Summary
Abstract
육종은 모든 새로운 치료법의 개발을 방해, 자연 이기종 매우 드문 질환이다. 육종 환자는이 질병에 대한 재현성과 낮은 비용 xenotransplant 모델을 개발하여 현재 관심을 설명하는 층화 한 후 맞춤 의학을위한 이상적인 후보입니다. 병아리 융모 막은 종 별 제한없이 이식 조직과 세포를 유지 할 수있는 자연 면역 결핍 호스트입니다. 또한, 그것은 쉽게 액세스, 조작 및 광학 및 형광 실체 현미경을 사용하여 몇 군데 있습니다. 조직학 더 이형 세포 상호 작용에 대한 자세한 분석을 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 자세히 설명 신선한 육종 파생 된 종양 조직들은 단일 세포 현탁액, 영구 및 임시 찬란 설립 육종 세포주 (SAOS-2 SW1353)와 융모 막으로 접목 OVO에서. 병아리 생존 쥐ES는 75 %입니다. 모델은 이식편 (생존, Ki67 확산 지수, 괴사, 침투) 및 호스트 (섬유 아세포의 침윤, 혈관 안쪽으로의 성장) 행동을 연구하는 데 사용됩니다. 단일 세포 현탁액의 접목 지역화를 들어, ECM 젤 불활성 억제 물질에 비해 상당한 이점을 제공합니다. Ki67 확산 지수는 CAM의 표면에서 세포의 거리와 CAM, 치료 제품의 추가에 대한 시간 프레임을 결정하는 후자의 응용 프로그램의 지속 기간에 관련되어 있습니다.
Introduction
육종 치료 저항 1,2로 인해 높은 사망률을 가진 결합 조직의 드문 종양이다. 환자의 생존에 진행 그들의 낮은 연간 발생률, 자신의 폭 넓은 다양성 및 육종 세포가 체외 3,4의 문화를 열심히보고 있다는 사실에 의해 방해된다.
임상 치료 평가를위한 배양 세포의 사용은 체외에서 새로운, 분명히 활성 분자가 항상 임상 결과를 반영하지 않는 것으로 나타났습니다. 또한, 유전자 발현 배열에 의해 밝혀 게놈 변이는 항상 5-7 개별 환자에서 종양의 행동 특성에 상관하지 않습니다. 이러한 문제를 시도하고 해결하기 위해, 맞춤 의학은 이종 이식 모델에 8-12에 대한 증가 된 검색에 반영됩니다 중요성에 얻고있다.
생체 분석의는 C 사이의 복잡한 상호 작용을 반영하는 장점이 있습니다암 증식과 침윤 13에 필요한 ancer 세포와 고체 종양의 호스트 조직 환경. 현재 우리는 육종 14,15을위한 재현 이종 이식 모델로 리오 - Allantoic 막 분석 (CAM-분석)의 사용을 공부합니다. 이 분석은 널리 종양의 혈관 신생 16,17의 연구에 사용됩니다. 다른 연구는 서로 다른 프로토콜 18,19에 따라 성장 또는 혈관에 표시된 차이를 관찰하면서 문학에서는, 그러나, 우리는이 분석을 위해 다른 프로토콜을 발견했습니다.
이 문서에서 우리는 종양 이식, 종양 파생 된 단일 세포 현탁액과 전통 육종 세포 배양을 사용하여 세포 행동에 CAM-분석의 조건을 변화의 효과를 조사합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
개요 그림 1을 참조하십시오
종양 물질
1. 종양 샘플을 얻기 및 준비
환자 물질의 사용을위한 윤리위원회의 승인이 필요하며, 동의는 환자에서 얻을 수합니다.
- 개입의 시점에서 수확 대표적인 물질 (최소 1cm 3), 생검 또는 육종의 절제 하나. 생검의 적절한 위치는 동적 대비 MRI를 사용하여 정의됩니다.
- DMEM 1,000 U 페니실린 1 MG / ML 스트렙토 마이신과 보충 포함하는 멸균 병에 즉시 자료를 놓습니다.
- 실험실 - 즉시 병 (90 분 30) 수송한다.
다음의 모든 절차는 층류에서 수행됩니다.
- 멸균 페트리 접시에 유리 병의 내용물을 붓는다.
- 최대한 1m의 작은 부분에 종양 샘플을 넣어m 3 멸균 메스를 사용하여. 그들은 조직의 추가 처리를 손상하는 경향 모두 석회화 된 부분을 제거합니다.
- 무작위 CAM의 응용 프로그램을위한 10 종양 이식을.
2. 종양 파생 된 단일 세포 현탁액의 준비
대략 시간 : 3 시간
- 샘플의 잔여 조직을 무게.
- 2 - dissociator 관 조직의 4g 하나 이상의 관은 나머지 모든 종양 조직을 소화해야 할 수 있습니다.
- 2 소화 - 조직의 4g, 2.5 ML 콜라게나 제 2 용액 (500 U / ML RPMI 1640) 2.5 ML DNase의 용액 (22 KU / ML RPMI 1640)을 추가합니다.
- dissociator의 h_tumor 프로토콜에 따라 조직을 처리합니다. 관은 30 분 동안 가볍게 흔들어 중일 때 37 배양의 2 사이클 ° CO 2 배양기에서 C를 포함한다.
- 150 μm의 셀 스트레이너를 통해 남아있는 현탁액을 필터링합니다.
- 5 마일 1,000 rpm에서 해물을 원심 분리기N.
- 상층 액을 제거합니다.
- 일반 서스펜션 배양의 10 분을 허용, 적혈구 용해 버퍼 (ELB)의 10 ML에 펠렛을 resuspend을.
참고 : 적혈구 용해 버퍼는 다음과 같이 제조 : 0.037 g EDTA, 0.99 g K 2 HPO 4, 1,000 ml로 물에 8.29 g NH 4 망할 CIA를 추가, 0.22 μm의를 통해 압력 필터 7.3 산도를 조정하기 10 N 수산화 나트륨을 사용 필터링합니다. 4 ° C.에 저장
- 반응을 정지 배양 배지 (DMEM이 10 % 태아 소 혈청, 100 U / ML 페니실린, 100 ㎍ / ㎖ 스트렙토 마이신과 보충)의 25 ML을 추가합니다.
- 5 분 1,000 rpm으로 현탁액을 원심 분리기. 펠렛의 색은 이제 흰색이어야한다.
- 상층 액을 제거합니다.
- 펠렛 매체의 5 ML을 추가합니다. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 현탁액을 필터링합니다.
- 자동 셀 카운터를 통해 살아있는 세포 / ㎖의 수를 계산합니다.
3. Cancer 세포주
SAOS2 골육종 세포 (ATCC 번호 : HTB-85) 강화 된 녹색 형광 단백질을 발현는 제조 업체의 프로토콜에 따라 세포 라인 Nucleofector 키트 V를 사용하여 peGFP-C1 벡터에 electroporation하여 하였다. 안정적인 세포 라인을 확립하기 위해, 형질 세포는 이전에 설정된 프로토콜 20 라인에 4 주 동안 G418 (1 ㎎ / ml)에 선정되었다. 또한 정렬은 제조업체의 지침에 따라 형광 활성화 된 셀 정렬 (FACS)에 의해 수행되었다.
SW1353 연골 세포주 (ATCC 번호 : HTB-94)에서 세포 또는 갓 준비한 종양의 단일 세포 현탁액은 빨간색 형광 친 유성 막 얼룩을 사용하여 레이블이 표시됩니다.
- 솔루션, 트립신 (0.5 % 중량 / 부피) 에틸렌 산 (0.2 % 중량 / 부피 EDTA)를 사용하여 고전적인 방법으로 배양 플라스크에서 세포를 제거합니다.
- 1,000 rpm에서 5 분 세포 현탁액을 원심 분리기.
- supern을 제거atant.
- 혈청이없는 배지 5 μL DII (Vybrant 레드) / 10 6 세포의 1 ML을 추가합니다.
- 알루미늄 호일 유리 병을 포장하고 37 10 분 ° C.에 대한 CO 2 배양기에 넣어
- 1,000 rpm에서 5 분간 다시 원심 분리하여 그 상등액을 제거합니다.
융모 막 분석
1. 달걀 보육
- 계란의 95 %의 수정을 보장하는 지역의 상업 부화장에서 수정란이 필요합니다.
- 유정란 10 일 RT에서 최대 저장할 수 있습니다.
참고 : 부화를 시작하기 전에, 먼지, 깃털과 배설물주의 깊게 오히려 부드러운 표면 구조보다 거친이 종이 수건, 마른 걸레질에 의해 기계적으로 달걀 껍질에서 제거됩니다. 70 % 변성 에탄올 또는 다른 청소 시약 계란을 닦아 상당히 병아리 배아의 생존율을 감소시킨다.
- incub에 계란을 넣어한쪽 ATOR, 상부면을 표시. 계란 인큐베이터에 넣을 수있는 날이 배아 발달의 0 일 지정됩니다.
- 37.8 ° C에서 배양 온도 및 47 %의 습도를 설정합니다. 자동 회전 옵션이 꺼져 있는지 확인합니다.
2. 계란 열기
기간 : 25 계란 ± 60 분
개발 3 일에, 계란은 층류에서 열립니다. 막 껍질에 집중하는 경향으로, CAM에 손상이 더 발달 단계의 결과에서 알을 열기. 적외선 램프 절차를 수행하는 동안 알을 따뜻하게 유지하는 데 사용됩니다. 불임을 개선하기 위해, 우리는 손 장갑의 사용을 권장합니다.
- 위쪽을 향하도록 표시된면, 껍데기에 계란을 넣습니다.
- 계란의 끝에 삽입 18 G 바늘을 통해 알부민의 두 ML을 제거하여 CAM 수준을 낮 춥니 다. 바늘이 여러 천공 후 무딘 경우달걀 껍질은 바늘을 교체합니다. 그렇지 않은 경우, 너무 많은 힘은 계란 노른자 나 쉘의 골절에 손상이 가해 져야한다. 때때로 바늘 chalazae, 알부민의 노른자를 중단 2 나선형 밴드 중 하나에 의해 차단됩니다. 이 블록이 해결 될 때까지 조심스럽게 아래로 플런저를 밀어 해결할 수 있습니다. 달걀 노른자는 주사기로 흡입하는 경우, 바늘뿐만 아니라 주사기를 교체하십시오. 때때로 배아는이 이벤트 후에 죽는다. 알부민의 부족 금액이 제거되면 쉘이 제거 될 때, CAM이 손상 될 수 있습니다.
- 창을 절단하면서 CAM에 쉘 입자의 유출을 방지하기 위해 쉘 표시된 상단에 반투과성 접착 필름을 적용합니다.
- 계란의 표면에 작은 송곳 소개 구멍을 만든다.
- 멸균 뾰족한 외과 가위를 사용하여, 쉘에서 1cm 2의 창을 잘라.
- 태아의 박동 심장과 인접한 혈관이 일에 관찰 할 수있다계란 노른자의 전자 표면. 비 수정란이나 죽은 태아를 제거합니다. 혈관의 중단 점은 죽은 배아를 특징.
- 반투과성 접착 필름 창을 밀봉하십시오. 쉘이 바늘의 삽입시 금 않는 한 그것은 빵꾸 사이트를 포함 할 필요가 없습니다.
3. 접종 절차
기간 : 셀 라인 당 ± 1 시간
병아리 배아 발달의 날 9, 계란 층류에서 접종한다.
CAM에 걸쳐 확산 암 세포의 평가는 접종 기간 동안 제한된 표면 세포의 억제가 필요합니다. 마트 리젤 자주 실험 세포 배양 조건에서 사용되는 Engelbreth-홀름 - 떼 마우스 육종에서 세포 외 기질 (ECM) 젤입니다. 그것은 냉각하면 액체이지만, 20 왔을 때 열적 활성화 중합을 받게 될 것이다 - 40 ° C, 따라서 안정된 겔을 형성합니다. 시실험은 마트 리젤은 얼음이 녹는를 포함하는 상자에 보관됩니다.
참고 : 천공의 coverslips를 사용하지 않는 주장한다. 따라서 우리는 막 자체에 세포의 성장 잠재력을 바이어스 플라스틱 디스크에 부착 및 이식 암 세포의 성장을 관찰했다.
- 10 6 cells/100 μL ECM 젤의 농도로 냉각 ECM 젤의 세포 펠렛을 resuspend을. 얼음이 녹는에이 솔루션을 유지한다.
- 층류에 따라 불임 수술의 한 쌍의 반 투과 막 소비세 부분입니다. 접착 필름이 완전히 제거되면,이 오염에 의한 배아 사망의 더 큰 비율로 발생합니다.
- 상피 세포 층을 제거하기 위해, 멸균 유리 봉으로 가볍게 쉘 창 아래 CAM 오른쪽을 터치합니다. 멸균 유리 막대와 CAM을 터치하면 메스 N ° 11, 더 솜씨 좋음과 경험을 필요로 사용하는 것보다 적은 충격으로 증명한다. 작은 출혈이 발생할 수 있습니다.
- 종양의 자료를 dding.
- 종양 이식의 경우 : 그것을 짜지 않고 멸균 포셉 한 쌍의 CAM 상 조직의 부드럽게 낮은 원피스.
- ECM 젤 절차 : ECM 젤 응용 프로그램 사이에서 중합 할 수 있도록 서로의 상단에 CAM에 세포 ECM 겔 현탁액의 배 25 μl를 추가합니다. 이 방법으로 암 세포를 포함하는 접착 플라크가 생성됩니다.
- 반투과성 접착 필름으로 다시 쉘 창을 밀봉하십시오.
4. 이미징 및 CAM의 수확
기간 : 25 계란 2 시간
병아리 배아 발달의 날 16 일 캠 수확된다. 층류에서 작업 할 필요가 없습니다.
- 외과 가위로 창을 확대합니다. 손상된 혈관의 출혈의 결과로, 그렇지 않으면 CAM이 손상 될 수 있습니다, 너무 낮은 잘라하지해야합니다.
- 300를 추가 - PBS D 500 μl를 CAM 분파 위에 피펫접종 물질을 포함하는 이온. 아무 형광 프로브를 사용하지 않는 경우이 막 엄격한 만들면서, 버퍼 포름 알데히드는 멤브레인의 절단을 용이하게 사용할 수 있습니다.
- GFP 또는 DSR 필터 및 필터 없음 모두를 사용하여 디지털 컬러 카메라가 장착 된 스테레오 형광 현미경을 통해 계란 CAM의 사진을 확인합니다. 종양 이식의 경우, 모든 사진은 필터없이 만들어집니다. LED 조명으로 위의 조명은 강하게 (그림 2) 촬영 중에 권장합니다.
- 레이블 세포에 대한 기록 종양 세포의 이동. 종양의 경계가 불규칙 마모 될 수 있습니다. 흩어져 세포는 종양의 국경 근처에있을 수 있습니다. 일부 표본에서 종양 세포의 행 (그림 3) 관찰 할 수 있습니다.
- 쉘에 누워 국경에서 멸균 가위로 막 잘라.
- PBS D로 가득 차 또는 버퍼 멸균 페트리 접시에 수확 CAM를 배치maldehyde.
- 상부와와와 필터가없는 두 CAM의 아래쪽, 모두의 사진을 확인합니다.
- 최소 72 시간 동안 버퍼 포름 알데히드라는 컨테이너에 막 넣어.
- 파라핀 캠을 포함하고 조직 학적 검사를 위해 그들을 준비합니다. 절단 표면 카세트의 바닥에 평행하게 확인하고, 결절의 중심에 종양 이식을 절단하는데주의를 기울여야. 그렇지 않은 경우, CAM 및 종양 이식 사이의 상호 작용은 표시되지 않습니다. 같은 전략은 ECM 젤 패에 적용 칼날에 직면 표면은 플라크에 수직이어야한다.
5. 조직 학적 평가
필요한 경우 헤 마톡 실린 - 에오신 염색 및 기-67 면역은 자세한 설명을 위해 수행되었다. 면역은 따라 자동 슬라이드 염색기를 사용하여 두께 3.5 ㎛의 포르말린 고정 파라핀 조직 절편에서 수행되었다제조업체의 지침에. 기-67 (클론 MIB-1, 희석 1 / 100)에 마우스를 기본 단클론 항체를 사용 하였다. 열을 유발 에피토프 검색은 세포 컨디셔닝 1을 사용하여 수행되었으며, 시각화 범용 DAB 검출 키트에 달성되었다, 제조 업체의 지침에 따라. 조직 섹션의 Dehydratation은 자동 coverslipper를 사용하여 수행 하였다.
SAOS2과 SW1353 세포주, Ki67 양성과 Ki67 부정적인 세포 nuclei/100 μm의 2의 수는 세 영역에서 계산 하였다 : 하나 가까이 CAM의 경계로, 하나는 중앙의 표면을 닫습니다 ECM 젤 패. 이 절차는 각 기-67 스테인드 슬라이드 배 반복되었다. 증식 지수는 계산 세포의 총 수에 의해 Ki67-양성 세포의 수를 나누어 각 슬라이드에 대해 결정되었다.
괴사 파디 함께 세포의 핵에서 염색질의 좋은 분산의 손실에 의해 정의된다별개의 셀 여백의 NG. 이종 이식의 경우, 괴사 완료 (보통 표면) 부분, 또는 결석으로 채점됩니다. CAM에 종양 세포의 침윤은 CAM의 중배엽에서 종양 세포의 관찰에 의해 정의되며, 현재 또는 결석으로 채점됩니다.
