Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Количественный Анализ по изучению белок: ДНК взаимодействий, Discover транскрипционных регуляторов экспрессии генов, и идентифицировать новые противоопухолевых средств

doi: 10.3791/50512 Published: August 31, 2013

Summary

Мы разработали количественный ДНК-связывающий, ИФА на основе анализа для измерения фактора транскрипции взаимодействия с ДНК. Высокая специфичность для белка Runx2 была достигнута с консенсусной олигонуклеотида ДНК-распознавания и специфического моноклонального антитела. Колориметрические обнаружения с реакции с субстратом антитела с ферментом в сочетании контролировали в реальном времени.

Abstract

Многие ДНК-связывающие анализы, такие как электрофоретическая сдвига мобильность анализов (EMSA), хемилюминесцентных анализов, иммунопреципитации хроматина (чип) основе анализов и многолуночных основе анализов используются для измерения активность фактора транскрипции. Тем не менее, эти анализы неколичественные, отсутствие специфичности, может включать в себя использование меченных олигонуклеотидов, и не могут быть адаптированы для скрининга ингибиторов связывания ДНК. С другой стороны, с помощью количественного ДНК-связывающий иммуноферментного анализа (D-ELISA) анализа, мы демонстрируем ядерных белковых взаимодействий с ДНК, используя Runx2 транскрипционный фактор, что зависит от конкретной ассоциации с консенсус-ДНК-связывающих последовательностей, присутствующих на биотин- меченных олигонуклеотидов. Подготовка клеток, добыча ядерного белка, и дизайн двухцепочечных олигонуклеотидов описаны. Покрытые авидином 96-луночные планшеты с фиксированной щелочного буфера и инкубируют с ядерными белками в нуклеотидной блокирующем буфере. Фоллявследствие интенсивного промывания пластин, конкретной первичного антитела и вторичного антитела инкубации следуют добавлением субстрата пероксидазы хрена и развития колориметрической реакции. Режим реакция Стоп или непрерывный кинетическая мониторинга были использованы для количественного измерения взаимодействия белка с ДНК. Мы обсуждаем соответствующие элементы управления специфичности, в том числе лечения неспецифического IgG или без белка или первичного антитела. Применение анализа описаны в том числе его полезности в скрининге лекарственных и представительные положительные и отрицательные результаты обсуждаются.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ДНК-связывающий анализы могут быть использованы при измерения способности факторов транскрипции, чтобы взаимодействовать с ДНК. Анализы на ДНК связывающие включают анализы электрофоретических сдвига подвижности (EMSA), которые зависят от меченных олигонуклеотидов 1 или хемилюминесценции анализов 2. Хроматина immuneprecipitation (чип) на основе анализов 3, а также анализы, использующие форматы 96-луночных 4 также были описаны. Тем не менее, EMSA не является количественный анализ, что требует использования радиоактивно меченных олигонуклеотидов. Когда ядерные белки ассоциируют с конкретными последовательностей нуклеотидов промоутер, связывающие комплексы отсталых на полиакриламидном геле и специфическим фактором транскрипции может быть подтверждено с антителом "supershift". Мы разработали количественный ДНК-анализа связывания с использованием твердофазного иммуноферментного формат (D-ELISA), который способен измерять взаимодействие RUNX2 с ДНК-связывающих последовательностей, соответствующих определенных промоторных элементов ян Runx2 генов-мишеней. Использование анти-антителом Runx2 обеспечивает специфичность анализа и отсутствие радиоактивной метки отличить этот анализ от традиционного анализа гель сдвига 5. Обнаружение связывания комплексов можно с использованием вторичного антитела, соединенного с пероксидазой хрена (HRP), который преобразует в HRP субстрат, тетраметилбензидин (ТМВ) в окрашенный продукт для спектрофотометрического анализа. Анализ сообщалось здесь, могут включать использование мутантных ДНК-олигонуклеотидов в качестве контроля и может быть использован для обнаружения конкурентных или неконкурентные ингибиторы ДНК-связывающий. Скрининг новых соединений противоопухолевых также возможно с этим анализом.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Несколько этапы выполняются раньше времени и несколько реактивы получают и хранят до процедуры: (1) выделение культуры и белок клетки, (2) Получение олигонуклеотида (3) Получение 96-луночных планшетах, (4) ядерный экстракт Инкубационный ночь. Процедура требует 2 дня из-за инкубации в течение ночи ядерного белка с ДНК-олигонуклеотидов.

1. Подготовка буферов

1.1 изоляции ядерных белков

  1. Гипотонического буфера: Для приготовления 100 мл гипотонического буфера, добавить 1 мл (1 М HEPES, рН 7,9), 150 мкл (1 М MgCl 2), 333 мкл (3 М KCl) до 98,3 мл H 2 O. Конечные концентрации: 10 мм HEPES, 1,5 мМ MgCl 2, 10 мМ KCl. Для Гипотоническая буфера + NP40 (для использования на стадии 2,11): Добавить 0,5 мл (10% NP40) до 9,5 мл гипотонического буфера для окончательного 0,5% NP40.
  2. Низкая Соль буфера: Для приготовления 100 мл низкосолевого буфера (для использования на стадии 2.15), добавить 1 мл (1 М HEPES, рН 7,9), 25 мл Глицерин, 150 мкл (1 М MgCl 2), 666 мкл (3 М KCl), 40 мкл (0,5 М ЭДТА) до 73 мл H 2 O. Конечные концентрации: 10 мМ HEPES, 25% глицерина, 1,5 мМ MgCl 2, 20 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА.
  3. Высокая Солт буфера: Для приготовления 100 мл высокой солевого буфера (для использования на стадии 2.15), добавить 1 мл (1 М HEPES, рН 7,9), 25 мл глицерина, 150 мкл (1 М MgCl 2), 26,7 мл (3 М KCl), 40 мкл (0,5 М ЭДТА) в 47 мл H 2 O. Конечные концентрации: 10 мМ HEPES, 25% глицерина, 1,5 мМ MgCl 2, 800 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА.
  4. 10% NP40 Моющее средство: 10 мл NP40 до 90 мл Н 2 О
  5. Протеазы и ингибиторы фосфатазы [добавлено к гипотонического буфера + NP40 (этап 2.11), низкой солевого буфера (этап 2.15) и высокой солевого буфера (этап 2.15) непосредственно перед использованием]: Добавить 2,5 мкл (1 М DTT) и 50 мкл ингибиторов протеаз (100x) в 5 мл буфера для каждой конечной концентрации 0,5 мМ ДТТ и ингибиторы протеазы 1x. Ингибитор протеазы 100x исходную смесь включает в себя:фторид натрия (Ser / Thr, кислые фосфатазы), ортованадат натри (Tyr, щелочных фосфатаз), β-глицерофосфат (Ser / Thr фосфатазы), пирофосфат натрия (Ser / Thr фосфатазы), апротинин (Ser протеазы), бестатин (амино-пептидазы ), E64 (Цистеинпротеазы), лейпептина (Ser / Cys протеазы), ЭДТА (металлопротеазами).

1.2 Подготовка аналитических планшетов

  1. Пластина фиксации Решение: для приготовления 500 мл раствора, добавляют 5,25 г карбоната натрия в 500 мл H 2 O, хорошо перемешать и довести рН до 9,7 для конечной концентрации 0,1 М карбоната натрия.
  2. Блокируя плиты решение: Для подготовки акции поли-ди / DC олигонуклеотида, ресуспендируют 1 шт (~ 50 мг) из поли-ди / DC в 1 мл 10 мМ Трис / HCl, рН 7,9, содержащего 1 мМ ЭДТА для концентрации акций 50 мкг / мкл. Со разбавляют до 1 мкг / мкл до использования.

1.3 Мойка буферы и разведения антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Стрептавидин промывочный буфер является используется для мытья тарелок между дополнений и разбавить первичные и вторичные антитела.

  1. Чтобы приготовить 1 л стрептавидин промывочного буфера, добавляют 2,4 г Tris / HCl, 37,5 мл (4 М NaCl), 10 мл (10% BSA), 5 мл (10% Tween-20), до 1 л стерильной Millipore-отфильтрованной воде , рН 7,18. Хранить при 4 ° С. Конечные концентрации: 20 мМ Tris / HCl, 150 мМ NaCl, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20.

1.4 ДНК-связывающий буфер

Примечание: Этот буфер хранили при -20 ° С.

  1. Чтобы приготовить 15 мл буфера для связывания ДНК, добавьте 180 мкл (1 М HEPES, рН 7,9), 300 мкл (3 М KCl), 12 мкл (0,5 М ЭДТА, рН 8,0), 7,5 мкл (1 М ДТТ), 3,0 мл (60% глицерина), 300 мкл (50 мкг / мкл поли-ди / DC) разбавляют деионизированной / дистиллированная H 2 O (12 мл). Конечные концентрации: 12 мм HEPES / рН 7,9, 60 мМ KCl, 0,4 мМ ЭДТА, 0,5 мМ DTT, 12% глицерина, 1 мкг / мкл поли-ди / DC.

2. Культура клеток и атомному Изоляция Белок

т "> Примечание: подготовка требует около 3 ч. стимуляции клеток будет зависеть от эксперимента количество клеток, используемых для каждого эксперимента будет меняться и все объемы отражают типичный эксперимент с использованием 3 х 10 7 клеток / точку Регулировка объемов для размещения... число клеток на самом деле используется в эксперименте 6.

  1. Для подготовки ядерный белок для анализа связывания ДНК, культуры клеток человека, которые выражают Runx2 (эндотелия, остеосаркома, рак молочной железы клетки) в соответствующих средствах массовой информации 6.
  2. Лечить субконфлюентные клетки с нокодазолом (0,2 мкг / мл в течение 16 часов), чтобы арестовать клетки в клеточного цикла границе G2 / M 6. В этих условиях белок RUNX2 стабилизируется и максимальный связывающий ДНК достигается. Таким образом, достаточно ядерный белок доступен для нескольких анализов и ингибиторы можно сравнить с того же препарата.
  3. Для каждого шага, предварительно охладить центрифуги до 4 ° С и подготовить буферы и охладить 20 мин при 4 ° С до сбора клеток.
  4. Холод клетки (4 ° С) и проводить процедуры по льду.
  5. Центрифуга клетки при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин в 15 мл полипропилена с круглым дном трубки.
  6. Вымойте 1x ледяным PBS (Са 2 + и Mg 2 + бесплатная).
  7. Центрифуга снова и отбросить PBS супернатанта.
  8. Добавить 500 мкл гипотонического буфера без ингибиторов протеазы, стараясь полностью ресуспендируют осадок клеток.
  9. Передача содержимого в 1,5 мл пробирку Эппендорфа.
  10. Сразу центрифуге при 5500 оборотов в минуту для 5,5 мин; отбросить супернатант и держать осадок клеток.
  11. Ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл гипотонического буфера, содержащего 0,5% NP40. Добавить протеазы и ингибиторы фосфатазы и 0,5 мМ ДТТ (как описано в стадии 1.1.5).
  12. Разрешить образец отдыхать на льду в течение 30 мин.
  13. Центрифуге при 13000 оборотах в минуту в течение 10 мин.
  14. Удалите супернатант (содержащий цитозольные белки).
  15. Ресуспендируют ядерной осадок в 60 мкл каждого из низкой салт буфер (к которому ингибиторы протеазы и 0,5 мМ ДТТ, которые были добавлены с шага 1.1.5) и высокой буферной соли (к которому ингибиторы протеазы и 0,5 мМ ДТТ, которые были добавлены с шага 1.1.5) в общей сложности 120 мкл. Добавить 60 мкл низкосолевого буфера к осадку первой и ресуспендируют, затем добавить 60 мкл высокой солевого буфера. Vortex гранул, чтобы помочь в ресуспендированием.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг помогает избавиться от некоторых из ядерных мембранных белков и настроить для лизиса шаге: низким содержанием соли первый (ресуспендируют осадок, вихревой), то высокая соль (вихрь) оптимизирует этот шаг. Хранить экстракт на льду в течение 30 мин, с вортексе после первых 10 мин.

  1. Центрифуга при 12000 оборотах в минуту в течение 15 мин; сохранить супернатант, содержащий ядерный белок.
  2. Измерение концентрации белка (попытаться сохранить образцы в 2-5 мг / мл), аликвоты в соответствующих количествах (10 мкл / пробирка) и хранят при -80 ° С.

ПРИМЕЧАНИЕ: Расчетный выход: 30 х 10 6 челLs даст 5 мкг / мкл белка в 120 мкл. 5 х 10 6 клеток даст 2,2 мкг / мкл белка в 40 мкл.

3. Подготовка двухцепочечный олигонуклеотид

  1. Дизайн комплементарных олигонуклеотидов с совместимыми половиной сайтов на концах. Для RUNX2 них являются: 5'-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3'-биотин (смысл) и 5'CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT Т GTGGTT AATACG-3'-биотин (антисмысловой).

ПРИМЕЧАНИЕ: эксперименты Пилотные определено, что три Runx2 сайты связывания и одного конца помечены биотин дали наиболее воспроизводимые результаты.

  1. Подготовка 5x буфер отжига: Добавить 300 мкл (1 М Трис-HCl, рН 7,6), 30 мкл (1 М MgCl 2) добавляли 10 мкл (1 М DTT) в 260 мкл H 2 O (конечная 600 мкл).
  2. К 200 пмоль каждого одноцепочечной Oligonucleotide (3 мкл), добавить 12 мкл 5x отжига буфера и 45 мкл H 2 O в общей сложности 60 мкл (200 pmol/60 мкл).
  3. Нагревают при 95 ° С в течение 5-10 мин в нагревательном блоке.
  4. Остудить до 65 ° C медленно (установив температуру до 65 ° С, она занимает 15 мин), затем охлаждают до комнатной температуры медленно, выключив питание нагревательного блока (или путем размещения в 50 мл воды 65 ° C в стакане на льду, это занимает 15-20 мин).

4. Подготовка 96-луночных

ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте белки молока в промывных буферов.

  1. Fix тарелку с фиксирующим раствором (0,1 М карбоната натрия): добавить 300 мкл / лунку.
  2. Инкубировать в течение 2 часов при не-качалка при комнатной температуре (RT) или нет качалки при 4 ° С (O / N).
  3. Вымойте пластины 3 раза с стрептавидин промывочного буфера (ВБ): добавить 300 мкл / лунку каждый раз.
  4. Добавить биотин-меченого двухцепочечной олигонуклеотида (3 консенсус связывающих сайтов на нуклеотида) в течение 2 часов шIth качалки (1,25 нмоль / лунку; 100 мкл / лунку).
  5. Вымойте 3x холодной ВБ: добавить 300 мкл / лунку и сразу же пластину перевернули в раковину и промокните края на бумажное полотенце после каждого добавления.

ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте наконечники для удаления жидкости из пластин, поскольку это может скрести авидин: биотин: ДНК комплексы из скважин. Делайте это в течение всех последующих стадий промывки.

5. Инкубация с ядерной Extract

ПРИМЕЧАНИЕ: Не заменяйте лосося или ДНК спермы сельди для поли DI / DC Обратный буфера. Избегайте блокировки пластины с молочными протеинами. Оба этих блокирующих агентов привести к высоким фоновым значениям.

  1. Инкубировать с конкретной фактора транскрипции, полученного из ядерного экстракта (90 мкл / лунку). Подготовьте основной смеси, содержащее ядерное экстракт (ДНК-связывающий белок; 3-9 мкг / лунку) буфер + поли-ди / DC (1 мкг / мкл от 50 мкг / ул складе) в 1x связывания ДНК. Громкость по мере необходимости для общего количестваскважины, необходимые (90 мкл / лунку).
  2. Любой потенциальный ингибитор, такой как витамин D3 (рис. 2) или соединение CADD 5221975 (рис. 3), или соответствующего разведения контроля растворителе, таком как этанол, добавляют при этом шаге.
  3. Место пластины на качалки платформу, O / N при 4 ° С.
  4. Вымойте 3x с ВБ: добавить 300 мкл / лунку

6. Добавление первичного антитела

ПРИМЕЧАНИЕ: Первичные разведения антител следует приготовить свежую - хранение не рекомендуется.

  1. Развести Runx2-специфическое моноклональное антитело (запас 1 мкг / мкл) 1/5, 000 в стрептавидином промывочный буфер. Подготовка достаточно для дополнение к каждой лунке 96-луночного планшета (90 мкл / лунку) в трех экземплярах.
  2. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре на ротационном платформы.
  3. Вымойте 3x с ВБ, добавить 300 мкл / лунку.

7. Добавление вторичного антитела

ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичное разведения антител может быть СТОкрасный при 4 ° С в течение ночи при необходимости на следующий день.

  1. Развести F AB-специфическим сродством очищен-HRP с сопряженными антитела (7,1 мг / мл акции), чтобы 1:1,400 в стрептавидином моющий буфер: 3,5 мкл antibody/5.0 мытья мл буфера. Подготовка достаточно для дополнение к каждой лунке 96-луночного планшета (90 мкл / лунку) в трех экземплярах.
  2. Инкубировать 30 мин при комнатной температуре на ротационном платформы.
  3. Вымойте 6x с ВБ путем обращения тарелку в раковину (300 мкл / лунку).

8. HRP субстрат и разработка новых продуктов

  1. Добавить 50 мкл ТМВ субстрата на лунку непосредственно на складе бутылки.
  2. Выдержите 10-20 минут при комнатной температуре в темноте (остановка метод реакции) или измерить абсорбцию непосредственно (непрерывное кинетическую мониторинг).

9. Реакция измерения

  1. Стоп метод реакции: Для реакции визуальной остановки, проверки для изменения цвета на голубое и остановить реакцию с 50 мкл серной кислоты.
  2. Измерить поглощение при 450 нмBiotrak II Видимый ридер спектрофотометр (Amersham Biosciences; GE Healthcare Biosciences Корпорация Пискатауэй Нью-Джерси, США) или аналогичный прибор.
  3. Непрерывная кинетический метод мониторинга: Добавить субстрат после последней промывки и просто до размещения в спектрофотометра (не остановить реакцию).
  4. Измерьте оптическую плотность при 635 нм с Био-Тек Синергия HT Multi-реакции микропланшет-ридере спектрофотометра (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, Вермонт, США) или аналогичный прибор.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Метод D-ИФА весьма специфичен для назначенного ДНК-связывающего белка, пока используется последовательность конкретных, двухцепочечной олигонуклеотид, содержащий три копии консенсус Runx2 сайта связывания (ACACCA). Первичный антитело, распознающее белковый фактор также повышает специфичность. Вторичное антитело содержит ковалентно связанный-пероксидазу хрена (HRP), который преобразует четкое субстрат (тетраметилбензидин) в окрашенный продукт для облегчения обнаружения (рис. 1). По этим причинам, несколько важных фон контроля должны быть включены в каждый планшет для анализа, чтобы обеспечить определенный ДНК связывания. К ним относятся измерения колориметрического продукт от вторичной реакции антитело-HRP в скважинах, не содержащих либо (1) не ядерный белок, (2) Нет первичного антитела, или (3) неспецифический IgG мыши вместо специфических моноклональных антител. В наших рутинных измерений, элементы управления не-белковые вычитают из конкретного белка Ай выражена как чистого продукта реакции. Кроме того, когда компьютерный дизайн лекарственных средств (САПР) используется, чтобы обнаружить соединения и препараты испытывают в анализах связывания ДНК, эффект растворителя используется для растворения соединения должны быть определены в отдельных скважинах. Как правило, скрининг лекарств требует использование воды, этанол или диметилсульфоксид солюбилизировать соединений. Каждый из этих растворителей испытан отдельно и в соответствующих концентрациях. Некоторые экраны наркотиков определены соединения, которые имеют незначительное влияние на связывание ДНК, как показано на лиганда рецептором витамина D., 1α ,25-ОН витамина D3 (рис. 2). Это соединение не ингибирует ДНК-связывающий даже при более высоких концентрациях (от 100 нм до 100 мкм). Другие экраны наркотиков обнаружены соединения, которые ингибируют белок: связывания ДНК (рис. 3). На основе анализа кинетических измерений 7, увеличивая количество ингибитора CADD5221975 привело к зависимым от дозы, сигмоидальной кривой ингибирования, шIth концентрации ингибитора выше 10 -3 М эффективно ингибирующие ДНК-связывающие, а концентрации ниже 10 -11 М показал очень мало торможение. EC 50 (концентрация, при которой ингибитор вызвало снижение связывания с ДНК RUNX2 50%) составляло 10 нМ для этого соединения. Статистический анализ для этого анализа были опубликованы ранее 6 и, для простоты, только одна скважина из трех экземплярах серии скважин показано на представительных фиг.2 и 3.

Рисунок 1
Рисунок 1. Блок-схема протокола D-ELISA. (A) Изолировать ядерных белков из клеток млекопитающих. Растущие клетки фракционировали моющего лизиса и высоких методов соли для извлечения белков плотно связанные с ДНК. (Б) Приготовьте дouble мель олигонуклеотида. RUNX2 сайт связывания ACACCAA в трех экземплярах готовят с тегом биотина на 3'-конце. (C) Подготовка 96-луночных планшетах. Плиты получены с авидин покрытием, но должен быть закреплен с высоким рН перед добавлением меченного биотином олигонуклеотиды. (D) Ядерные экстракты инкубируют с ДНК. Планшеты блокировали неспецифическое poly-dI/dC перед добавлением ядерный экстракт белков. (E) Добавить первичного антитела. Антитела готовится свежая до инкубации с пластиной. (F) Добавить вторичного антитела. Вторичное антитело затем тщательного промывания. (G) Добавить HRP субстрат и развитие продукта. Колориметрический продукт можно видеть на тарелке. (H) Измеряют поглощение продукта на спектрофотометре. Поглощение либо 450 нм (остановки реакции) или 635 нм (непрерывный контроль). (Я) Типичный непрерывное считывание при 635 нм. Показаны специфическая реакция и баckground (без белка) контролирует в трех экземплярах.

Рисунок 2
Рисунок 2. 1α ,25-ОН витамин D3 оказывает незначительное влияние на Runx2 ДНК связывания. В этом представительном например, биологически активный витамин D3, 1α ,25-ОН витамин D3, мало влияет на Runx2 связывания ДНК. Другие витамина D3 соединения, однако, иметь драматические последствия для связывания ДНК 6.

Рисунок 3
Рисунок 3. Ингибирование связывания ДНК по предполагаемого RUNX2. ДНК активный препарат в этом представительном например, соединение, которое было определено с помощью компьютера дизайна лекарств экрана (САПР) выставлены дозозависимое ингибирование связывания ДНК Runx2 от 1 нМ до 100 мкМ. Ингибирование связывания рассчитывали, используя установленные методы 7и получают ЕС50 (концентрация ингибитора, в результате которого 50%-ное ингибирование связывания ДНК) 10 нМ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ДНК-связывающий анализы используются для измерения способности факторов транскрипции, чтобы взаимодействовать с ДНК. Анализы на ДНК связывающие включают электрофоретическую сдвиг мобильности (EMSA) 1 и хроматина immuneprecipitation (чип) анализы, основанные 3, а также анализов с использованием форматирует 96-Ну 4 например хемилюминесцентных анализов 2. EMSA не является количественным и использует радиоактивно (32 р) олигонуклеотиды. Эти инкубируют с ядерными белками и связывающие комплексы разделены на агарозных или полиакриламидном геле. В противоположность этому, количественный D-ELISA может измерять взаимодействие RUNX2 с ДНК-связывающих последовательностей, соответствующих определенных промоторных элементов в генов-мишеней Runx2. Использование анти-антителом Runx2 увеличили специфичность анализа и отличает эту пробу от традиционного анализа гель сдвига 5. В то время как D-ELISA представляет собой анализ в пробирке и не может контролировать размещение промотора в живых клетках,что возможно с чипом анализов, он может быть использован для количественного скрининга соединений, которые ингибируют ДНК-связывающего комплексы. Эти анализы ограничены взаимодействия ДНК анализы и не может предсказать, будет ли конкретный промотор активирован или репрессированы. Другие подходы, такие как промотор-репортер люциферазы анализов, которые необходимы для определения транскрипционную активность конкретного фактора транскрипции.

Общий протокол метода D-ELISA, описанной здесь был адаптирован из предыдущего метода, используемого для измерения активной Nfkappa-B 8. Этот протокол D-ELISA обеспечивает способ количественного измерения белка: связывание с ДНК, что является последовательность-специфических и не предполагают использование радиоактивности. Если необходимо, скорости реакции (V макс.) также может быть вычислено из непрерывного мониторинга кинетической реакции, и это может обеспечить дополнительную дискриминацию тестируемых соединений 7.

RUNX2 и его кофактораCbf SS было обнаружено, что связано с меченных биотином олигонуклеотиды 6, что подтверждает специфичность анализа, а также подчеркнуть, что можно идентифицировать кофакторов, которые могут ассоциировать с конкретными ДНК-связывающих факторов транскрипции. При непрерывном кинетической мониторинга, инкубационный может быть продлен и менее ядерный белок могут быть необходимы для выявления изменений в ДНК, обязательные. Таким образом, кинетическая мониторинг как ожидается, будет более чувствительным, чем методы реакции остановка. Важным применением этой кинетическим методом включает скрининг препаратов, ингибирующих или активирующих фактор транскрипции ДНК-связывающие 6.

Другие возможные проблемы, которые могут возникнуть при исполнении анализа включают в себя наличие высоких фоновых значений. Высокие фоновые значения может быть связано с: (1) высоких концентрациях вторичных антител, (2) недостаточной блокировки, (3) использование ДНК спермы лосося, как блокатора, (4) отсутствие шагом блокирующего белка или (5)первичные или вторичные антитела с низкой специфичности. Если они встречаются, несколько средств возможны в том числе: (1) оптимизации концентрации вторичного антитела в экспериментальных исследований и с использованием меньшего объема антитела в каждую лунку, (2) блокирование пластину с основным раствором карбоната натрия (3) с использованием ди / постоянного тока как неспецифического, а не ДНК спермы лосося, которые могут содержать промоторы транскрипции с элементами привязки, или (4), используя различные пары первичных или вторичных антител из различных источников.

С другой стороны, низкий уровень сигнала может быть вызвано (1) низкое количество белка-мишени, (2) концентрации первичных или вторичных антител не являются оптимальными, (3) возбуждения и / или излучения длин волн не является оптимальным, и ( 4) антитела имеют низкое сродство для их субстратов. Несколько средства этих проблем включают: (1) В рамках устранения неполадок, можно использовать 30 мкл низкий буфер соль + 30 мкл высокой буферные соли, если меньше клетки безрезультатносостоянии и ядерный фактор транскрипции присутствует в больших количествах. Или можно было бы использовать 90 мкл низкий буфер соли + 90 мкл низкий буфер соль, если больше клеток имеются. Еще клетки полезны, когда выражение специфического фактора, подлежащего испытанию низка. (2) Оптимизация концентрации первичного антитела к увеличению сигнала. (3) Монитор фильтры на инструменте, чтобы убедиться, что они установлены для правильной возбуждения и максимумов излучения для субстрата ТМВ; альтернативой флуоресцентный или хемилюминесцентные субстраты также могут быть использованы. (4) Если первичное антитело имеет низкое сродство, увеличить время инкубации на тарелке.

С точки зрения лекарственных препаратов, текущий RUNX2 ДНК-связывающий ELISA был использован для обнаружения усиливается связывание белка с его мишенью ДНК и определенных природных соединений (таких как витамин D3), которые селективные модуляторы ДНК-связывающий. Некоторые из этих соединений обладают неконкурентных механизмов действия и изменить биологическую функцию в соответствии споверхностное торможение парадигма 9. С недавним разрешением геномной ДНК-секвенирования, дальнейшие применения может включать открытие новых белков, взаимодействующих с некодирующих ("мусор") ДНК, которая регулирует экспрессию кодирующих областях 10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Техническая помощь и приборы из Университета штата Мэриленд Greenebaum онкологический центр Поступательное основной комплекс, особенно д-ра. Рена Лапидус и Мариола Садовска, которые с благодарностью. Работа отвечает за развитие этого анализа была частично финансируется NIH RO1CA108846, AHA Грант-в-помощь GRNT2130014, заслуга премии В. А. П., и в Университете штата Мэриленд сигарет реституции фондов (ХПН), предоставляемой Марлен & Stewart Greenebaum онкологический центр.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly dI/dC GE Healthcare, Piscataway, NJ US20539-5UN 1 U ~50mg
RUNX2 antibody MBL International Corp., Woburn, MA D130-3 1 mg/ml
Fab-specific peroxidase conjugated antibody Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A9917 7.1 mg/ml
TMB Substrate (tetramethyl benzidine) EXALPHA Biologicals, Shirley, MA X1189S 100 ml
Sodium carbonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 57995 Plate-fixing
Sulfuric Acid VWR, West Chester, PA BDH-39922-1 Stop solution
Multi-well plates Greiner Bio-One, Basel, Switzerland 655996 Avidin-coated, black sides
HALT Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL 78440 Protease and phosphatase inhibitors
Chemicals Various manufacturers Laboratory grade
Table 1. Reagents
Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader Amersham Biosciences For use with stop reaction method
Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader Bio-Tek Instruments, Inc. For use with continuous kinetic monitoring
Table 2. Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
  2. Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay. Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).
  3. Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays. BMC Genomics. 10, 497 (2009).
  4. Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses. FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).
  5. D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway. J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).
  6. Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity. J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).
  7. Held, P. Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations. Biotek Instruments Application Note. Biotek. Available from: http://www.biotek.com/resources/docs/B-Gal_Michaelis-Menten_App_Note.pdf (2007).
  8. Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB. Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).
  9. Pommier, Y. DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition. Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).
  10. Pennisi, E. Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA. Science. 337, 1159-1161 (2012).
Количественный Анализ по изучению белок: ДНК взаимодействий, Discover транскрипционных регуляторов экспрессии генов, и идентифицировать новые противоопухолевых средств
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).More

Underwood, K. F., Mochin, M. T., Brusgard, J. L., Choe, M., Gnatt, A., Passaniti, A. A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents. J. Vis. Exp. (78), e50512, doi:10.3791/50512 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter