Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

ال Published: July 17, 2013 doi: 10.3791/50522
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 4, 2, 2
1Department of Orthopaedic Surgery and Traumatology, Ghent University Hospital, 2Department of Radiation Oncology and Experimental Cancer Research, Ghent University, 3Department of Virology, Parasitology, and Immunology, Ghent University, 4Pathlicon

Summary

ال

Abstract

ساركوما هو مرض نادر جدا وهذا هو غير متجانسة في طبيعتها، جميع تعوق تطوير علاجات جديدة. مرضى ساركوما هي مثالية للمرشحين الطب الشخصي بعد التقسيم الطبقي، وشرح الفائدة الحالية في تطوير نموذج xenotransplant استنساخه ومنخفضة التكلفة لهذا المرض. فرخ مشيمائي الغشاء هو مضيف العوز المناعي الطبيعية قادرة على الحفاظ على الأنسجة والخلايا المطعمة دون قيود أنواع محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم الوصول إليه بسهولة، والتلاعب تصويرها باستخدام stereomicroscopy البصرية ومضان. يسمح الأنسجة مزيد من التحليل المفصل من التفاعلات الخلوية غيروي.

يصف هذا البروتوكول بالتفصيل في البيضة ترقيع لغشاء مشيمائي مع ساركوما المستمدة الطازجة أنسجة الورم، ومعلقات من خلية واحدة، وfluorescently المسمى خطوط الخلايا ساركوما أنشئت دائمين ومؤقتين (Saos-2 وSW1353). بقاء الفئران كتكوتES ما يصل الى 75٪. يتم استخدام نموذج لدراسة الطعم (الملاءمة، ومؤشر انتشار Ki67، نخر، تسلل) والمضيف (تسلل الخلايا الليفية، نشوب الأوعية الدموية) السلوك. لالمترجمة تطعيم تعليق خلية واحدة، ECM هلام ويوفر مزايا هامة على المواد الخاملة الاحتواء. ويرتبط مؤشر انتشار Ki67 إلى مسافة قريبة من الخلايا من سطح CAM ومدة التطبيق على CAM، وهذا الأخير تحديد إطار زمني لإضافة المنتجات العلاجية.

Introduction

ساركوما هو ورم نادر يصيب الأنسجة الضامة مع ارتفاع معدل الوفيات بسبب العلاج المقاومة 1،2. ويعيقه من التقدم في بقاء المريض بواسطة معدل الإصابة بها منخفضة السنوية وتنوعها واسعة، وحقيقة أن يتم الإبلاغ عن خلايا ساركوما أن يكون من الصعب للثقافة في المختبر 3،4.

كشفت استخدام الخلايا المستزرعة لتقييم العلاج قبل السريرية التي، على ما يبدو الجزيئات النشطة جديدة في المختبر لا تعكس دائما نتائج في الإعداد السريرية. وعلاوة على ذلك، الانحرافات الجينوم التي كشفت عنها صفائف التعبير الجيني ليست دائما مرتبطة إلى خصائص السلوك الورم في مريض 5-7. من أجل محاولة حل هذه المشاكل، وقد اكتسب الطب الشخصي في أهمية، وهو ما انعكس في زيادة البحث عن نماذج طعم أجنبي 8-12.

وهو في فيفو مقايسة لديه ميزة يعكس التفاعل المعقد بين جالخلايا ANCER والبيئة الأنسجة المضيفة في الأورام الصلبة، اللازمة لانتشار السرطان وغزو 13. حاليا نقوم بدراسة استخدام فحص غشاء المشيمي-السقاء (CAM-مقايسة) كنموذج طعم أجنبي استنساخه لساركوما 14،15. ويستخدم على نطاق واسع هذا الاختبار لدراسة الأوعية الدموية ورم 16،17. في الأدب، ومع ذلك، فقد وجدنا بروتوكولات مختلفة لهذا الفحص، في حين لوحظ دراسات أخرى اختلاف واضح في النمو أو الأوعية الدموية وفقا لبروتوكولات مختلفة 18،19.

في هذه المادة ونحن دراسة تأثير ظروف CAM-مقايسة متفاوتة على سلوك الخلية باستخدام الطعوم الورم، الورم المشتقة من تعليق خلية واحدة، وأنشأ الثقافات خلية ساركوما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

انظر الشكل 1 لمحة عامة.

مادة الورم

1. الحصول على وتحضير عينات الورم

لاستخدام المواد المريض، موافقة اللجنة الأخلاقية أمر ضروري، والموافقة المسبقة لابد من الحصول عليها من المريض.

  1. المواد الحصاد ممثل (الحد الأدنى 1 سم 3) في وقت التدخل، إما خزعة أو استئصال للساركوما. يتم تعريف الموقع المناسب من الخزعة باستخدام الحيوي النقيض من التصوير بالرنين المغناطيسي.
  2. وضع المواد على الفور في قارورة معقمة تحتوي على DMEM تستكمل مع 1،000 U البنسلين و 1 ملغ / مل الستربتوميسين.
  3. نقل القارورة فورا (30-90 دقيقة) إلى المختبر.

يتم تنفيذ كافة الإجراءات التالية في إطار تدفق الصفحي.

  1. صب محتويات القارورة في طبق بتري معقمة.
  2. وضع عينة الورم إلى أجزاء صغيرة من الحد الأقصى 13 مم باستخدام مشرط معقم. إزالة كافة أجزاء متكلسة لأنها تميل إلى إضعاف مزيد من المعالجة من الأنسجة.
  3. عشوائيا يستغرق 10 الطعوم الورم للتطبيق على CAM.

2. إعداد الورم المشتقة من تعليق خلية واحدة

المدة التقريبية: 3 ساعة

  1. وزن الأنسجة المتبقية من العينة.
  2. وضع 2 - قد يكون مطلوبا 4 غرام من الأنسجة في أنبوب dissociator، أنبوب واحد أو أكثر لهضم كل أنسجة الورم المتبقية.
  3. لهضم 2-4 غرام من الأنسجة، وإضافة 2.5 مل كولاجيناز 2 الحل (500 U / مل المتوسط ​​1640) و 2.5 مل من محلول الدناز (22 KU / مل المتوسط ​​1640).
  4. معالجة الأنسجة وفقا لبروتوكول h_tumor dissociator. وهذا ينطوي على 2 دورات من الحضانة عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 في حين اهتزت الأنبوب برفق لمدة 30 دقيقة.
  5. تعليق تصفية المتبقي من خلال مصفاة الخلية 150 ميكرون.
  6. أجهزة الطرد المركزي في المحللة في 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 مفي.
  7. إزالة طاف.
  8. Resuspend وبيليه في 10 مل من العازلة تحلل كرات الدم الحمراء (ELB)، مما يسمح لل10 دقيقة من الحضانة مع تعليق العادية.

ملاحظة: يتم تصنيعها العازلة تحلل كرات الدم الحمراء كما يلي: إضافة 0.037 ز EDTA، 0.99 ز K 2 هبو 4، 8.29 ز NH 4 الكلورين إلى 1،000 مل ماء، واستخدام 10 N هيدروكسيد الصوديوم لضبط درجة الحموضة إلى 7.3، مرشح تحت ضغط من خلال 0.22 ميكرون تحديد. تخزينها في 4 درجة مئوية.

  1. إضافة 25 مل من مستنبت (DMEM تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني، 100 U / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين) لوقف رد الفعل.
  2. الطرد المركزي تعليق على 1،000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. هذا اللون من بيليه يجب أن يكون أبيض الآن.
  3. إزالة طاف.
  4. إضافة 5 مل من المتوسط ​​لبيليه. تعليق تصفية من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر.
  5. حساب عدد الخلايا الحية / مل عن طريق عداد الخلايا التلقائي.

3.خطوط الخلايا السرطانية

و electroporated معربا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر من قبل peGFP-C1 ناقلات باستخدام خلية الخط Nucleofector كيت الخامس وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة: SAOS2 خلايا عظمية (HTB-85 عدد آي تي ​​سي سي). لإنشاء خطوط الخلايا مستقرة، وقد تم اختيار الخلايا transfected في G418 (1 ملغ / مل) لمدة 4 أسابيع في خط مع السابق أنشأ البروتوكول 20. وبالإضافة إلى ذلك تم إجراء الفرز بواسطة مضان الفرز الخلية تفعيلها (FACS) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

وصفت أو الطازجة ورم تعليق خلية واحدة باستخدام أحمر فلوري غشاء محبة للدهون وصمة عار: الخلايا من خط الخلية SW1353 غضروفية (HTB-94 رقم آي تي ​​سي سي).

  1. إزالة الخلايا من قارورة الثقافة بطريقة الكلاسيكية باستخدام التربسين (0.5٪ وزن / المجلد) حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA؛ 0.2٪ بالوزن / المجلد) حل.
  2. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 5 دقائق عند 1،000 دورة في الدقيقة.
  3. إزالة السوبرعائم.
  4. إضافة 1 مل من المصل خالية المتوسطة و 5 ميكرولتر الجاذبة (Vybrant الأحمر) / 10 6 خلايا.
  5. التفاف قارورة في رقائق الألومنيوم ووضعها في حاضنة CO 2 لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  6. أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 1،000 دورة في الدقيقة وإزالة طاف.

مشيمائي فحص غشاء

1. حضانة البيض

  1. مطلوبة البويضات المخصبة من مفرخ تجارية محلية تضمن الإخصاب 95٪ من البيض.
  2. ويمكن تخزين البويضات المخصبة في RT تصل إلى 10 يوما.

ملاحظة: قبل البدء في الحضانة، تتم إزالة الأوساخ، والريش والبراز بعناية من قشر البيض ميكانيكيا بواسطة المسح الجاف مع مناشف ورقية، والتي لها الخام بدلا من بنية سطح ناعم. مسح البيض مع الايثانول 70٪ التشويه والتحريف أو أي كاشف التنظيف الأخرى يقلل بشكل ملحوظ من معدل البقاء على قيد الحياة من افراخ الدجاج.

  1. وضع البيض في incuباتور على جانب واحد، بمناسبة السطح العلوي. تم تعيينه اليوم الذي يتم وضع البيض في الحاضنة 0 يوم من التطور الجنيني.
  2. ضبط درجة حرارة الحضانة عند 37.8 درجة مئوية، والرطوبة في 47٪. تأكد من تشغيل خيار التناوب التلقائي.

2. افتتاح بيض

المدة: 60 دقيقة ± لمدة 25 البيض

في يوم 3 تنمية، يتم فتح البيض تحت تدفق الهواء الصفحي. فتح البيض في مزيد من نتائج المرحلة التنموية في الأضرار التي لحقت CAM، كما الغشاء يميل إلى التمسك قذيفة. يتم استخدام مصباح الأشعة تحت الحمراء للحفاظ على البيض الدافئ أثناء العملية. لتحسين العقم، نوصي استخدام قفازات اليد.

  1. ضع البيضة في كأس البيضة، مع الجانب ملحوظ متجهة لأعلى.
  2. خفض مستوى CAM عن طريق إزالة اثنين من مل من الزلال من خلال إبرة G 18 المدرجة في غيض من البيض. إذا كانت إبرة حادة بعد عدة تثقيبقشر البيض، استبدل الإبرة. إذا لم يكن كذلك، الكثير من القوة لابد من بذل، مما أدى إلى الأضرار التي لحقت صفار البيض أو كسر في قذيفة. في بعض الأحيان يتم حظر إبرة من قبل chalazae، واحدة من 2 العصابات دوامة تعليق صفار في زلال. يمكن حل هذا عن طريق دفع بلطف على المكبس إلى أسفل مرة أخرى حتى يتم حل كتلة. إذا امتص صفار البيض في حقنة، استبدل الإبرة وكذلك الحقنة. أحيانا يموت الجنين بعد هذا الحدث. إذا تمت إزالة كمية كافية من زلال، وسوف يكون معطوبا CAM عندما تتم إزالة القشرة.
  3. تطبيق الفيلم لاصقة نصف نافذ في الجانب العلوي ملحوظ من قذيفة من أجل منع إراقة الجسيمات قذيفة على CAM في حين خفض النافذة.
  4. جعل حفرة مقدمة مع المخرز الصغيرة على سطح البيضة.
  5. خفض نافذة من 1 سم 2 في وعاء، وذلك باستخدام زوج من مقص جراحي مدببة العقيمة.
  6. ويمكن ملاحظة القلب النابض للجنين والأوعية المجاورة في تيكان سطح صفار البيض. إزالة البيض غير المخصب أو أجنة ميتة. جانبا توقف الأوعية الدموية يميز أجنة ميتة.
  7. اغلاق النافذة مع فيلم لاصق نصف نافذ. فإنه ليس من الضروري لتغطية موقع ثقب، ما لم يكن قد تصدع قذيفة أثناء إدخال الإبرة.

3. إجراء التلقيح

المدة: ± 1 ساعة لكل خط الخلية

على الفرخ الجنينية التنمية يوم 9، يتم تلقيح البويضات تحت تدفق الهواء الصفحي.

تقييم الخلايا السرطانية تنتشر في أنحاء CAM يتطلب احتواء الخلايا على سطح محدودة خلال التلقيح. Matrigel هو مصفوفة (ECM) هلام خارج الخلية من ساركوما الماوس Engelbreth-هولم-سرب كثيرا ما تستخدم في ظروف زراعة الخلايا التجريبية. بل هو السائل عندما تبرد، ولكن سيخضع البلمرة تنشيط حراريا عندما أحضر إلى 20 - 40 درجة مئوية، وبالتالي تشكيل هلام مستقر. الزيتوز التجارب، يتم الاحتفاظ Matrigel في مربع تحتوي على ذوبان الجليد.

ملاحظة: نحن نصر على عدم استخدام coverslips على مثقبة. لاحظنا المرفق ونمو الخلايا السرطانية المطعمة على القرص البلاستيك وبالتالي يتحامل إمكانات النمو للخلايا على الغشاء نفسه.

  1. Resuspend خلية بيليه في تبريد ECM جل بتركيز 10 6 cells/100 ميكرولتر ECM هلام. الحفاظ على هذا الحل على ذوبان الجليد.
  2. جزء المكوس من غشاء شبه منفذ مع زوج من الجراحية المعقمة تحت الصفحي تدفق الهواء. إذا تمت إزالة فيلم لاصق تماما، وهذا سوف يؤدي إلى نسبة أكبر من الوفيات الجنينية بسبب التلوث.
  3. تلمس الحق CAM تحت النافذة قذيفة بخفة مع قضيب زجاجية معقمة، وذلك لإزالة طبقة الخلايا الظهارية. لمس CAM بقضيب زجاجي معقم يبرهن على أن تكون أقل من صدمة من استخدام مشرط N ° 11، الأمر الذي يتطلب المزيد من البراعة والخبرة. قد يحدث نزيف صغير.
  4. إضافة مواد الورم.
  5. لترقيع ورم: انخفاض بلطف قطعة واحدة من النسيج على CAM مع زوج من ملقط معقم، دون الضغط عليه.
  6. لإجراء هلام ECM: إضافة 4X 25 ميكرولتر من خلية ECM هلام تعليق لCAM، على رأس كل منهما الآخر، والسماح للهلام ECM لبلمرة في ما بين التطبيقات. في هذه الطريقة يتم إنشاء البلاك الملتصقة التي تحتوي على الخلايا السرطانية.
  7. اغلاق النافذة قذيفة مرة أخرى مع فيلم لاصق نصف نافذ.

4. التصوير والحصاد من CAM

المدة: 2 ساعة لمدة 25 البيض

على الفرخ الجنينية التنمية يوم 16، ويتم حصاد الحدب. تعمل تحت الصفحي تدفق الهواء ليست ضرورية.

  1. تكبير النافذة مع زوج من مقص جراحي. تأكد من عدم قطع منخفضة جدا، وإلا سوف تتضرر CAM، مما أدى إلى نزيف من الأوعية الدموية المصابة.
  2. إضافة 300-500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني D مع ماصة على CAM ثانيةنشوئها التي تحتوي على مواد تلقيح. إذا تم استخدام أي تحقيقات الفلورسنت، والفورمالديهايد مخزنة يمكن استخدام هذا يجعل الغشاء أكثر صلابة، وتسهيل عملية قطع من الغشاء.
  3. جعل صورة للCAM في البيضة من خلال المجهر مضان ستيريو، ومجهزة بكاميرا رقمية ملونة، باستخدام كل من GFP أو مرشح DSR، وبدون تصفية. لترقيع الورم، وكلها مصنوعة الصور بدون فلاتر. ويوصى الإضاءة من فوق الصمام الاضواء بشدة خلال تصوير (الشكل 2).
  4. سجل هجرة الخلايا السرطانية للخلايا المسمى. حدود الأورام قد يكون غير منتظم والمتوترة. قد تكون خلايا متناثرة الحالي بالقرب من الحدود الورم. في بعض العينات، ويمكن ملاحظة صفوف من خلايا الورم (الشكل 3).
  5. قطع الغشاء مع زوج من مقص العقيمة على الحدود الكذب ضد قذيفة.
  6. وضع CAM تحصد في طبق بتري معقمة مليئة PBS D أو مخزنة FOrmaldehyde.
  7. جعل صورة من كل من الجانب العلوي والجانب السفلي من CAM، مع وبدون فلتر على حد سواء.
  8. وضع الغشاء في وعاء المسمى مع الفورمالديهايد مخزنة لمدة 72 ساعة على الأقل.
  9. تضمين الحدب في البارافين وإعدادهم للفحص النسيجي. رعاية لقطع ترقيع ورم في وسط العقيدات، والتأكد من سطح قطع موازية للأسفل الكاسيت. إذا لم يحدث ذلك فإن التفاعل بين CAM والكسب غير المشروع الورم لا تكون مرئية. وينطبق نفس الاستراتيجية لويحات هلام ECM: السطح التي تواجه شفرة القطع يجب أن يكون عمودي على اللوحة.

5. التقييم النسيجي

أجريت هيماتوكسيلين-يوزين تلطيخ وكي 67 المناعية لمزيد من التوضيح، إذا لزم الأمر. تم تنفيذ المناعية على أقسام الأنسجة البارافين جزءا لا يتجزأ من الفورمالين الثابتة من 3.5 ميكرون في سمك، وذلك باستخدام شريحة الآلي الملطخ accordinز لتعليمات الشركة الصانعة. تم استخدام الماوس الأساسي الأضداد وحيدة النسيلة لكي 67 (استنساخ MIB-1، تخفيف 1/100). تم إجراء الحرارة التي يسببها حاتمة استرجاع باستخدام هواء خلية 1، وتحقق التصور مع كشف DAB كيت العالمي، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وقد أجريت Dehydratation من أقسام الأنسجة خارج باستخدام coverslipper الآلي.

لSAOS2 وخطوط الخلايا SW1353، احصي عدد Ki67 إيجابية وسلبية Ki67 خلية nuclei/100 ميكرون 2 في ثلاث مناطق: واحدة قريبة من الحدود من CAM، واحدة إغلاق سطح واحد في وسط الجل لوحة ECM. وقد تكرر هذا الإجراء 6X لكل شريحة كي-67 الملون. تم تحديد مؤشر الانتشار لكل شريحة عن طريق قسمة عدد من الخلايا إيجابية Ki67 من العدد الكلي للخلايا فرزها.

يتم تعريف نخر من خسارة تشتت غرامة من لونين في نواة الخلية، يرافقه بدعةجي من هوامش الخلية متميزة. لxenografts، وسجل نخر أنها كاملة، جزئية (غالبا على السطح)، أو غائبة. يتم تعريف تسلل الخلايا السرطانية في CAM من خلال رصد الخلايا السرطانية داخل الأديم المتوسط ​​من CAM، ويتم احتسابه كونه حاضرا أو غائبا.

وسجل ثلاثة بنود للسلوك المضيف. يتم تعريف تسلل الخلايا الليفية والخلايا ممدود ترك CAM وغزو الكسب غير المشروع ورم / لوحة، ويتم احتسابه كونه حاضرا أو غائبا. ويمكن ملاحظة نشوب الأوعية الدموية كما نشوب المتكاثرة من السفن الفرخ، التي تميزت بحضور من الكريات الحمراء كتكوت الأنوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تقييم CAM

ترقيع ورم تصبح ملتصقة على CAM (الشكل 2A). تعليق خلية واحدة من المواد المريض في كثير من الأحيان عرض المجففة، لوحة مرتفعة قليلا (الشكل 2D). بعد استئصال CAM، تميزت التجاعيد من الغشاء يحدث (أرقام 2E و2F).

لخطوط الخلية التجارية يصبح أكثر غموضا لوحة في الوقت المناسب، مشيرا إلى تكاثر الخلايا. خطوط مختلفة من الخلايا في ECM هلام لديهم نمط نمو متميزة على CAM. SAOS2 تشكل لوحة الانتشار، مع زيادة واضحة من سطح من يوم 7 بعد التلقيح، في حين يبقى إشارة قوية GFP، مشيرا إلى خلايا قابلة للحياة. هجرة SAOS2 الخلايا يمكن أن تكون موازية لتصور آنية CAM (الشكل 3). عندما لاحظ من خلال stereomicroscope، ويمكن رؤية الأوعية الدموية عندما يتم استخدام أي مرشح. الخلايا السرطانية لا يمكن تمييزها عندما لا Fيتم استخدام التر. فإنه ليس من الممكن تصور الأوعية الدموية عندما يتم إدراج مرشح GFP. عن طريق تحويل مرشح وخارجها، ويمكن أن ينظر إلى الاتصال الوثيق بين الخلايا المهاجرة والأوعية الدموية. ويمكن ملاحظة نزيف نقطي الشكل من خلال لوحة (الشكل 4، الصفوف 1 و 2). لويحات التي تحتوي على خلايا SW1353 تظهر انخفاضا في السطح، وتميل إلى التعاقد مع CAM، مما أدى إلى غشاء التجاعيد بعد الحصاد عليه (الشكل 4، الصفوف 5 و 6). إشارة DSR النقصان كما يصبح التحقيق الفلورسنت المخفف بعد العديد من الانقسامات الخلوية. من يوم 7، وكثيرا ما لوحظ نزيف. إذا كان النزيف يحدث، يقلل من إشارة DSR أيضا.

رد فعل الأوعية الدموية يمكن تصور بعد استئصال CAM في عرض الدنيا، تظهر الأوعية متعرج المحيطة الكسب غير المشروع أو لوحة (الشكل 2). ويلاحظ رد فعل الأوعية الدموية في CAM في المجموعة tumorgraft، المجموعة تعليق خلية واحدة (<STRONG> الشكل 2C و2F) وECM هلام المجموعة الضابطة (الشكل 2G)، ولكن ليس في مجموعات المراقبة حل الخلية (الشكل 2H). ويمكن ملاحظة السفن متعرج الجديدة التي تدخل عينة، المتفرعة (الشكل 2I، النصال) وanastomosing (الشكل 2I، العلامات النجمية) مع بعضها البعض؛ أيضا مناطق صغيرة من النزيف يحدث (الشكل 2I، السهام). اتساع الأوعية الدموية للورم يمكن كميا على H & E الشرائح في مناطق مختلفة من لوحة ورم / ورم.

تبين الأدلة أن النسيجي SAOS2 خلايا الحفاظ على مظهر خلية واحدة في جميع أنحاء حجم كاملة من ECM هلام، مما تسبب في زيادة في سمك وقطر من لوحة. أنها تغزو طبقة أرومية متوسطة من CAM (الشكل 5A، سهم)، وبالتالي توسيع المسافة بين الأديم الباطن وطبقات الأدمة من CAM مثل سستة الافتتاح (الشكل 5A (الشكل 5B، سهم). عدد الخلايا ومجموعات الخلايا زيادة مطردة في الوقت المناسب، ويزيد عدد الخلايا غير التكاثري من يوم 7، وخصوصا على سطح اللوحة. لSW1353، يمكن أيضا أن تقلص CAM موضع تقدير على H & E الشرائح بالمقارنة مع H & E الشرائح من SAOS2.

على الرغم من موقعهم خارج الرحم للنمو، وجدنا أن السمات الأساسية والخصائص المناعى للأورام ساركوما الأصلي تم الاحتفاظ بها في CAM. وبالإضافة إلى ذلك تصبح الطعوم ورم revascularized كما يتضح من ظهور الكريات الحمراء كتكوت الأنوية، والطعوم ورم تصبح مخترقة من قبل الخلايا الليفية كتكوت والخلايا السرطانية من الكسب غير المشروع تسللوا إلى الأنسجة المضيفة CAM، مما يدل على الاعتمادية وروبوstness للمقايسة CAM (الشكل 6، أقحم اليسرى السفلى). لمزيد من المعلومات التفصيلية نشير إلى تميز الكلية وآخرون 14.

وقت الحصاد

عد خلية من خلايا Ki67 إيجابية وسلبية Ki67 يظهر زيادة مطردة في عدد الكلي للخلايا من يوم 4 لكل من خطوط الخلايا. بعد هذا اليوم العدد الكلي للخلايا لا تزال مستقرة. بعد سبعة أيام التلقيح، وعدد من الخلايا إيجابية Ki67 والعدد الكلي للخلايا يبدأ في الانخفاض. وحول عدد من الخلايا، وهناك علاقة ذات دلالة إحصائية بين المناطق الثلاث. ومع ذلك، لوحظ أن نسبة أكبر من خلايا مصابة Ki67 على مقربة من CAM، ونسبة أكبر من خلايا Ki67 سلبية على سطح اللوحة (الشكل 4، الصفوف 3 و 4 و 7 و 8).

مؤشر الانتشار لا تزال مستقرة نسبيا حتى بعد سبعة أيام التلقيح، في أوقات لاحقة ويبدأ أيضا في الانخفاض. وproliferatioمؤشر N من خط الخلية SW1353 هو أقل من ذلك بكثير (P <0.05) بالمقارنة مع خط الخلية SAOS2.

على الرغم من أن هناك علاقة ذات دلالة إحصائية بين المناطق الثلاث، فمن الضروري لحساب الحقول في جميع المناطق الثلاث في لوحة هلام ECM، كما نلاحظ نسبة أكبر من خلايا مصابة Ki67 على مقربة من CAM ونسبة أكبر من Ki67 سلبية خلايا على سطح اللوحة (الشكل 7).

الشكل 1
الشكل 1. نظرة عامة على البروتوكول. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل 2 الشكل 2. الصور التي التقطت أثناء الحصاد المخاوف الصف العلوي ومحاصيل من tumorgraft من غضروفية: A = في الموقع، B = عرض العليا في طبق بتري، C = أقل عرض في طبق بيتري. مخاوف الصف الأوسط حصاد تعليق خلية واحدة في ECM هلام: D = في الموقع، E = عرض العليا في طبق بيتري، F = أقل عرض. الصف السفلي G = التحكم matrigel، H = محلول الخلية، I = أقل عرض عرض المتفرعة الأوعية والنزيف. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

الشكل (3)
الشكل (3). صورة GFP من SAOS2

الشكل 4
الشكل 4. يعرض هذا الشكل صورا لكلا SAOS2 (العلوي 4 صفوف) وSW1353 (خفض 4 صفوف) في يوم 1-8 بعد التلقيح. الصف 1 (شريط مقياس 2 مم) يظهر صورا للCAM في الموقع من خلال stereomicroscope مع مرشح GFP. الصف 2 (شريط مقياس 2 مم) تظهر نفس العينات من خلال stereomicroscope في حين تنيره المصابيح من فوق. الصف 3 و 4 تظهر H & E (الصف 3، شريط مقياس 200 ميكرون) وKi67 الملطخة (الصف 4، شريط مقياس 200 أو 500 ميكرون) وصور النسيجي من نفس العينات. الصف 5 (شريط مقياس 2 مم) يظهر صورا للCAM في الموقع من خلال stereomicroscope مع فلتر DSR. الصف 6 (قكال بار 2 ملم) يظهر نفس العينات من خلال stereomicroscope في حين تنيره المصابيح من فوق. صف 7 و 8 تظهر H & E (الصف 7، شريط مقياس 200 ميكرون) وKi67 الملطخة (الصف 8، شريط نطاق 200 و 500 ميكرومتر) الصور النسيجي من نفس العينات. انقر هنا لعرض أكبر شخصية.

الرقم 5
الشكل 5. المقارنة من انتشار الخلايا السرطانية من SAOS2 وSW1353. A = النمو من SAOS2 B = نمو SW1353.

الشكل (6)
الشكل (6). ويمكن ملاحظة الكريات الحمراء كتكوت الأنوية في الشعيرات الدموية في جميع أنحاء الدرجة العالية من tumorgraft ساركومة (HE، 100X)، أقحم أقلغادر.

الرقم 7
الرقم 7. رسم بياني يوضح Ki67 + وخلايا Ki67 بمرور الوقت وفقا للمسافة من CAM لكل من خطوط الخلايا. المنطقة A = ضد CAM، منطقة C = سطح اللوحة، منطقة B = في منطقة بين A و C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقت التلقيح والحصاد

توقيت تم تنفيذ يوم من التلقيح باستخدام SAOS2 في ECM هلام (36 الحدب) وتنوعت بين النهار التطور الجنيني 5 و 10.

قبل يوم والحضانة 9، كان لا CAM باستمرار كبيرة بما يكفي لدعم هلام ECM طبقنا. عند الحصاد، وكان أحيانا الخلايا السرطانية المراد استردادها من CAM أعمق، وبعض العينات جل ECM كانوا يكذبون فضفاضة في الزلال أو على CAM. في أيام 5 و 6، كان من الصعب تجنب وضع الخلايا السرطانية على الجنين الفرخ، مما أدى إلى تشوهات فرخ أو الموت. من يوم 9، كان CAM تغطي تماما على سطح أسفل نافذة في معظم البيض، وثبت ECM لويحات هلام ملتصقة على CAM في لحظة الحصاد. ولذلك، وجدنا الوقت المثالي للتلقيح أن يكون يوم 9 من التطور الجنيني.

لتحديد الوقت الأمثل للحصاد، وكان حصاد SAOS2 وSW1353 بعد التواليذ 1، 2 (SAOS2-GFP فقط)، 4، 5، 6، 7 و 8 أيام بعد التلقيح، أو بين يوم والتطور الجنيني 10 و 17. بعد هذه الاختلافات، لوحظ وجود اختلاف في طول التطبيق على CAM 1-12 أيام.

نشرت نايتون فروق كبيرة في نمو الورم وعودة التوعي الورم وفقا لليوم التطور الجنيني في لحظة التطبيق عينة الورم 17. وأظهرت الخلية عد الخلايا Ki67 إيجابية وسلبية Ki67 زيادة مطردة في عدد الكلي للخلايا من يوم 4 لكل من خطوط الخلايا. هذا هو متطابقة مع الحقائق من Ausprunk وآخرون. 21، الذي ذكر أن الفترة اللازمة لإعادة التوعية يأخذ 72 ساعة. بعد إحصاء عدد الخلايا وحساب مؤشر الانتشار، يمكننا أن نفترض أن الخلايا المتناثرة في هلام ECM تنتشر بنشاط من يوم 4 حتى يوم 6 بعد التلقيح. على أساس القطر من لوحة، والعدد الكلي للخلايا ومؤشرالانتشار، فإننا نقترح أن الوقت المثالي لموسم الحصاد هو يوم 16 من التطور الجنيني، أو سبعة أيام بعد التلقيح.

الإطار الزمني المقترح يترك الباحثين نافذة من ستة أيام لتطبيق وكلاء في حين أن الخلايا تنتشر بنشاط، إما مرة واحدة في اليوم 4 بعد التلقيح أو يوميا خلال الإطار الزمني كله. لإدارة موضعي، يتم تطبيق مركب على سطح CAM. هذا الطريق هو الأكثر استخداما واحد، نظرا لإمكانية الوصول إلى CAM ببساطة عن طريق فتح قشر البيض / لاصق فيلم 22،23. على الرغم من أن إدارة الرابع هو ممكن عمليا، وصعوبة إدراج الإبر في الأوعية CAM وجود قيود الحرجة. يتم تطبيق مثبطات كيناز على أساس يومي 24؛ العلاج الكيميائي مرة واحدة أثناء التجربة. نحن نفترض أن إضافة مركب هو مرة واحدة ما يعادل من العلاج السريري مع السامة للخلايا من عوامل تثبيط الخلايا، التي تدار تقليديا مرة واحدة كل 3 أسابيع، في حين اضافسوف المجمع على أساس يومي تعكس جرعة يومية من مثبطات كيناز في الإعداد السريرية. ومع ذلك، يجب علينا أن نأخذ في الاعتبار أن إدارة موضعي سوف تظهر حركية مختلفة / الأيض مقارنة مع الفم أو الإدارة الرابع في المرضى.

أهمية هذه التقنية والتطبيقات المحتملة في المستقبل

الحفاظ على التشكل الخلية هو ذو أهمية قصوى عندما تستخدم مزارع الخلايا في نماذج ما قبل السريرية. استخدام المصفوفات خارج الخلية متجانسة مثل نوع الكولاجين أنا 25 أو 26 ECM هلام يستعيد بيئة الخلية السرطانية، والسماح لنمط نمو أكثر طبيعية.

وخلافا للفي المقايسات الجسم الحي، في فحوصات المختبر لا تحتوي على خلايا انسجة مثل خلايا الأوعية الدموية عائية، تسلل الخلايا المناعية أو خلايا ليفية المرتبطة بالسرطان اللازمة لإعادة تشكيل المكروية مكون للأورام 27. عندما يتم استخدام CAM-مقايسة لevaluatأيون من tumorgrafts، التي وصفناها نموذجي 'مخروط غزو' من CAM نحو tumorgrafts، مما يعكس تجنيد الخلايا اللحمية من فرخ من قبل tumorgraft 14.

يوفر CAM-مقايسة مزيج من استعادة المصفوفة خارج الخلية عن طريق ECM هلام وتوفير الخلايا المضيفة لإعادة تشكيل المكروية مكون للأورام. كما CAM وtumorgraft / لوحة يمكن الوصول إليها بسهولة، وإدارة المركبات بسهولة ويسر. وبهذه الطريقة، يتم فتح CAM-مقايسة آفاقا جديدة نحو التقييم قبل السريرية من أنواع الأورام نادرة مثل الأورام اللحمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقدمت الخلايا من خط الخلية غضروفية SW1353 التكرم الأستاذ الدكتور PCW هوغندورن والأستاذ الدكتور J. Bovée من جامعة لايدن، هولندا. نشكر J. Mestach وG. Wagemans للحصول على مساعدة فنية ممتازة، وG. دي بروين للرسم المهنية لمحة عامة عن بروتوكول لدينا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Line Nucleofector Kit V Amaxa VCA-1003
collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) Sigma Aldrich C6885
DMEM Invitrogen 41965-039
DMSO Sigma D8418
Dnase solution Sigma Aldrich DN25
G418 Invitrogen 11811031
Matrigel Sigma-Aldrich E1270
mouse primary monoclonal antibody Ki67 Dako Denmark MIB-1
Paraformaldehyde Fluka D76240
PBS Invitrogen 20012019
PBSD Invitrogen 14040083
peGFP-C1 vector Clontech 632470
Penicillin/streptomycin Invitrogen 15140163
RPMI Invitrogen 22409-015
Trypsin-EDTA solution Invitrogen 25300054
Vybrant cell-labeling DiI Lifetechnologies 22885
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10227
digital color camera Leica DFC 340 FX
Digital Egg Incubator Auto Elex Co R-COM 50
FACS BD Biosciences FACSAriaIII
Gentlemacs C-Tube Miltenyi Biotech 130-093-237
Gentlemacs Dissociator Miltenyi Biotech 130-093-235
Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol Miltenyi Biotech
Name Company Catalog Number Comments
semipermeable adhesive film (Suprasorb F) Lohmann&Rauscher 20468
stereo fluorescence microscope Leica M205 FA
Tissue-Tek Film automated Coverslipper Sakura 6400
ultraView Universal DAB Detection Kit Ventana Medical Systems Inc 760-500
Ventana Automated Slide Stainer Ventana Medical Systems Benchmark XT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
  2. Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
  3. Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
  4. Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
  5. Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
  6. Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
  7. Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
  8. Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
  9. DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
  10. Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
  11. Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
  12. Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  14. Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
  15. Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
  16. Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
  17. Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
  18. Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
  19. Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
  20. Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
  21. Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
  22. Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
  23. Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
  24. Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
  25. De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
  26. Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
  27. Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).

Tags

بيولوجيا السرطان، العدد 77، الطب، علم الأحياء الخلوية والبيولوجيا الجزيئية والهندسة الطبية الحيوية والهندسة الحيوية، والبيولوجيا التطورية، علم التشريح، علم وظائف الأعضاء، علم الأورام، جراحة، والأورام، والأنسجة الدهنية والأنسجة الضامة، الأورام، الأنسجة العضلية، والورم اللحمي، التجارب على الحيوانات، خلية ثقافة التقنيات، والأورام، التجريبية، الأورام زرع، الفحص البيولوجي، الأورام اللحمية، CAM-مقايسة، طعم أجنبي، والانتشار، والغزو، والسرطان، الورم،
ال<em&gt; في البيضة</em&gt; CAM-مقايسة باعتبارها Xenograftmodel عن الورم اللحمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, … More

Sys, G. M. L., Lapeire, L., Stevens, N., Favoreel, H., Forsyth, R., Bracke, M., De Wever, O. The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522, doi:10.3791/50522 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter