Summary
该
Abstract
肉瘤是一种非常罕见的疾病，在本质上是异质的，都阻碍了发展的新疗法。肉瘤患者的理想人选后分层的个性化医学，解释目前在开发这种疾病的一个重现性好，成本低的异种移植模型的兴趣。鸡胚绒毛尿囊膜，是一种天然的免疫缺陷宿主能够维持嫁接的组织和细胞，没有种属特异性的限制。此外，它很容易访问，操纵和使用光学和荧光立体显微镜成像。组织学进一步允许异型细胞相互作用的详细分析。
该协议详细描述了OVO绒毛尿囊膜移植肉瘤派生的新鲜肿瘤组织，其单细胞悬液，和永久和瞬态荧光标记的建立肉瘤细胞株（系Saos-2和SW1353）。小鸡存活大鼠上课是高达75％。该模型用于研究移植（活力，Ki67的增殖指数，坏死，浸润）和主机（成纤维细胞浸润，血管长入）的行为。对于单细胞悬液的本地化嫁接，ECM凝胶提供了显着的优势，在惰性容器材料。 Ki67增殖指数的距离的凸轮表面的细胞和CAM上，后者确定的治疗产品的另外的时间框架中的应用的持续时间有关。
Introduction
肉瘤是一种罕见的肿瘤治疗抵抗1,2由于死亡率高的结缔组织。患者的生存率进展受阻低的年发病，其广泛的多样性，以及肉瘤细胞的事实，据报道， 在体外难以培养3,4。
使用培养细胞的临床前治疗评价已经表明，新的，显然是在体外的活性分子并不总是反映在临床上的结果。此外，揭示了基因表达阵列的基因畸变并不总是与个别病人5-7的肿瘤行为特征。为了试图解决这些问题，已经获得了个性化医疗的重要性，这也反映在增加搜索异种移植模型8-12。
在体内试验中的一种反映复杂的相互作用的优点是与c的相关关系在固体肿瘤细胞与宿主组织环境，必要的癌细胞增殖和侵袭13。目前，我们研究使用绒毛膜尿囊膜法（CAM法）作为一个可重复的异种移植物模型肉瘤14,15。本试剂盒被广泛用于肿瘤血管生成的研究16,17。然而，在文献中，我们已经发现这个实验的不同的协议，而其他的研究观察到的生长或血管生成的显着性差异，根据不同的协议18,19。
在这篇文章中，我们探讨不同的CAM检测条件对细胞行为的肿瘤移植，肿瘤来源的单细胞悬液和既定的肉瘤细胞培养的效果。
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Protocol
参见图1的概述
肿瘤材料
1。肿瘤样本的获取和准备
的伦理委员会的批准，如果在病人的材料的使用是必要的，从病人取得的知情同意书。
- 嘉实代表材料（最小为1厘米3）干预的时间，无论是活检或切除的肉瘤。活检定义适当的地点使用动态对比度MRI。
- 立即将材料在无菌小瓶含1000 U青霉素和1毫克/毫升链霉素DMEM培养基。
- 运输样品瓶立即（30 - 90分钟）到实验室。
所有下面的程序进行，在层流。
- 将瓶中内容物倾入无菌的陪替氏培养皿中。
- 将肿瘤最大限度地1米的一小部分样品放入3用消毒的手术刀。删除所有钙化的部分，因为他们往往会削弱进一步的组织处理。
- 随机取10个肿瘤移植应用CAM。
2。肿瘤来源的单细胞悬浮液的制备
持续时间：约3小时
- 称取样品的其它组织。
- 取约2 - 4克组织离解器管中，可能需要一个以上的管消化所有其它的肿瘤组织。
- 2 - 4克组织的消化，加2.5毫升胶原酶溶液（500 U / ml的RPMI 1640）和2.5毫升DNA酶溶液（22 KU / ml的RPMI 1640）。
- 根据离解h_tumor协议处理该组织。这涉及到在CO 2培养箱中在37℃下保温2个循环的，而管轻轻摇动30分钟。
- 通过150微米的细胞过滤过滤剩余的悬浮液。
- 裂解液以1000rpm离心5英里名词
- 去除上清。
- 将沉淀重悬于10ml的红细胞裂解缓冲液（ELB），允许与常规悬浮液温育10分钟。
注意：红细胞裂解液如下制造：加入0.037克EDTA，0.99克K 2 HPO 4，8.29克氯化铵到千毫升水产，使用10N的氢氧化钠将pH调节至7.3，过滤器在压力下通过0.22μm的过滤。贮存于4℃
- 加入25毫升的培养基（补充有10％胎牛血清，100 U / ml青霉素和100μg/ ml的链霉素的DMEM培养基），使反应停止。
- 离心悬浮液，以1,000 rpm 5分钟。颗粒的颜色应该是白色。
- 去除上清。
- 加入5毫升的介质颗粒。通过70微米的细胞过滤，过滤悬浮液。
- 通过自动细胞计数器计数活细胞/ ml的数量。
3。 Ç的相关关系及细胞系
电SAOS2骨肉瘤细胞（ATCC编号：HTB-85）表达增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1载体，使用的细胞株Nucleofector试剂盒V根据制造商的协议。建立稳定的细胞系，转染的细胞中选择G418（1毫克/毫升），连续4周线与先前建立的一种协议20。此外根据制造商的说明，通过荧光激活细胞分选（FACS）进行排序。
SW1353软骨肉瘤细胞株（ATCC编号：HTB-94）或新鲜制备肿瘤单细胞悬液的细胞标记，用红色荧光亲脂膜染色。
- 在经典的方法，用胰蛋白酶（0.5％重量/体积）乙二胺四乙酸（EDTA，0.2％重量/体积）溶液中除去细胞从培养瓶中。
- 离心细胞悬浮液，以1,000 rpm 5分钟。
- 删除supernatant。
- 加入1 ml无血清培养基和5μl的DiI荧光（Vybrant红）/ 10 6个细胞。
- 铝箔包装小瓶，并把它在10分钟，在37℃的CO 2培养箱
- 以1,000 rpm 5分钟，再次离心，去除上清。
绒毛尿囊膜试验
1。卵孵化
- 保证95％的受精鸡蛋从当地的商业孵化的受精卵是必需的。
- 受精卵在RT下，可以存储多达10天。
注：开始孵化前，仔细去除灰尘，羽毛和粪便是从蛋壳机械用纸巾，柔软的表面结构，而不是一个有一个粗略的干擦。用70％变性乙醇或其它任何清洁试剂擦拭鸡蛋的小鸡胚胎的存活率显着降低。
- 把鸡蛋放进incubATOR的一侧上，标记的上表面。在这一天的鸡蛋都放在孵化器被指定胚胎发育的第0天。
- 设定的培养温度37.8℃，湿度控制在47％。确保“自动旋转”选项关闭。
2。鸡蛋开幕
时间：±60分钟，25个鸡蛋。
在发展的第3天，鸡蛋打开层流气流下。打开鸡蛋损害到CAM进一步发展阶段性成果，膜往往坚持到shell。红外线灯在操作过程中用于保持蛋温暖。为了提高不育，我们建议使用手套。
- 将鸡蛋的蛋杯，填划的一面朝上。
- 通过去除两个毫升的蛋白水平降低的CAM通过18G的针的尖端处的蛋。如果针头钝射孔后几个蛋壳，更换针头。如果不是，用力过猛，也有需要充分发挥，造成损坏蛋黄或断裂的外壳。有时针阻塞的系带，其中的2个螺旋带，暂停的蛋黄蛋清。这个问题可以通过轻轻推入柱塞回落，直至该块被解决。如果被吸入到注射器蛋黄，更换的针和注射器。有时胚胎死亡后，此事件。如果除去蛋白量不足，则CAM将被损坏，当外壳被除去。
- 在标记的上侧的外壳，以防止溢出壳粒子到CAM切割窗口的同时应用的半透性粘接薄膜。
- 用小锥子在蛋的表面作一介绍孔。
- 切为1cm 2：在外壳的窗口，使用一对无菌尖头手术剪。
- 胚胎的跳动的心脏和毗邻船只可以观察到日E面的蛋黄。删除未受精的蛋或死胚。一个被中断的血管方面的特征死胚。
- 密封窗口的半透性粘接薄膜。这是没有必要覆盖穿刺部位，在插入针的过程中，除非壳破裂。
3。接种程序
时间：±1小时，每细胞系
在小鸡胚胎发育的第9天，卵层流气流下接种。
遍布的CAM的肿瘤细胞评价需要的细胞在接种过程中的有限表面的遏制。基底膜是一种细胞外基质（ECM）凝胶中经常使用的实验细胞培养条件从Engelbreth-Holm的群小鼠肉瘤。在冷却时，它是一种流体，但将进行热激活的聚合时，到第20 - 40℃，从而形成一个稳定的凝胶。中实验中，基底膜保持在一个盒子里含有融化的冰。
注：我们坚持不使用穿孔盖玻片。我们观察到接枝的癌细胞的粘附和生长到塑料圆盘，从而偏置膜本身上的细胞的生长潜力。
- 重悬细胞沉淀在冷却的ECM凝胶的浓度为10 6 cells/100微升ECM凝胶。保持这个解决方案上的冰融化。
- 海关部分的半透膜，根据层流无菌手术的一对。如果粘接膜完全除去，这将导致胚胎死亡，由于污染的比例较大。
- 触摸shell窗口的CAM正下方用无菌玻璃棒轻轻地，为了除去上皮细胞层。触摸CAM用无菌玻璃棒被证明是比使用手术刀的编号为11，这需要更多的轻便和经验的创伤小。可能会出现小出血。
- 一肿瘤材料dding。
- 对于肿瘤移植：轻轻放下一对无菌镊子的CAM组织到一块，不挤。
- ECM凝胶过程：4倍的25微升的细胞-ECM凝胶悬浮液加入到CAM，在彼此的顶部，使ECM凝胶聚合在应用程序之间的。以这种方式，包含癌细胞粘附斑块被创建。
- 再次用一个半透胶粘剂膜密封外壳窗口。
4。在CAM的成像和收获
时间：2小时25个鸡蛋。
在小鸡胚胎发育的第16天，凸轮收获。下工作的层流是没有必要的。
- 一对手术剪，放大该窗口。确保不削减太低，否则将被损坏的CAM，导致受伤的血管出血。
- 添加300 - 500微升的PBS D到CAM教派用吸管含有接种物的离子。如果没有荧光探针的使用，甲醛缓冲液可以用作使膜更硬，促进膜的切断。
- 通过立体声荧光显微镜，配备一个数字彩色摄像机，使用GFP或的DSR滤波器，没有过滤器，使照片的CAM蛋。对于肿瘤移植，所有照片都没有过滤器。强烈建议从上述LED灯照明，在拍摄过程中（ 图2）。
- 记录肿瘤细胞标记细胞迁移。肿瘤的边界可能是不规则磨损。分散的细胞可能是肿瘤边界附近。在一些样品中，可以观察到肿瘤细胞的行（ 图3）。
- 无菌剪刀的一对切膜对壳躺在上面的边界。
- 将收获的CAM在无菌培养皿中充满与PBS D或缓冲甲醛。
- 的上侧和下侧的凸轮，与不带过滤器的照片。
- 将膜与缓冲甲醛中至少72小时，在有标签的容器。
- 嵌入凸轮的石蜡和准备作病理检查。小心切肿瘤移植在结节的中心，确保切割表面是平行于磁带盒的底部。如果没有，CAM和肿瘤移植物之间的相互作用将不可见。相同的策略适用于对ECM凝胶斑块：相对的面的切割刀片应垂直于斑块。
5。组织学评价
苏木精 - 伊红染色和Ki-67免疫组化进行了进一步澄清，如果需要的话。免疫组化法对福尔马林固定，石蜡包埋的组织切片厚度为3.5μm，使用自动幻灯片染色机根据制造商的指示。鼠标主单克隆抗体（克隆MIB-1，稀释1/100），Ki-67的使用。热诱导抗原活化检索使用细胞，书桌1，可视化，实现与通用的DAB检测试剂盒，根据制造商的说明。组织切片进行了Dehydratation使用自动盖片。
的的SAOS2和SW1353细胞系，Ki67的阳性和Ki67阴性细胞nuclei/100μm2的数量进行计数在三个区域：一个比较接近的CAM的边界，一个关闭的表面和一个在中心的ECM凝胶牌匾。这个过程重复每个Ki-67的染色后的载玻片的6倍。指数增殖细胞计数的总数除以Ki67的阳性细胞的数量为每个幻灯片确定。
坏死的定义是在细胞核内染色质的微细分散的损失，伴随着法迪纳克的不同单元格边距。异种移植，坏死得分完整，部分（通常在表面），或缺席。由观察到CAM的肿瘤细胞的浸润是指肿瘤细胞的CAM中胚层内，被评价为存在或不存在。
三个项目都取得了主机的行为。成纤维细胞浸润被定义为拉长的细胞，使CAM和入侵移植瘤/斑块，得分为存在或不存在。向内生长增殖的小鸡容器，其特征在于成核的小鸡红细胞的存在下，可观察到血管向内生长。
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Representative Results
在CAM的评价
肿瘤移植变得附着到CAM（ 图2A）。单细胞悬液经常从病人的材料显示干燥，微微凸起的牌匾（ 图2D）。切除后的CAM，标志着起皱发生膜（ 图2E和2F）。
对于商业细胞株的牌匾变得更加不透明，表明细胞的增殖。 ECM凝胶在不同的细胞系有明显的增长模式上的CAM。 SAOS2形成一个蔓延斑块，表面从接种后第7天明显增加，而GFP信号依然强劲，表明活菌。 SAOS2细胞的迁移，可以可视化平行的CAM的血管（ 图3）。通过立体显微镜观察时，血管可以看出，当不使用过滤器。肿瘤细胞不能分辨时没有FILTER使用。这是不可能的，以可视化的血管时，GFP的过滤器插入。通过旋转过滤器的开启和关闭，细胞迁移和血管之间的紧密接触可以看到。点状出血，通过斑块（ 图4中 ，可以观察到 行1和2）。含有SW1353细胞的噬菌斑减少表面倾向于收缩的CAM，导致皱膜收获后（ 图4，5和第6行）。 DSR信号降低荧光探针成为许多细胞分裂后稀释。从第7天，经常观察到的出血。如果发生出血，DSR信号也降低。
血管反应可以是可视化切除后的CAM在较低的视图，示出弯曲的血管周围的移植物或噬斑（ 图2）。血管的CAM的反应中观察到的tumorgraft基，单细胞悬液组（<>图2C和2F）和ECM凝胶对照组（ 图2G），但不是细胞溶液的对照组（ 图2H）。可以观察新迂曲的血管进入样品（ 图2I，箭头），分支及吻合的（ 图2I， 星号），另一个也出现小面积的出血（ 图2I，箭头）。 H＆E幻灯片可以量化的肿瘤新生血管肿瘤/肿瘤斑块在不同区域内。
SAOS2细胞的组织学证据表明，维持整个完整的ECM凝胶体积的单个单元格的外观，造成增加的厚度和直径的斑块。它们侵入中胚层的凸轮（ 图5A中 ，箭头），从而扩大了类似的开口拉链的内胚层和外胚层层的CAM之间的距离（ 图5A 图5B，箭头）。细胞和细胞团的数目稳步增加时间，从第7天的非增殖性细胞增加的数量，特别是在表面上的斑块。 SW1353也可以被理解的CAM收缩上的H＆E染色的幻灯片时相比，H＆E SAOS2滑动。
尽管他们的异位部位生长，我们发现，在CAM中的本质特征和保持原来的肉瘤肿瘤的免疫组化特征。此外，肿瘤移植成为血运重建外观核小鸡红细胞，肿瘤移植成为渗透鸡胚成纤维细胞和肿瘤细胞的移植渗入CAM宿主组织，说明可靠性和ROBU的证明stness的CAM检测（ 图6中插入左下）。有关进一步的详细信息，我们指的SYS 等 14。
收获时间
Ki67的阳性和Ki67阴性细胞的细胞计数显示两种细胞系的细胞从第4天的总数的稳步增长。在该日期之后的细胞总数保持稳定。接种后7天，Ki67的阳性细胞数和细胞总数开始下降。关于细胞的数量，三个区之间有一个显着的相关性。但是，较大的比例接近到CAM Ki67的阳性细胞，Ki67蛋白阴性细胞的比例较大的斑块表面被观察到（ 图4，行3，第4，第7和8）。
扩散指数保持相对稳定，直到接种后7天，此后也开始下降。 proliferatioN指标的SW1353细胞系显着降低（P <0.05）相比，到SAOS2细胞系。
三个区域虽然有一个显着的相关性，有必要在所有三个区域在ECM中的凝胶斑块计数字段，正如我们观察Ki67的阳性细胞数接近到CAM的比例较大，较大比例的Ki67的负细胞在斑块的表面（ 图7）。
图1。概述该协议。 点击这里查看大图 。
图2。收获期间拍摄的照片上排收割一个tumorgraft从软骨肉瘤的关注：A = 在原地 ，B =上来看在培养皿，C =视图培养皿。中东行的关注，收获单细胞悬液在ECM凝胶：D = 原位 ，E =在培养皿上来看，F =较低。下排G =基底膜控制，H =细胞液控制，I =下显示分支血管和出血。 点击这里查看大图 。
图3。 GFP照片SAOS2 
图4。此图显示两个SAOS2（高4行）和SW1353的照片（低4行）第1天至8，在接种后第1行 （比例尺2 mm）的显示CAM 原位的照片，通过体视显微镜用GFP滤波器。 行2（毫米尺度栏2）示出的相同的样品，通过体视显微镜而来自上述的LED照明。 行3和4显示的ħ＆ë键（行3，比例尺条为200μm）和Ki67的染色（4行规模的栏200或500微米）来自同一样品5行 （比例尺2毫米）的组织学图像显示行6（CAM的照片， 在原地通过与DSR滤波器立体显微镜。CALE栏2毫米）示出的相同的样品，通过体视显微镜而来自上述的LED照明。7和8行显示的ħ＆ë键（行7，比例尺条为200μm）和Ki67的染色（8行规模的栏200和500微米）组织学图像相同的样本。 点击这里查看大图。 
图5。肿瘤细胞的增殖的SAOS2和SW1353比较A = 的增长SAOS2 乙 = SW1353的增长。 
图6。在毛细血管中，可以观察到核小鸡红细胞整个高品位脂肪肉瘤tumorgraft的中（HE，100X），插入下离开了。 
图7。图形显示Ki67的+和Ki67细胞随着时间的推移，根据这两个细胞系的CAM的距离。对CAM = A区，C区 =表面的牌匾， 区域B = A和C区之间。
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Discussion
接种和收获的时间
时序进行SAOS2天接种ECM凝胶（36的CAM）和胚胎发育天5和10之间变化。
孵化前9天，CAM是不能持续大到足以支持我们采用ECM凝胶。收获时，肿瘤细胞有时不得不从更深的CAM检索，并在蛋白或CAM一些ECM凝胶样品躺在松动。在第5和第6天，这是很难避免把小鸡畸形或死亡，导致肿瘤细胞鸡胚。从第9天，在CAM被完全覆盖的大部分鸡蛋的窗口下面的表面，，ECM凝胶的斑块证明附着到CAM收获的时刻。因此，我们找到了理想的接种时间是胚胎发育的第9天。
对于理想的收割时间的测定，SAOS2和SW1353后收获respectivel的Y 1，2（的SAOS2-GFP），4，5，6，7和接种后8天，或胚胎发育天之间10和17。随着这些变化，在CAM上的应用程序的长度差注意到从第1 - 12天。
奈顿发表在肿瘤生长和肿瘤血运重建的显着差异，根据胚胎发育的肿瘤样本应用程序17天的时刻。 Ki67的阳性和Ki67阴性细胞的细胞计数在第4天起，这两个细胞系的细胞总数呈稳步上升。这是一致发现的Ausprunk 等 。21指出，血运重建所需的时间需要72小时。计数细胞的数目和计算的扩散指数在后，我们可以假设，在ECM中的凝胶分散细胞活跃增殖从接种后第6天，第4天，直到。基于斑块的直径，细胞总数的索引扩散，我们认为理想的收获时间是16天的胚胎发育，或接种后7天。
叶研究者建议的时间框架六天的窗口，应用代理，而细胞活跃增殖，接种后或每天一次第4天，在整个时间框架。对于局部给药，该化合物被施加的CAM的表面上。这条路线是最常用的，通过简单地打开蛋壳/粘合膜22,23由于到CAM的无障碍。虽然静脉注射是可行的，难以插入到CAM船只的针是一个重要的限制。激酶抑制剂的应用，每天24;化疗在实验过程中一次。我们推测，一次加入的化合物是等效的临床治疗与细胞毒性的细胞生长抑制剂，这是经典的，每3周给药一次，同时加入的化合物，每天将反映激酶抑制剂在临床上的日剂量。但是，我们必须记住，局部给药会表现出不同的动力学/代谢口服或静脉注射的患者相比。
该技术的意义和未来可能的应用
保存细胞的形态是最重要的细胞培养时，在临床前模型中使用。使用同质化的细胞外基质，如胶原蛋白I型25或ECM凝胶26恢复肿瘤细胞的环境，让一个更自然的增长模式。
相反， 在体内试验中， 在体外实验中不包含的基质细胞，如血管生成的血管细胞，免疫细胞浸润或癌相关成纤维细胞的细胞要重组的致瘤性的微环境27。当CAM-试剂盒用于evaluat离子的的tumorgrafts，我们已经描述了一个典型的“入侵锥'从CAM对tumorgrafts的，反映招聘基质细胞从小鸡由tumorgraft 14。
在CAM检测提供恢复细胞外基质细胞外基质凝胶和宿主细胞的致瘤性的微环境的重构的组合。由于CAM和的tumorgraft /斑块容易获得，化合物的管理是很容易的。以这种方式，在CAM检测打开新的视角对罕见类型的肿瘤如肉瘤的临床前评价。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
从SW1353软骨肉瘤细胞系细胞恳请教授的PCW Hogendoorn博士，荷兰莱顿大学教授J.博维。我们感谢的J. Mestach和G. Wagemans优秀的技术援助，G.德Bruyne专业绘图概述我们的协议。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
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