Summary
O
Abstract
Sarcoma é uma doença muito rara, que é de natureza heterogénea, toda a impedir o desenvolvimento de novas terapias. Pacientes com sarcoma são candidatos ideais para a medicina personalizada após estratificação, explicando o interesse atual no desenvolvimento de um modelo de xenotransplante reprodutível e de baixo custo para esta doença. A membrana corioalantóide garota é uma série imunodeficientes natural, capaz de sustentar os tecidos enxertados e células sem restrições específicas de cada espécie. Além disso, é facilmente acedido, manipulados e fotografada usando estereomicroscopia óptica e fluorescência. Histologia permite análise mais detalhada das interações celulares heterotípicos.
Este protocolo descreve em pormenor o enxerto in ovo da membrana corioalantóica com sarcoma derivados de tecidos frescos de tumor, as suas suspensões de células individuais, e marcados com fluorescência de linhas de células de sarcoma estabelecidas permanentes e transientes (Saos-2 e SW1353). O rato sobrevivência garotaes são de até 75%. O modelo é usado para estudar enxerto (viabilidade, Ki67 índice de proliferação, necrose, infiltração) e host (infiltração de fibroblastos, neoformação vascular) comportamento. Para localizada enxertia de suspensões de células individuais, de ECM de gel proporciona vantagens significativas em relação aos materiais de contenção inertes. O índice de proliferação Ki67 está relacionada com a distância entre as células da superfície da CAM e a duração da aplicação no CAM, este último determina um período de tempo para a adição de produtos terapêuticos.
Introduction
Sarcoma é um tumor raro do tecido conjuntivo com uma elevada mortalidade devido à resistência à terapia 1,2. O progresso na sobrevida do paciente é dificultada pela sua baixa incidência anual, sua ampla diversidade, eo fato de que as células do sarcoma são relatados para ser difícil de cultura in vitro 3,4.
A utilização de células de cultura para a avaliação pré-clínica terapêutica revelou que novas moléculas, aparentemente activos in vitro nem sempre reflectem os resultados na prática clínica. Além disso, as aberrações genoma reveladas por matrizes de expressão de genes nem sempre são correlacionados às características do comportamento do tumor no doente 5-7. A fim de tentar resolver estes problemas, a medicina personalizada ganhou em importância, o que se reflete no aumento da procura de modelos de xenoenxerto 8-12.
Um ensaio in vivo tem a vantagem de refletir a complexa interação entre cAncer células e para o ambiente de tecido do hospedeiro em tumores sólidos, necessários para a proliferação e invasão de 13 cancro. Atualmente, estudar o uso do ensaio de membrana cório-alantóide (CAM-ensaio) como um modelo de xenoenxerto reprodutível para sarcoma 14,15. Este teste é amplamente usado para o estudo da angiogénese tumoral 16,17. Na literatura, no entanto, encontrámos protocolos diferentes para este ensaio, enquanto que outros estudos observada uma marcada diferença no crescimento ou angiogénese de acordo com diferentes protocolos de 18,19.
Neste artigo, foi investigado o efeito da variação das condições do ensaio de CAM, no comportamento de células de tumor, utilizando enxertos de suspensões de células únicas derivadas de tumor e culturas de células de sarcoma estabelecidos.
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Protocol
Veja a Figura 1 para uma visão geral
Material tumoral
1. Obtenção e preparação de amostras de tumor
Para a utilização do material do paciente, é necessária a aprovação do Comité de Ética e consentimento informado tem de ser obtida a partir do paciente.
- Colheita de material representativo (mínimo de 1 cm 3), no momento da intervenção, ou de uma biópsia ou uma ressecção de um sarcoma. O próprio site da biópsia é definida usando dinâmico de contraste MRI.
- Colocar imediatamente o material num frasco estéril contendo meio DMEM suplementado com 1,000 U de penicilina e 1 mg / ml de estreptomicina.
- Transportar o frasco imediatamente (30 - 90 min), para o laboratório.
Todos os seguintes procedimentos são realizados sob fluxo laminar.
- Verter o conteúdo do frasco para uma placa de Petri esterilizada.
- Coloque a amostra de tumor em pequenas partes do máximo 1 m3 m utilizando um bisturi esterilizado. Remover todas as partes calcificadas pois tendem a diminuir ainda mais o processamento do tecido.
- Aleatoriamente levar 10 enxertos tumorais para aplicação no CAM.
2. Preparação de suspensões de células derivadas de tumor individuais
Duração aproximada: 3 horas
- Pesa-se o tecido remanescente da amostra.
- Colocar 2-4 gramas de tecido num tubo dissociador, mais do que um tubo pode ser necessária para digerir todo o tecido do tumor remanescente.
- Para a digestão de 2-4 g de tecido, adicionar 2,5 ml de solução de colagenase 2 (500 U / ml de meio RPMI 1640) e uma solução de 2,5 ml de ADNase (22 KU / ml de RPMI 1640).
- Processar o tecido de acordo com o protocolo h_tumor dissociador. Isto envolve dois ciclos de incubação a 37 ° C na incubadora de CO 2, enquanto o tubo é suavemente agitada durante 30 min.
- Filtrar a suspensão restante através de um filtro de células 150 mM.
- Centrifuga-se o ligado a 1000 rpm, durante 5 min.
- Remover o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 10 ml de tampão de lise de eritrócitos (BLI), permitindo que os 10 minutos de incubação com a suspensão regular.
Nota: tampão de lise dos eritrócitos é fabricada como se segue: Adicionar 0,037 g de EDTA, 0,99 g de K 2 HPO 4, 8,29 g de NH 4 Cl a 1.000 ml de água, o uso de NaOH 10 N para ajustar o pH para 7,3, filtro sob pressão através de um 0,22 filtrar. Armazenar a 4 ° C.
- Adicionar 25 ml de meio de cultura (DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina) para parar a reacção.
- Centrifugar a suspensão a 1000 rpm durante 5 min. A cor da pastilha deve ser branco agora.
- Remover o sobrenadante.
- Adicionam-se 5 ml de meio ao sedimento. Filtrar a suspensão através de um filtro de 70 | iM de células.
- Conte o número de células vivas / ml por meio de um contador de células automático.
3. CLinhas Celulares Ancer
SAOS2 células de osteosarcoma (número ATCC: HTB-85) que expressam a proteína fluorescente verde melhorada foram electroporadas com vector pEGFP-C1 usando a linha celular Kit Nucleofector V de acordo com o protocolo do fabricante. Para estabelecer linhas celulares estáveis, as células transfectadas foram seleccionadas em G418 (1 mg / ml), durante 4 semanas, em conformidade com o protocolo estabelecido anterior 20. Além disso, a triagem foi realizada por triagem de células activadas por fluorescência (FACS) de acordo com as instruções do fabricante.
Células da linha de células de condrossarcoma de SW1353 (número ATCC: HTB-94) ou de tumores recentemente preparadas suspensões de células únicas são rotulados usando uma membrana lipofílico fluorescente mancha vermelha.
- Remover as células do frasco de cultura de um modo clássico utilizando tripsina (0,5% p / v) de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA, 0,2% p / vol) de solução.
- Centrifugar a suspensão de células durante 5 min a 1000 rpm.
- Remover o supernatant.
- Adicionar 1 ml de meio isento de soro, e 5 ul de DII (Vybrant vermelho) / 10 6 células.
- Embrulhe o frasco em papel alumínio e coloque-o na incubadora de CO 2 por 10 min a 37 ° C.
- Centrifugar novamente durante 5 min a 1000 rpm e remover o sobrenadante.
Ensaio membrana Corioalantóide
1. Incubação dos ovos
- Ovos fertilizados de uma incubadora comercial local, garantindo 95% de fertilização dos ovos são obrigatórios.
- Os ovos fertilizados podem ser armazenadas à temperatura ambiente até 10 dias.
Nota: antes de iniciar a incubação, sujidade, penas e excrementos são cuidadosamente removidos das cascas mecanicamente por limpeza a seco com toalhas de papel, que possuem uma áspera ao invés de uma estrutura de superfície macia. Limpar os ovos com 70% de etanol desnaturado ou de qualquer outro reagente de limpeza reduz significativamente a taxa de sobrevivência dos embriões de galinha.
- Coloque os ovos na incubador de um lado, a marcação da superfície superior. O dia em que os ovos são colocados na incubadora é designado 0 dias do desenvolvimento embrionário.
- Ajustar a temperatura de incubação a 37,8 ° C e a humidade de 47%. Certifique-se que a opção de rotação automática está desligado.
2. Abertura dos Ovos
Duração: 60 min ± 25 para ovos
No desenvolvimento dia 3, os ovos estão abertos com fluxo de ar laminar. Abrindo os ovos em um desenvolvimento mais resultados do estágio em danos para o CAM, como a membrana tende a ficar com o shell. Uma lâmpada de infravermelhos é usado para manter os ovos quentes durante o procedimento. Para melhorar a esterilidade, recomendamos o uso de luvas de mão.
- Coloque o ovo na eggcup, com o lado virado para cima acentuado.
- Diminuir o nível da CAM removendo dois ml de albumina através de uma agulha G 18 inserido na extremidade do ovo. Se a agulha estiver fechado após perfurar várioscascas de ovos, substitua a agulha. Se não, muita força tem de ser exercida, o que resulta em danos para a gema de ovo ou fractura do reservatório. Por vezes, a agulha é bloqueada pelo chalazae, uma das duas bandas em espiral para a suspensão da gema de albúmen. Isto pode ser resolvido empurrando suavemente o êmbolo para baixo até que o bloco seja resolvido. Se a gema de ovo é aspirado para dentro da seringa, substituir a agulha, bem como a seringa. Por vezes, o embrião morre após este evento. Se uma quantidade insuficiente de albúmen é removido, o CAM será danificado quando o invólucro é retirado.
- Aplicar uma camada adesiva semi-permeável, no lado superior do reservatório marcada, a fim de evitar o derramamento de partículas de casca sobre a CAM durante o corte da janela.
- Fazer um buraco com a introdução de um pequeno furador na superfície do ovo.
- Corte uma janela de 1 cm 2 no shell, usando um par de tesouras cirúrgicas estéreis pontiagudo.
- Pulsante coração do embrião e vasos adjacentes podem ser observados no the superfície da gema de ovo. Retire os ovos não fertilizados ou embriões mortos. Um aspecto interrompido dos vasos sanguíneos caracteriza embriões mortos.
- Selar a janela com uma película adesiva semipermeável. Não é necessário para cobrir o local da punção, a menos que a casca rachou durante a inserção da agulha.
3. Procedimento de Inoculação
Duração: ± 1 hora por linha celular
Em garota desenvolvimento embrionário dia 9, os ovos são inoculados sob fluxo de ar laminar.
Avaliação da célula cancerosa espalhando pela CAM requer confinamento das células para uma superfície limitada durante a inoculação. Matrigel é uma matriz de (ECM) em gel extracelular do sarcoma de rato Engelbreth-Holm-Swarm frequentemente utilizados em condições de cultura de células experimentais. É um líquido, quando arrefecida, mas irão sofrer polimerização activado termicamente, quando trazida a 20 - 40 ° C, formando, assim, um gel estável. Duranteos experimentos, Matrigel é mantido em uma caixa contendo o derretimento do gelo.
Nota: Nós insistimos em não usar lamelas perfuradas. Observou-se ligação e crescimento de células cancerosas enxertadas sobre o disco plástico, assim, o potencial de polarização das células na própria membrana crescimento.
- Ressuspender a pelota de células em gel de ECM arrefecido a uma concentração de 10 6 células/100 ul de gel de ECM. Manter esta solução em gelo derretido.
- Impostos parte da membrana semi-permeável com um par de cirurgia estéril sob fluxo laminar. Se a película de adesivo é removido completamente, isto irá resultar em uma proporção maior de morte do embrião devido à contaminação.
- Toque a direita CAM abaixo da janela do escudo levemente com uma vareta de vidro esterilizada, para remover a camada de células epiteliais. Tocando a CAM com uma vareta de vidro esterilizada prova ser menos traumático do que usando um bisturi n ° 11, o que requer mais maneabilidade e experiência. Podem ocorrer pequenas hemorragias.
- Adding material tumoral.
- Para enxertos tumorais: abaixe um pedaço de tecido sobre a CAM com um par de pinças estéreis, sem apertar.
- Para o procedimento de gel de ECM: 4x Adicionar 25 ul da suspensão de gel de célula-ECM para o CAM, em cima umas das outras, permitindo que o gel de ECM para polimerizar entre as aplicações. Desta forma, uma placa aderente contendo as células do cancro é criado.
- Selar a janela do shell novamente com uma película adesiva semipermeável.
4. Imagem e colheita do CAM
Duração: 2 horas para 25 ovos
Em garota desenvolvimento embrionário dia 16, os CAMs são colhidas. Trabalhando sob fluxo de ar laminar não é necessário.
- Ampliar a janela com um par de tesouras cirúrgicas. Certifique-se de não cortar muito baixo, caso contrário, o CAM será danificado, resultando em sangramento dos vasos lesados.
- Adicionar 300-500 mL de PBS D com uma pipeta na seita CAMiões contendo o material inoculado. Se não forem utilizadas sondas fluorescentes, tamponado pode ser utilizado como o que torna a membrana mais rígida, o que facilita o corte da membrana.
- Adicione uma fotografia da CAM no ovo através de um microscópio de fluorescência estéreo, equipado com uma câmara de cor digital, usando tanto o GFP ou o filtro de DSR e nenhum filtro. Para os enxertos tumorais, todas as fotografias são feitas sem filtros. Iluminação de cima por luzes LED é fortemente recomendado durante a fotografar (Figura 2).
- Migração de células tumorais recorde de células marcadas. As bordas dos tumores pode ser irregular e desgastado. Células dispersas podem estar presentes perto das fronteiras do tumor. Em alguns casos, contudo as linhas de células de tumor pode ser observado (Figura 3).
- Cortar a membrana com um par de tesouras estéreis na fronteira deitado contra a casca.
- Coloque a CAM colhidas numa placa de Petri estéril cheio com PBS D ou tamponada paraformaldeído.
- Adicione uma fotografia de tanto do lado superior e do lado inferior da CAM, ambos com e sem o filtro.
- Colocar a membrana em um recipiente rotulado com formol tamponado durante pelo menos 72 horas.
- Incorporar os CAMs em parafina e prepará-los para exame histológico. Ter o cuidado de cortar os enxertos de tumor no centro do nódulo, certificando-se a superfície de corte é paralela à parte inferior da cassete. Se não, a interacção entre o CAM e o enxerto do tumor não será visível. A mesma estratégia aplica-se às placas de gel de ECM: a superfície voltada para a lâmina de corte deve ser perpendicular à placa.
5. A avaliação histológica
Hematoxilina-Eosina e Ki-67 imuno-histoquímica foram realizados para maiores esclarecimentos, se necessário. A imuno-histoquímica foi realizada em secções de tecido embebidas em parafina fixados com formaldeído 3,5 um de espessura, utilizando um corante corrediça automatizado de acordocom as instruções do fabricante. Foi utilizado um anticorpo monoclonal de ratinho primário para o Ki-67 (clone MIB-1, diluição de 1/100). Induzida pelo calor epitopo recuperação foi realizado utilizando células Condicionamento 1, ea visualização foi realizada com o Kit de Detecção de DAB universal, de acordo com as instruções do fabricante. Desidratação de as secções de tecido foi realizada utilizando um coverslipper automatizado.
Para o SAOS2 e as linhas de células SW1353, o número de células Ki67-positivas e-negativas Ki67 nuclei/100 mM 2 foram contadas em três zonas: uma perto da fronteira do CAM, uma perto da superfície e um no centro do a placa de gel de ECM. Este procedimento foi repetido para cada lâmina 6x Ki-67 coradas. O índice de proliferação foi determinada para cada lâmina, dividindo o número de células Ki67-positivas pelo número total de células contadas.
A necrose é definida por uma perda de dispersão fina da cromatina no núcleo da célula, acompanhado por fading de margens das células distintas. Para xenotransplantes, a necrose é pontuado como completa, parcial (muitas vezes à superfície), ou está ausente. A infiltração de células de tumor na CAM é definida pela observação de células tumorais dentro da mesoderme da CAM, e é marcado como estando presente ou ausente.
Três itens são marcados para o comportamento host. Infiltração de fibroblastos é definido como células alongadas deixando a CAM e invadir o enxerto / placa do tumor, e é marcado como estando presente ou ausente. Crescimento interno vascular pode ser observado como o crescimento interno de proliferação de vasos pintainho, caracterizados pela presença de eritrócitos nucleados do pintainho.
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Representative Results
Avaliação da CAM
Enxertos de tumor se tornar aderente à CAM (Figura 2A). As suspensões de células únicas de material paciente frequentemente exibir uma seco, a placa ligeiramente levantada (Figura 2D). Após a excisão da CAM, marcado enrugamento da membrana ocorre (figuras 2E e 2F).
Para as linhas celulares comerciais da placa torna-se mais opaca com o tempo, indicando a proliferação de células. Linhagens celulares diferentes em ECM gel têm um padrão de crescimento distinta no CAM. SAOS2 forma uma placa de espalhamento, com um aumento claro da superfície desde o dia 7 após a inoculação, enquanto que o sinal permanece forte de GFP, indicando que as células viáveis. A migração de células SAOS2 pode ser visualizado paralelo aos vasos da CAM (Figura 3). Quando observados através do microscópio estereoscópico, vasos sanguíneos pode ser visto quando nenhum filtro é usado. As células tumorais não pode ser discernida quando nenhum filter é usado. Não é possível visualizar os vasos sanguíneos, quando um filtro de GFP é inserido. Ao transformar o filtro ligado e desligado, o contato próximo entre as células que migram e os vasos sanguíneos podem ser vistos. Puntiforme sangramento pode ser observado através da placa (Figura 4, linhas 1 e 2). As placas contendo as células SW1353 mostram uma diminuição da superfície e tendem a contrair a CAM, resultando numa membrana enrugada, após a colheita é (Figura 4, linhas 5 e 6). O sinal DSR diminui à medida que a sonda fluorescente torna-se diluído depois de muitas divisões celulares. A partir do dia 7, o sangramento é freqüentemente observada. Se ocorre o sangramento, o sinal DSR também diminui.
Reacção vascular podem ser visualizados após a excisão da CAM a vista inferior, mostrando vasos tortuosos em torno do enxerto ou placa (Figura 2). Reacção vascular da CAM é observado no grupo tumorgraft, o grupo de suspensão de células individuais (<forte> Figura 2C e 2F) e o grupo de controlo de gel de ECM (Figura 2G), mas não nos grupos de controlo solução de células (Figura 2H). Novos vasos tortuosos pode ser observado entrando na amostra, a ramificação (Figura 2I, pontas de seta) e anastomosados (Figura 2I, asteriscos) um com o outro, também pequenas áreas de hemorragia ocorrer (Figura 2i, setas). A neovascularização do tumor pode ser quantificada em H & E lâminas em diferentes zonas da placa de tumor / tumor.
Evidência histológica revela que as células SAOS2 manter uma aparência única célula por todo o volume total de gel de ECM, causando um aumento da espessura e do diâmetro da placa. Eles invadem a camada mesodérmica do CAM (Figura 5A, seta), aumentando assim a distância entre o endodérmica e ectodérmica as camadas da CAM como um fecho de abertura (Figura 5A (Figura 5B, seta). O número de células e os conjuntos de células aumentar progressivamente com o tempo, e o número de células não-proliferativas aumenta a partir do dia 7, especialmente na superfície da placa. Para SW1353, a contracção da CAM pode também ser apreciada no H & E, quando as lâminas em comparação com as corrediças de SAOS2 em H & E.
Para além do seu sítio ectópico de crescimento, verificou-se que as características essenciais e características imuno sarcoma dos tumores originais foram mantidas na CAM. Além disso, os enxertos de tumor se tornar revascularizada como evidenciado pelo aparecimento de eritrócitos nucleados do pintainho, os enxertos de tumor ficam infiltrado por fibroblastos bico e células tumorais de enxerto infiltradas no tecido hospedeiro CAM, que ilustra a fiabilidade e Robustness do ensaio CAM (Figura 6, inserção inferior esquerdo). Para mais informações detalhadas nos referimos a Sys et al. 14.
Tempo de colheita
A contagem das células de células Ki67-positivas e-negativas Ki67 mostra um aumento contínuo do número total de células a partir do dia 4 para ambas as linhas celulares. Após esse dia, o número total de células permanece estável. Sete dias após a inoculação, o número de células Ki67-positivas e o número total de células começa a declinar. Quanto ao número de células, existe uma correlação significativa entre as três zonas. No entanto, uma maior proporção de células Ki67-positivas perto da CAM, e uma proporção maior de células Ki67-negativas na superfície da placa sejam observados (Figura 4, as linhas 3, 4, 7 e 8).
O índice de proliferação permanece relativamente estável até sete dias após a inoculação, após o que também começa a declinar. O proliferatioíndice n da linha celular SW1353 é significativamente menor (P <0,05) quando comparado com a linha de células SAOS2.
Embora haja uma correlação significativa entre as três zonas, que é essencial para contar os campos em todas as três regiões presentes na placa de gel de ECM, tal como se observa uma maior proporção de células Ki67-positivas perto da CAM e uma proporção maior de Ki67 negativo As células na superfície da placa (Figura 7).
Figura 1. Visão geral do protocolo. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 2. Fotografias tiradas durante a colheita preocupações da linha superior de colheita de uma tumorgraft de um condrossarcoma:. A = in situ, B = vista superior em placa de Petri, C = baixa visão em placa de Petri. Preocupações linha do meio de colheita de uma suspensão de células individuais em ECM gel: D = in situ, E = vista superior em placa de Petri, F = view menor. Linha inferior G = controle matrigel, H = controle solução celular, I = vista inferior exibindo ramificação vasos e hemorragias. Clique aqui para ver a figura maior .
Figura 3. Fotografia GFP de SAOS2 
Figura 4. Esta figura mostra fotografias de ambos SAOS2 (superior quatro linhas) e SW1353 (inferior 4 linhas) no dia 1-8 após a inoculação. Linha 1 (barra de escala 2 mm) mostra as fotografias do CAM in situ através de um microscópio estereoscópico com filtro de GFP. Row 2 (barra de escala 2 mm) mostra as mesmas amostras através do microscópio estereoscópico enquanto iluminadas por LEDs de cima. Row 3 e 4 mostram a H & E (linha 3, barra de escala de 200 mm) e Ki67 manchado (linha 4, barra de escala de 200 ou 500 mm) imagens histológicas das mesmas amostras. linha 5 (barra de escala 2 mm) mostra as fotografias do CAM in situ através de um microscópio estereoscópico com filtro de DSR. Linha 6 (scale bar 2 mm) mostra as mesmas amostras através do microscópio estereoscópico enquanto iluminadas por LEDs de cima. Row 7 e 8 mostram a H & E (linha 7, barra de escala de 200 mm) e Ki67 manchado (linha 8, barra de escala de 200 e 500 mm) imagens histológicas das mesmas amostras. Clique aqui para ver a figura maior. 
Figura 5. Comparação da proliferação de SAOS2 SW1353 e células tumorais. Um crescimento de SAOS2 = B = crescimento de SW1353. 
Figura 6. Eritrócitos nucleados pintainho pode ser observada nos capilares ao longo de um lipossarcoma tumorgraft alto grau (HE, 100X), inserir menorà esquerda. 
Figura 7. Gráfico mostrando Ki67 células Ki67-+ e ao longo do tempo em função da distância a partir da CAM para ambas as linhas celulares. Zona A = contra a CAM, a zona C = superfície da placa, na zona B =-entre a zona A e C.
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Discussion
Momento da inoculação e da colheita
Temporizando no dia da inoculação foi realizada utilizando gel de SAOS2 em ECM (CAMs 36) e variou entre o dia de desenvolvimento embrionário 5 e 10.
Antes da incubação dia 9, o CAM não foi consistentemente grande o suficiente para suportar o gel ECM foi aplicado. Na colheita, as células tumorais, por vezes, tinha de ser recuperado do CAM mais profunda, e algumas amostras de gel ECM estavam mentindo solta no albúmen ou no CAM. Nos dias 5 e 6, foi difícil evitar colocar as células tumorais no embrião de galinha, resultando em malformações de pintos ou morte. Do dia 9, a CAM foi completamente cobre a superfície inferior da janela, na maioria dos ovos, e placas de gel de ECM provou aderente à CAM, no momento da colheita. Portanto, encontramos o momento ideal para a inoculação de ser dia 9 de desenvolvimento embrionário.
Para a determinação do tempo ideal de colheita, SAOS2 SW1353 e foram colhidas após respectively 1, 2 (apenas SAOS2-GFP), 4, 5, 6, 7 e 8 dias após a inoculação, ou entre o dia 10 do desenvolvimento embrionário e 17. Após estas variações, uma diferença no tempo de aplicação no CAM foi notada 1-12 dias.
Knighton publicado marcadas diferenças no crescimento do tumor e revascularização do tumor de acordo com o dia de desenvolvimento embrionário no momento da aplicação da amostra do tumor 17. A contagem de células de células Ki67-positivas e-negativas Ki67 mostrou um aumento contínuo do número total de células a partir do dia 4 para ambas as linhas celulares. Isto é concordante com o achado de Ausprunk et al. 21, que afirmou que o período necessário para revascularização leva 72 horas. Após a contagem do número de células e do cálculo do índice de proliferação, podemos assumir que as células dispersas no gel ECM estão a proliferar activamente desde o dia 4 até ao dia 6 após a inoculação. Com base no diâmetro da placa, o número total de células e o índice deproliferação, sugerimos que o tempo ideal para a colheita é de 16 dias do desenvolvimento embrionário, ou sete dias após a inoculação.
O prazo sugerido deixa a pesquisadores uma janela de seis dias para a aplicação de agentes, enquanto as células estão ativamente se proliferando, ou uma vez no 4 º dia após a inoculação ou diariamente, durante todo o tempo. Para administração tópica, o composto é aplicado sobre a superfície da CAM. Este percurso é o mais comumente usado, devido à acessibilidade ao CAM, basta abrir a casca do ovo / filme 22,23 adesiva. Embora seja possível a administração IV, a dificuldade de inserir as agulhas para dentro dos vasos de CAM é uma limitação fundamental. Inibidores de cinase são aplicados diariamente 24; quimioterapia uma vez durante todo o experimento. Nós supomos que a adição de um composto uma vez que é o equivalente do tratamento clínico com citotóxico de agentes citostáticos, que são administrados de forma clássica, uma vez a cada 3 semanas, enquanto que a adição deo composto numa base diária irá reflectir a dose diária de inibidores de quinases no cenário clínico. No entanto, devemos ter em mente que a administração tópica irá mostrar diferentes cinética / metabolismo em comparação com administração oral ou IV em pacientes.
Importância da técnica e possíveis aplicações futuras
Preservação da morfologia celular é de primordial importância quando as culturas celulares são usados em modelos pré-clínicos. A utilização de matrizes extracelulares homogéneos tais como colagénio tipo I 25 ou gel de ECM 26 restaura o ambiente de células de tumor, permitindo que um modelo de crescimento mais natural.
Ao contrário do que em ensaios in vivo, os ensaios in vitro não contêm células estromais, tais como as células vasculares angiogénicas, células do sistema imunológico que se infiltram ou células fibroblásticas associadas câncer necessários para reconstituir o microambiente tumorigénicas 27. Quando o ensaio de CAM é usado para a avaião de tumorgrafts, nós descrevemos um típico 'cone invasão' da CAM para os tumorgrafts, reflectindo o recrutamento de células estromais do pintainho pelo tumorgraft 14.
A CAM-ensaio proporciona uma combinação de restauração da matriz extracelular por ECM gel e fornecimento de células hospedeiras para a reconstituição do microambiente tumorigénico. À medida que a CAM e a tumorgraft / placa são prontamente acessíveis, a administração dos compostos é fácil. Deste modo, o ensaio de CAM abre novas perspectivas para a avaliação pré-clínica de tipos de tumores raros tais como os sarcomas.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Células da linha celular SW1353 condrossarcoma foram gentilmente cedidas pelo Prof Dr. PCW Hogendoorn e Prof Dr. J. Bovée Universidade de Leiden, na Holanda. Agradecemos J. Mestach e G. Wagemans para uma excelente assistência técnica, e G. De Bruyne para o desenho profissional do panorama do nosso protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
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