세 가지 항목은 호스트 동작을 채점됩니다. 섬유 아세포의 침윤은 길쭉한 세포가 CAM을 떠나 종양 이식 / 패를 침입으로 정의되며, 현재 또는 결석으로 채점됩니다. 혈관 안쪽으로의 성장은 핵 병아리 적혈구의 존재에 의해 특징 병아리 혈관을 증식의 안쪽으로의 성장으로 관찰 할 수있다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
CAM의 평가
종양 이식은 CAM (그림 2A)에 부착된다. 환자의 자료에서 단일 세포 현탁액 자주 건조, 약간 올라와 플라크 (그림 2D)를 표시합니다. CAM의 절단 후, 막의 주름 (2E와 2F 그림) 발생 표시.
상업 세포주 플라크는 세포 증식을 나타내는 시간에 더 많은 불투명됩니다. ECM 젤 다른 세포 라인은 CAM에 별개의 성장 패턴이 있습니다. GFP 신호가 강하게 남아있는 동안 SAOS2가 가능한 세포를 나타내는 접종 후 7 일에서 표면의 뚜렷한 증가, 확산 플라크를 형성한다. SAOS2 세포의 마이그레이션 CAM의 혈관 시각화 병렬 (그림 3)이 될 수 있습니다. 필터가 사용되지 않을 때 실체 현미경을 통해 관찰 할 때, 혈관을 볼 수 있습니다. 없을 때 F 종양 세포가 식별 될 수 없습니다ilter가 사용됩니다. 그것은 GFP 필터가 삽입 될 때 혈관을 시각화 할 수 없습니다. 오프 필터를 켜고으로 마이그레이션 세포와 혈관 사이의 긴밀한 접촉을 볼 수 있습니다. Punctiform 출혈은 플라크 (그림 4를 통해 관찰 할 수있다 행 1과 2). SW1353 세포를 포함하는 패 표면의 감소를 보여하고 (그림 4 행 5, 6) 수확 후 주름이 막 그 결과, CAM를 계약하는 경향이있다. 형광 프로브는 많은 세포 분열 후 희석되면서 DSR 신호가 감소한다. 7 일에서 출혈이 자주 관찰된다. 출혈이 발생하는 경우, DSR 신호도 줄어 듭니다.
혈관 반응은 이식이나 플라크 (그림 2) 주변의 구불 구불 한 혈관을 보여주는, 아래보기에서 CAM의 절제 후 시각화 할 수 있습니다. CAM의 혈관 반응 tumorgraft 그룹, 단일 세포 현탁액 그룹 (<에서 관찰된다강해> 그림 2C 및 2 층) 및 ECM 젤 대조군 (그림 2G),하지만 세포 솔루션 대조군 (그림 2H). 새로운 꼬불 꼬불 한 혈관 분기 (그림 2I, 화살촉)와 anastomosing (그림 2I는, 샘플을 들어 볼 수있다 또한 출혈의 작은 영역 (그림 2I, 화살표)가 발생, 서로 별표). 종양의 혈관 신생은 종양 / 종양 패의 서로 다른 영역에서 H & E 슬라이드를 정량화 할 수있다.
조직 학적 증거가 SAOS2 세포가 증가 두께와 플라크의 직경을 일으키는 원인이 ECM 젤의 전체 볼륨에 걸쳐 단일 셀 모양을 유지하는 것을 보여줍니다. 그들은 따라서 개방 지퍼 같은 내배엽과 CAM의 외배엽 층 사이의 거리 (그림 5A 확대, CAM의 중배엽 층 (그림 5A, 화살표)를 침략 (그림 5B, 화살표)와 함께 클러스터 된. 세포와 세포 클러스터의 수는 시간이 꾸준히 증가하고, 특히 플라크의 표면에서 7 일까지 비 증식 세포의 수가 증가. SW1353의 경우, CAM의 수축은 SAOS2의 H & E 슬라이드에 비해 H & E 슬라이드를 감상 할 수 있습니다.
성장의 자신의 이소성 위치에도 불구하고, 우리는 중요한 기능과 원래의 육종 종양의 면역 조직 화학적 특성 CAM에서 유지 된 것으로 나타났습니다. 종양 이식은 신뢰성과 robu을 보여주는 CAM 호스트 조직을 침투 이식에서 병아리 섬유 아 세포 및 종양 세포에 의해 침투 될 핵 병아리 적혈구의 모양에 의해 입증되는 것과 같이 또한 종양 이식은 revascularized가CAM 분석의 stness (그림 6, 삽입 왼쪽). 더 자세한 내용은 우리가 시스 등을 참조하십시오. 14.
수확 시간
Ki67 양성과 Ki67 음성 세포의 세포 계수는 세포주 모두 4 일의 세포의 총 수의 꾸준한 증가를 보여줍니다. 이 날 이후 세포의 총 수를 안정적으로 유지. 칠일 접종 후, Ki67-양성 세포와 세포의 총 수의 수가 감소하기 시작합니다. 세포의 수와 직결 된 세 가지 영역 사이에 유의 한 상관 관계가있다. 하지만, Ki67 양성 가까운 CAM에 세포와 플라크의 표면에서 Ki67 부정적인 세포의 큰 비율의 큰 비율은 (그림 4 행 3, 4, 7, 8) 관찰된다.
확산의 인덱스 칠일 접종 후까지 비교적 안정적으로 유지, 그것은 또한 감소하기 시작 whereafter. proliferatioSW1353 세포주 N 인덱스가 현저히 감소 (P <0.05) SAOS2 세포주에 비해.
세 가지 영역 사이에 유의 한 상관 관계가 있지만 우리가 가까이 CAM에 Ki67-양성 세포의 큰 비율과 Ki67 음성의 큰 비율을 관찰로, 그것은 ECM 젤 플라크의 세 지역에서 필드를 계산하는 것이 필수적입니다 플라크의 표면에서 세포 (그림 7).
그림 1. 프로토콜의 개요. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 2. 사진은 수확 중에 찍은 연골에서 tumorgraft의 수확 어퍼 행 관심사 :. = 현장에서, B 페트리 접시, C에서 = 위보기 페트리 접시에 = 낮은 볼 수 있습니다. ECM 젤 단일 세포 현탁액의 수확 가운데 행 문제 : D = 현장에서, E 페트리 접시에 = 위보기, F = 낮은 볼 수 있습니다. 아래 줄 G = 리겔 제어, H = 셀 솔루션 제어, 나는 분기 혈관 출혈을 표시 = 낮보기. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
그림 3. SAOS2의 GFP 사진 
그림 4. 예방 접종. 행 1 (눈금 막대 2mm)는 GFP 필터 입체 현미경을 통해 현장에서 CAM의 사진을 보여줍니다 후이 수치는 8 일 1시 SAOS2 (4 행 위)와 SW1353 모두의 사진을 (4 행 이하)을 보여줍니다. 2 행 (눈금 막대 2mm)는 위의 LED로 조명하면서 입체 현미경을 통해 동일한 샘플을 보여줍니다. 행 3과 4는 H & E (행 3, 스케일 바 200 μm의)와 Ki67 염색을 표시 (행 4, 스케일 바 200 500 μM) 같은 샘플. 행 5 (눈금 막대 2mm)에서 조직 학적 이미지 DSR 필터 입체 현미경을 통해 현장에서 CAM의 사진을 보여줍니다. 행 6 (들케일 줄 2mm)는 위의 LED로 조명하면서 입체 현미경을 통해 동일한 샘플을 보여줍니다. 행 7과 8은 H & E (행 7, 스케일 바 200 μm의)와 Ki67 염색을 표시 (행 8 스케일 바 200, 500 μM) 같은 샘플에서 조직 학적 이미지. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 5. SAOS2 및 SW1353의 종양 세포 증식의 비교. SAOS2의 A = 성장 B = SW1353 성장. 
그림 6. 낮은 핵 병아리 적혈구가 (HE, 100X) 높은 등급의 지방 육종의 tumorgraft을 통해 모세 혈관에서 관찰 할 수 삽입왼쪽. 
그림 7. 두 세포 라인에 대한 CAM의 거리에 따라 시간이 지남에 따라 +와 Ki67 세포 Ki67을 표시합니다. 존 CAM에 대하여 A = 그래프, 영역 C 플라크 = 표면, 영역 B =의 사이 영역 A와 C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
접종 수확 시간
예방 접종의 날이 ECM 젤 (36 캠의)에 SAOS2을 사용하여 수행 및 배아 발달의 날 5와 10 사이에서 변화시켰다 타이밍.
배양 9 일 전에, CAM는 지속적으로 우리가 적용 ECM 젤을 지원하기에 충분히 큰되지 않았습니다. 수확에서 종양 세포는 때때로 깊은 CAM에서 검색 할 수 있고, 일부 ECM 젤 샘플은 알부민 또는 CAM에 느슨한 거짓말을 하였다. 일 5, 6, 그것은 병아리 기형 또는 사망의 결과로, 병아리 배아에서 종양 세포를 가하고 방지하기 힘들었다. 9 일부터 CAM 완전히 대부분의 계란 창 아래의 표면을 덮고 있었고, ECM 젤 패 수확의 순간 CAM에 부착 증명했다. 그러므로, 우리는 배아 발달의 날 9 할 접종을위한 이상적인 시간을 발견했다.
수확의 이상적인 시간의 결정에 대해, SAOS2 및 SW1353은 respectivel 후 수확 하였다Y 1, 2 (SAOS2-GFP 만 해당), 4, 5, 6, 7, 8 일 지점 접종, 10 배아 발달의 날 사이 17. 십이일 - 이러한 변화에 따라, CAM의 응용 프로그램의 길이 차이는 1에서 관찰되었다.
나이 종양 샘플 응용 프로그램 17 순간 배아 발달의 날에 따라 종양의 성장 및 종양 혈관 재개 통술의 표시 차이를 발표했다. Ki67 양성과 Ki67 부정적인 세포 계수 세포는 세포주 모두 4 일의 세포의 총 수의 꾸준한 증가를 보여 주었다. 이 Ausprunk 등의 연구 결과와 조화 된 것입니다. 재관류에 필요한 기간이 72 시간이 걸립니다 것을 주장 21. 세포 증식 지수의 계산의 수를 계산 한 후, 우리는 ECM 젤에 분산 세포가 적극적으로 접종 후 6 일까지 4 일에서 확산되는 것으로 가정 할 수 있습니다. 플라크의 직경, 세포의 총 수와의 인덱스에 따라확산, 우리는 수확을위한 이상적인 시간이 배아 발달, 또는 칠일 접종 후 하루 16 것이 좋습니다.
세포가 적극적으로 하루에 한 번 4도, 확산하는 동안 제안 된 시간 프레임은 접종 후 또는 매일 전체 기간 동안 연구자 에이전트의 응용 프로그램을위한 6 일간의 창을 떠난다. 국소 관리를 위해, 화합물 CAM 표면에 적용됩니다. 이 경로는 일반적으로 단순히 껍질 / 접착 성 필름 22,23을 열어 때문에 CAM에 대한 액세스를 하나 사용됩니다. IV 투여가 가능하지만, CAM 혈관에 바늘을 삽입하는 어려움은 중요한 제한 사항입니다. 키나제 억제제는 매일 24 적용, 화학 요법은 한 번 실험 기간 동안. 추가하는 동안 우리는 화합물을 추가하면 한 번 고전 매 3 주 후에 관리되는 세포 증식 억제 에이전트의 세포 독성과 임상 치료에 해당합니다 가설매일 화합물은 임상 설정에서 키나제 억제제의 매일 복용량을 반영합니다. 그러나, 우리는 국소 투여 환자에서 경구 또는 IV 투여에 비해 다른 반응 속도 / 신진 대사가 표시됩니다 것을 명심해야합니다.
기술과 향후 응용 프로그램의 의의
세포 배양은 전임상 모델에서 사용할 때 세포 형태의 보존이 가장 중요합니다. 콜라겐 유형 I 25 ECM 젤 26으로 균일 한 세포 기질의 사용은 자연적인 성장 패턴을 허용, 종양 세포 환경을 복원합니다.
생체 분석에 반대, 체외 분석에서 이러한 재구성 발암 미세에게 27에 필요한 면역 세포 나 암 관련 섬유 모세포 세포를 침투 혈관 혈관 세포 등의 기질 세포가 포함되어 있지 않습니다. CAM-분석은 evaluat에 사용하는 경우tumorgrafts의 이온, 우리는 tumorgraft가 14만큼 병아리에서 기질 세포의 채용을 반영 tumorgrafts으로 CAM에서 전형적인 '침략 콘'을 설명했습니다.
CAM-분석은 ECM 젤에 의해 세포 외 기질을 복원하고 발암 미시의 재구성을위한 숙주 세포를 제공하는 조합을 제공합니다. CAM 및 tumorgraft / 플라크가 쉽게 접근이기 때문에, 물질의 관리가 용이합니다. 이러한 방법으로, CAM-분석은 육종 등 드문 종양 유형의 전임상 평가 향해 새로운 관점을 엽니 다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
SW1353 연골 세포주의 세포는 친절 교수 PCW Hogendoorn와 라이덴 대학, 네덜란드의 교수 J. Bovée에 의해 제공되었다. 우리는 우리의 프로토콜의 개요의 전문적인 드로잉 J. Mestach 및 G. Wagemans 우수한 기술 지원 및 G. 드 Bruyne 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
- Mankin, H. J., Hornicek, F. I., Rosenberg, A. E., Harmon, D. C., Gebhardt, M. C. Survival data for 648 patients with osteosarcoma treated at one institution. Clinical Orthopaedics and Related Research. 429, 286-291 (2004).
- Hoffmann, J., Schmidt-Peter, P., et al. Anticancer drug sensitivity and expression of multidrug resistance markers in early passage human sarcomas. Clinical Cancer Research. 5, 2198-2204 (1999).
- Greenlee, R. T., Hill-Harmon, M. B., Murray, T., Thun, M. Cancer statistics, 2001. CA A Cancer Journal for Clinicians. 51, 15-36 (2001).
- Gil-Benso, R., Lopez-Gines, C., et al. Establishment and characterisation of a continuous human chondrosarcoma cell line, ch-2879: Comparative histologic and genetic studies with its tumor of origin. Laboratory Investigations. 83, 877-887 (2003).
- Taylor, B. S., Barretina, J., et al. Advances in sarcoma genomics and new therpeutic targets. Nature Reviews Cancer. 11, 541-557 (2011).
- Skubitz, K. M., D'Adamo, D. R. Sarcoma. Mayo Clinic Proceedings. 82, 1409-1432 (2007).
- Nielsen, T. O., West, R. B. Translating gene expression into clinical cara: sarcomas as a paradigm. Journal of Clinical Oncology. 28, 1796-1805 (2010).
- Vaira, V., Fedele, G., Pyne, S. Preclinical model of organotypic culture for pharmacodynamic profiling of human tumors. Proceedings of the National Academy of Science USA. 107, 8352-8356 (2010).
- DeRose, Y. S., Wang, G., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17, 1514-1520 (2011).
- Tentler, J. J., Tan, A. C., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nature Reviews Clinical Oncology. 9, 338-350 (2012).
- Bertotti, A., Migliardi, G., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discovery. 1, 508-523 (2011).
- Decaudin, D. Primary human tumor xenografted models ('tumorgrafts') for good management of patients with cancer. Anticancer Drugs. 22, 827-841 (2011).
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Sys, G., Van Bockstal, M., et al. Tumor grafts derived from sarcoma patients tumor morphology, viability, and invasion potential and indicate disease outcomes in the chick chorioallantoic membrane model. Cancer Letters. 326, 69-78 (2012).
- Armstrong, P. B., Quigley, J. P., Sidebottom, E. Transepithelial invasion and intramesenchymal infiltration of the chick embryo chorioallantois by tumor cell lines. Cancer Research. 42, 1826-1837 (1982).
- Deryugina, E., Quigly, J. Chick embryo chorioallantoic membrane model systems to study and visualize human tumor cell metastasis. Histochemistry and Cell Biology. 130, 1119-1130 (2008).
- Knighton, D., Ausprunk, D., Tapper, D., Folkman, J. Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo. British Journal of Cancer. 35, 347-356 (1977).
- Dohle, D. S., Pasa, S. D., Gustmann, S., Laub, M., Wissler, J. H., Jennissen, H. P., Dünker, N. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J. Vis. Exp. (33), e1620 (2009).
- Balke, M., Neumann, A., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Research Notes. 3, 58 (2010).
- Hendrix, A., Maynard, D., et al. Effect of the secretory small GTPase Rab27B on breast cancer growth, invasion, and metastasis. Journal of the National Cancer Institute. 102, 866-880 (2010).
- Ausprunk, D., Knighton, D., Folkman, J. Vascularization of normal and neoplastic tissues grafted to the chick chorioallantois: role of host and preexisting graft vessels. American Journal of Pathology. 79, 597-618 (1975).
- Lokman, N. A., Elder, A. S. F., Riciardelli, C., Oehler, M. K. Chick Chorioallantoic membrane (CAM) Assay as an in vivo model to study the effect of newly identified molecules on ovarian cancer invasion and metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 13, 9959-9970 (2012).
- Vargas, A., Zeisser-Labouèbe, M., Lange, N., Gurny, R., Delie, F. The chick embryo and its chorioallantoic membrane (CAM) for the in vivo evaluation of drug delivery systems. Advanced Drug Delivery Reviews. 59, 1162-1176 (2007).
- Hagedorn, M., Javerzat, S., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 1643-1648 (2005).
- De Wever, O., Hendrix, A., et al. Modeling and quantification of cancer cell invasion through collagen type I matrices. International Journal of Developmental Biology. 54, 887-896 (2010).
- Albini, A., Benelli, R. The chemoinvasion assay: A method to assess tumor and endothelial cell invasion and its modulation. Nature Protocols. 2, 504-511 (2007).
- Hanahan, D., Coussens, L. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
