (trinn 2.15), og til høy saltbuffer (trinn 2.15) like før bruk]: til 2,5 pl (1 M DTT), og 50 mL av protease-inhibitorer (100x) i 5 ml av hver buffer til endelig konsentrasjon på 0,5 mM DTT og 1x proteasehemmere. Proteasehemmeren 100x lager blandingen inneholder:natriumfluorid (Ser / Thr, sure fosfataser), natrium orthovanadate (Tyr, alkaliske fosfataser), β-glycerophosphate (Ser / Thr fosfataser), sodium pyrofosfat (Ser / Thr fosfataser), aprotinin (Tjen proteaser), Bestatin (amino-peptidases ), E64 (cysteinproteaser), leupeptin (Ser / Cys proteaser), EDTA (metalloproteaser).

1.2 Utarbeidelse av analyse plater

  1. Plate fikseringsoppløsning: For å fremstille 500 ml av løsningen, tilsett 5,25 g natrium-karbonat i 500 ml H2O, bland godt og juster pH til 9,7 til en sluttkonsentrasjon på 0,1 M natrium-karbonat.
  2. Plate blokkerende løsning: For å fremstille lager poly dI / dC oligonukleotid, resuspender en enhet (~ 50 mg) av poly dI / dC i 1 ml 10 mM Tris / HCl, pH 7,9 inneholdende 1 mM EDTA i en lager-konsentrasjon på 50 pg / mL. Stock er fortynnet til 1 mikrogram / mL før bruk.

1.3 Vask buffere og antistoff fortynninger

MERK: Streptavidin vaskebuffer er brukes til å vaske platene i mellom tilsetningene, og for å fortynne primære og sekundære antistoffer.

  1. For å fremstille 1 liter av Streptavidin vaskebuffer, tilsett 2,4 g Tris / HCl, 37,5 ml (4 M NaCl), 10 ml (10% BSA), 5 ml (10% Tween-20), til 1-L Millipore-sterilt filtrert vann , pH 7.18. Oppbevar ved 4 ° C. Endelige konsentrasjoner: 20 mM Tris / HCl, 150 mM NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 DNA-bindingsbuffer

MERK: Denne bufferen er lagret ved -20 ° C.

  1. For å fremstille 15 ml av DNA-bindingsbuffer, tilsett 180 ul (1 M HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 pl (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 pl (1 M DTT), 3,0 ml (60% glyserol), 300 mL (50 mikrogram / ​​mL poly dI / DC) fortynnes med avionisert / destillert H 2 O (12 ml). Endelige konsentrasjoner: 12 mMHEPES / pH 7,9, 60 mM KCl, 0,4 mM EDTA, 0,5 mM DTT, 12% glyserol, 1 mikrogram / mL poly dI / DC.

2. Cell Culture and Nuclear Protein Isolation

t "> NB: Preparatet krever omtrent tre timer Stimulering av celler vil være avhengig av forsøket Antall celler som brukes for hvert forsøk vil variere og alle volumer reflektere en typisk forsøk ved anvendelse av 3 x 10 7 celler / punkt Juster volum til å romme... celle nummer faktisk brukt i forsøket seks.

  1. For å forberede atom protein for DNA bindingsanalyser, kultur menneskelige celler som uttrykker RUNX2 (endothelial, osteosarkom, brystkreft celler) i egnede medier seks.
  2. Unn subconfluent celler med nocodazole (0,2 ug / ml i 16 timer) for å stanse celler i G2 / M cellesyklus grense 6.. Under disse forhold, er RUNX2 proteinet stabilisert og maksimal DNA binding oppnås. På denne måten er tilstrekkelig kjerneprotein tilgjengelig for flere analyser og inhibitorer kan sammenlignes fra det samme preparat.
  3. For hvert trinn, pre-avkjølt sentrifuge til 4 ° C og klar buffere og chill 20 min ved 4 ° C før celle innhøsting.
  4. Chill celler (4 ° C) og gjennomføre prosedyrer på isen.
  5. Sentrifuger cellene ved 1000 rpm i 5 min i et 15 ml polypropylen rundbunnet rør.
  6. Vask 1x med iskald PBS (Ca 2 + og Mg 2 + gratis).
  7. Sentrifuger igjen og kast PBS supernatant.
  8. Legg 500 mL av hypoton buffer uten proteasehemmere, er forsiktig med å fullstendig cellepelleten suspenderes.
  9. Overfør innholdet til et 1,5 ml Eppendorf-rør.
  10. Umiddelbart sentrifuger ved 5500 rpm for 5,5 min, kast supernatanten og holde cellen pellet.
  11. Resuspender cellepelleten i 500 ul av hypotonisk buffer inneholdende 0,5% NP40. Legg protease og fosfatase-inhibitorer og 0,5 mM DTT (som beskrevet i trinn 1.1.5).
  12. Tillat prøven å hvile på is i 30 min.
  13. Sentrifuger ved 13.000 rpm i 10 min.
  14. Kast supernatanten (inneholder cytosoliske proteiner).
  15. Suspender atom pellet i 60 mL hver av lav salt-buffer (som protease inhibitorer og 0,5 mM DTT har blitt lagt fra trinn 1.1.5) og høy saltbuffer (som protease inhibitorer og 0,5 mM DTT har blitt lagt fra trinn 1.1.5) for en total på 120 pl. Legg 60 mL av lav salt buffer til pellets først og resuspender, deretter legge 60 mL av høy salt buffer. Vortex pellet for å hjelpe til med resuspendering.

MERK: Dette trinnet hjelper kvitte seg med noen av de kjernefysiske membran proteiner og satt opp for lysis trinn: lav salt først (resuspender pellet, vortex), deretter høy salt (vortex) optimaliserer dette trinnet. Holde-ekstrakt på is i 30 min, med virvling etter den første 10 min.

  1. Sentrifuger ved 12.000 rpm i 15 min, hold supernatanten inneholdende kjernefysiske protein.
  2. Mål proteinkonsentrasjon (forsøk for å holde prøvene ved 2-5 mg / ml), alikvoter i passende mengder (10 pl / rør) og oppbevares ved -80 ° C.

MERK: Forventet avkastning: 30 x 10 6 cells vil gi 5 mikrogram / mL protein i 120 mL. 5 x 10 6-celler vil gi 2,2 mikrogram / ​​mikroliter protein i 40 pl.

Tre. Fremstilling av dobbeltkjedet oligonukleotid

  1. Design utfyllende oligonukleotider med kompatible halvsider på endene. For RUNX2 disse er: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-Biotin (fornuft) og 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3'-Biotin (antisense).

MERK: Pilot eksperimenter bestemt at tre RUNX2 bindingsseter og single-end merket biotin gitt de mest reproduserbare resultater.

  1. Forbered 5x annealing buffer: Legg 300 mL (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 mL (1 M MgCl 2), 10 mL (1 M DTT) til 260 mL H 2 O (siste 600 mL).
  2. Til 200 pmol av hver enkelt-trådet oligonucleotide (3 mL), tilsett 12 mL av 5x annealing buffer og 45 mL H 2 O for totalt 60 mL (200 pmol/60 mL).
  3. Oppvarm til 95 ° C i 5-10 min i en varmeblokk.
  4. Avkjøl til 65 ° C langsomt (ved å sette temperaturen til 65 ° C, tar det 15 minutter), deretter avkjøles til romtemperatur, ved å slå av strømmen til varmeblokken (eller ved å plassere i 50 ml av 65 ° C vann i et begerglass på is, og dette tar 15-20 min).

4. Fremstilling av 96-brønners plater

MERK: Ikke bruk melkeproteiner i vaskebuffere.

  1. Fiks plate med feste oppløsning (0,1 M natrium-karbonat): Tilsett 300 ul / brønn.
  2. Inkuber i 2 timer ved gynging ved romtemperatur (RT), eller ingen vuggende ved 4 ° C (O / N).
  3. Vask plate 3x med streptavidin vaskebuffer (WB): legg til 300 mL / godt hver gang.
  4. Legg biotin-merket dobbelttrådet oligonukleotid (3 konsensus-bindingsseter pr nukleotid) i 2 timer with rocking (1,25 nmol / brønn, 100 mL / brønn).
  5. Vask 3x med kaldt WB: legg 300 mL / brønn og deretter umiddelbart snus platen i en vask og tørk kantene på et papirhåndkle etter hvert tillegg.

MERK: Ikke bruk pipetter for å fjerne væske fra platene da dette kan skrape avidin: biotin: DNA komplekser fra brønnene. Gjør dette for alle etterfølgende vasketrinn.

5. Inkubasjon med Nuclear Extract

MERK: Ikke erstatt laks eller sild sperm DNA for poly dI / DC blokkering buffer. Unngå å tette plater med melkeproteiner. Begge disse blokkerende midler fører til høye bakgrunnsverdier.

  1. Inkuber med spesifikk transkripsjonsfaktor fremstilt fra kjerneekstrakt (90 ul / brønn). Forbered en master mix inneholder atom ekstrakt (DNA bindende protein, 3-9 mikrogram / brønn) + poly dI / DC (1 mikrogram / mL fra en 50 mikrogram / ul lager) i 1x DNA bindingsbuffer. Volumet som er nødvendig for den totale antalletbrønner som kreves (90 mL / brønn).
  2. Enhver potensiell inhibitor, slik som vitamin D3 (figur 2) eller CADD forbindelse 5221975 (figur 3), eller den passende fortynning av det løsningsmiddel-kontroll, slik som etanol, tilsettes ved dette trinnet.
  3. Sett platen på vippeplattformen, O / N ved 4 ° C.
  4. Vask 3x med WB: legg 300 mL / brønn

6. Tilsetting av Primary Antibody

MERK: Primær antistoff fortynninger bør være forberedt frisk - lagring er ikke anbefalt.

  1. Fortynn RUNX2-spesifikt monoklonalt antistoff (stock 1 ug / mL) 1/5 000 i Streptavidin vaskebuffer. Forbered nok for tilsetning til hver brønn av 96-brønns plate (90 ul / brønn) i triplikat.
  2. Inkuber i 1 time ved romtemperatur på en gyngende plattform.
  3. Vask 3x med WB, tilsett 300 mL / brønn.

7. Tilsetting av sekundært antistoff

MERK: Sekundære antistoff fortynninger kan være STOrødt ved 4 ° C over natten om nødvendig neste dag.

  1. Fortynn F ab-spesifikk affinitetsrenset-HRP konjugert antistoff (7,1 mg / ml stock) til 1:1,400 i Streptavidin vaske-buffer: 3,5 ul antibody/5.0 ml vaskebuffer. Forbered nok for tilsetning til hver brønn av 96-brønns plate (90 ul / brønn) i triplikat.
  2. Inkuber i 30 minutter ved RT på en risteplattform.
  3. Vask 6x med WB ved å snu platen i vasken (300 mL / brønn).

8. HRP Underlag og produktutvikling

  1. Tilsett 50 pl av TMB substrat per brønn direkte fra lagerflaske.
  2. Inkuber 10-20 min ved RT i mørket (stoppe reaksjon metode) eller måle absorbans direkte (kontinuerlig kinetic overvåking).

9. Reaksjon Måling

  1. Stopp reaksjonen metoden: For visuell stopp reaksjon, sjekk for fargeendring fra klar til blå og stoppe reaksjon med 50 mL svovelsyre.
  2. Mål absorbansen ved 450 nm medden Biotrak II Synlig plateleser spektrofotometer (Amersham Biosciences, GE Healthcare biovitenskap Corp Piscataway NJ, USA) eller et lignende instrument.
  3. Kontinuerlig overvåking av kinetisk metode: til substratet etter siste vask, og like før den settes inn i spektrofotometeret (ikke stoppe reaksjonen).
  4. Mål absorbans ved 635 nm med Bio-Tek Synergy HT Multi-reaksjon mikroplateleser spektrofotometer (Bio-Tek Instruments, Inc, Winooski, VT, USA) eller et lignende instrument.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den D-ELISA-metoden er meget spesifikt for det angitte DNA-bindende protein så lenge som en sekvens-spesifikke, dobbeltkjedet oligonukleotid som inneholder tre kopier av konsensus RUNX2 bindingssete (ACACCA) er brukt. Det primære antistoff gjenkjenner proteinfaktoren øker også spesifisitet. Det sekundære antistoff inneholder kovalent koblet pepperrot-peroksydase (HRP) som konverterer en klar substrat (tetrametylbenzidin) til et farget produkt for enkel deteksjon (figur 1). Av disse grunner, flere viktige bakgrunnskontroller trenger å være inkludert i hver analyse plate for å sikre spesifikk DNA-binding. Disse inkluderer måling av den kolorimetriske produktet fra det sekundære antistoff-HRP-reaksjon i brønner inneholdende enten (1) uten kjerneprotein, (2) ingen primær antistoff, eller (3) et ikke-spesifikt muse-IgG i stedet for den spesifikke monoklonale antistoff. I våre rutinemålinger, blir no-protein kontroller subtraheres fra den spesifikke protein ennd uttrykt som net reaksjonsprodukt. Videre, når datamaskinassistert drug design (CADD) brukes til å oppdage forbindelser og medikamenter testes i DNA-bindingsanalyser, er effekten av det anvendte løsningsmiddel for å oppløse forbindelsene må bestemmes i separate brønner. Vanligvis vil medikamentscreening krever bruk av vann, etanol eller dimetyl-sulfoksyd for å oppløse forbindelser. Hver av disse løsningsmidler er testet hver for seg, og ved de riktige konsentrasjoner. Noen narkotika-skjermer identifisert forbindelser som har liten effekt på DNA-binding, slik det er vist for vitamin D reseptor ligand, 1α ,25-OH-vitamin D3 (figur 2). Denne forbindelse har ikke inhiberer DNA-binding, selv ved høye konsentrasjoner (100 nM til 100 uM). Andre narkotika-skjermer oppdaget forbindelser som inhiberer protein: DNA-binding (figur 3). Basert på analyser av kinetiske målinger 7, økende mengder av den CADD5221975 inhibitor resulterte i en doseavhengig, sigmoidal hemming kurve, with inhibitor konsentrasjoner over 10 -3 M effektivt hemme DNA-binding, mens konsentrasjoner under 10 -11 M viste svært lite hemming. EC 50 (konsentrasjon ved hvilken inhibitor forårsaket en 50% reduksjon av bindingen av RUNX2 til DNA) var 10 nM for forbindelsen. De statistiske analyser for denne analysen er blitt publisert tidligere 6 og, for enkelhets skyld er bare én brønn av en triplikat serie av brønner er vist på representative figurene 2 og 3.

Figur 1
Figur 1. Flytskjema for den D-ELISA-protokollen. (A) Isoler nukleære proteiner fra pattedyrceller. Voksende celler blir fraksjonert ved vaskemiddel lyse og høye salt metoder for å trekke ut proteiner tett forbundet med DNA. (B) Forbered double oligonukleotid. Den RUNX2 bindingssete ACACCAA i triplikat ble fremstilt med en biotin-koden på 3'-enden. (C) Klargjøre 96-brønners plater. Platene er oppnådd med avidin belegg, men må festes med høy pH før tilsetning biotin-merkede oligonukleotider. (D) Inkuber nukleære ekstrakter med DNA. Platene blokkeres med uspesifikk poly-dI/dC før tilsetning av kjerneekstraktproteiner. (E) til primære antistoff. Antistoff blir fremstilt friskt før inkubasjon med plate. (F) til sekundært antistoff. Sekundært antistoff er etterfulgt av omfattende vasking. (G) til HRP-substrat og utvikler produktet. Colorimetric produktet er synlig på platen. (H) Mål absorbansen på et spektrofotometer produkt. Absorbans er enten 450 nm (stoppe reaksjon) eller 635 nm (kontinuerlig overvåking). (I) Typisk kontinuerlig avlesning ved 635 nm. Vist er bestemt reaksjon og baBAKGRUNN (uten protein) styrer i triplikat.

Fig. 2
Figur 2. 1α ,25-OH-vitamin D3 har liten effekt på RUNX2 DNA-binding. På denne representativt eksempel, den biologisk aktive vitamin D3, 1α ,25-OH-vitamin D3, har liten effekt på RUNX2 DNA-binding. Andre vitamin D3 forbindelser, men har dramatiske effekter på DNA bindende seks.

Figur 3
Figur 3. Inhibering av DNA-binding med putative RUNX2:. DNA aktivt legemiddel I dette representativt eksempel, en forbindelse som ble identifisert fra en datamaskin-assistert drug design (CADD) skjerm oppviste en doseavhengig inhibering av RUNX2 DNA-binding fra 1 nM til 100 uM. Binding hemming ble beregnet ved hjelp av etablerte metoder 7og ga en EC50 (konsentrasjonen av inhibitor som resulterte i en 50% inhibering av DNA-binding) på 10 nM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

DNA-bindingsanalysene er brukt til å måle evnen av transkripsjonsfaktorene til å interagere med DNA. Analyser for DNA bindende omfatter elektromobilitet shift (EMSA) 1 og kromatin immuneprecipitation (chip) baserte analyser 3 samt analyser sysselsetter 96-brønners formater fire som kjemiluminescente analyser to. EMSA er ikke-kvantitative og bruker radiomerket (32 P) oligonukleotider. Disse inkuberes med kjerneproteiner og binde komplekser separeres på agarose-eller polyakrylamidgeler. I motsetning til dette er den kvantitative D-ELISA i stand til å måle interaksjonen av RUNX2 med DNA-bindende sekvenser som tilsvarer definerte promotorelementer i RUNX2 målgener. Bruken av et anti-antistoff RUNX2 økt spesifisitet av analysen og skiller denne analysen fra den tradisjonelle gel shift assay 5. Mens D-ELISA er en in vitro-analyse, og kan ikke kartlegge promoter belegget i levende celler,noe som er mulig med chip-assays, kan den brukes til å kvantitativt screene for forbindelser som hemmer DNA-bindende komplekser. Disse analysene er begrenset til DNA interaksjon analyser og kan ikke forutsi hvorvidt en spesifikk promoter er aktivert eller fortrengt. Flere tilnærminger, for eksempel promoter-luciferase reporter-analyser, er det nødvendig å definere den transkripsjonelle aktivitet av den spesifikke transkripsjonsfaktor.

Den generelle protokoll for D-ELISA-metoden som beskrives her er tilpasset fra en tidligere metode som brukes for å måle aktiv Nfkappa-B 8. Denne D-ELISA-protokollen tilveiebringer en fremgangsmåte for kvantitativt å måle protein: DNA-binding som er sekvensspesifikke og ikke innebærer anvendelse av radioaktivitet. Om nødvendig kan reaksjonshastigheter (V max) også beregnes fra kontinuerlig kinetisk kontroll av reaksjonen og dette kan gi ytterligere diskriminering av testforbindelsene 7.

RUNX2 og dens kofaktorCBF ß ble funnet å være assosiert med den biotin-merkede oligonukleotider 6, således validere spesifisiteten av analysen og også å understreke at det er mulig å identifisere kofaktorer som kan knytte til spesifikke DNA-bindende transkripsjonsfaktorer. Med kontinuerlig kinetisk overvåkning, inkubering forlenges og mindre atom proteinet kan være nødvendig for å detektere endringer i DNA-binding. Derfor er kinetisk overvåkning forventet å være mer følsom enn stoppreaksjonsmetoder. En viktig anvendelse av denne kinetiske metoden inkluderer screening av stoffer som inhiberer eller aktiverer transkripsjonsfaktor DNA-binding 6..

Andre mulige problemer som kan oppstå i gjennomføringen av analysen inkluderer tilstedeværelsen av høye bakgrunnsverdier. Høy bakgrunnsverdier kan skyldes: (1) høye sekundære antistoffkonsentrasjoner, (2) ikke tilstrekkelig sperring, (3) bruk av laksesperm DNA som blokker, (4) fravær av et blokkerende protein trinn eller (5)primære eller sekundære antistoffer med lav spesifisitet. Hvis disse er oppstått, flere løsninger er mulige, inkludert: (1) å optimalisere konsentrasjonen av sekundært antistoff i pilotstudier og ved hjelp av lavere volum av antistoff per brønn, (2) blokkering av plate med en grunnleggende natriumkarbonat-løsning (3) med dI / dC som ikke-spesifikk DNA i stedet for laksesperm, som kan inneholde promotorer med transkripsjons bindende elementer, eller (4) under anvendelse av forskjellige par av primære eller sekundære antistoffer fra forskjellige kilder.

På den annen side kan lav signalstyrke være forårsaket av (1) lav mengde target protein, (2) konsentrasjonen av primære eller sekundære antistoffer som ikke er optimale, (3) eksitasjons-og / eller emisjonsbølgelengdene ikke er optimale, og ( 4) antistoffer har dårlig affinitet for sine underlag. Flere løsninger på disse problemene omfatter: (1) Som en del av feilsøking, kan man bruke 30 mL lav salt buffer + 30 mL høy salt buffer hvis færre celler er nyttestand og atomtranskripsjonsfaktor er til stede i store mengder. Eller man kan bruke 90 pl lav saltbuffer + 90 pl lav saltbuffer hvis flere celler er tilgjengelige. Andre celler er nyttige ved ekspresjon av den spesifikke faktor som skal testes er lav. (2) optimalisere konsentrasjonen av primære antistoff for å øke signal. (3) Monitor filtrene på instrumentet for å sørge for at de er satt til riktig eksitasjon og emisjon maxima for TMB substrat; alternativ fluorescerende eller kjemiluminescente substrater kan også brukes. (4) Dersom det primære antistoff er av lav affinitet, øke tiden for inkubasjon på plate.

I form av medisiner, har den nåværende RUNX2 DNA-bindende ELISA blitt brukt til å påvise forbedret binding av et protein til dets DNA-mål og som er identifisert naturlige forbindelser (slik som vitamin D3) som er selektive modulatorer av DNA-binding. Enkelte av disse forbindelser utviser ikke-konkurrerende virkningsmekanismer og endre biologisk funksjon i samsvar meden grense hemming paradigme ni. Med den nylige vedtak av genomisk DNA-sekvensering, kan ytterligere bruksområder er oppdagelsen av nye proteiner i samspill med ikke-kodende ("junk") DNA, som regulerer uttrykket av koding regioner 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Den teknisk assistanse og instrumentering ved University of Maryland Greenebaum Cancer Center Translasjonell Kjerne Facility, spesielt legene. Rena Lapidus og Mariola Sadowska, er takknemlig erkjent. Arbeidet er ansvarlig for utviklingen av denne analysen ble finansiert delvis av NIH RO1CA108846, AHA Grant-i-Aid GRNT2130014, en VA Merit Award til AP, og ved University of Maryland Sigarett Restitusjons Funds (CRF) gitt til Marlene & Stewart Greenebaum Cancer Center.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
  3. Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
  4. Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
  5. D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
  6. Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
  7. Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
  8. Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
  9. Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
  10. Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
En kvantitativ analyse for å studere Protein: DNA interaksjoner, Discover Transcriptional regulatorer Gene Expression, og identifisere nye anti-tumor Agenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter