Summary
Le
Abstract
Sarcome est une maladie très rare qui est de nature hétérogène, tout d'entraver le développement de nouvelles thérapies. patients atteints de sarcomes sont des candidats idéaux pour une médecine personnalisée après stratification, ce qui explique l'intérêt actuel pour l'élaboration d'un modèle de xénogreffe reproductible et à faible coût pour cette maladie. La membrane chorio poussin est un hôte immunodéprimé naturel capable de soutenir les tissus et les cellules greffées sans restrictions spécifiques à l'espèce. En outre, il est facilement accessible, manipulée et imagées par stéréomicroscopie optique et fluorescence. L'histologie permet une analyse plus détaillée des interactions cellulaires hétérotypiques.
Ce protocole décrit en détail l'in ovo greffe de la membrane chorio avec sarcome dérivés de tissus frais de tumeurs, leurs suspensions cellulaires simples, et les lignes permanentes et transitoires marqués par fluorescence établies cellules sarcome (Saos-2 et SW1353). La survie rat de poussines sont en hausse de 75%. Le modèle est utilisé pour étudier greffon (viabilité, Ki67 index de prolifération, nécrose, infiltration) et hôte (d'infiltration de fibroblastes, interposition vasculaire) comportement. Pour greffage localisé de suspensions cellulaires simples, gel ECM offre des avantages significatifs par rapport aux matériaux de confinement inertes. L'index de prolifération Ki67 est liée à la distance entre les cellules de la surface de la came et de la durée de l'application sur la came, celle-ci déterminant une période de temps pour l'addition de produits thérapeutiques.
Introduction
Sarcome est une tumeur rare du tissu conjonctif avec un taux de mortalité élevé dû à 1,2 résistance à la thérapie. Progrès dans la survie des patients est entravée par leur faible incidence annuelle, leur grande diversité, et le fait que les cellules de sarcome sont signalés à être difficile à la culture in vitro de 3,4.
L'utilisation de cellules en culture pour l'évaluation préclinique de thérapie a révélé que de nouvelles molécules, apparemment actif in vitro ne reflètent pas toujours les résultats dans le contexte clinique. En outre, les aberrations du génome révélées par des tableaux d'expression des gènes ne sont pas toujours en corrélation avec les caractéristiques de comportement de la tumeur chez le patient individuel 7.5. Pour tenter de résoudre ces problèmes, la médecine personnalisée a gagné en importance, ce qui se reflète dans l'augmentation de la recherche de modèles de xénogreffes 8-12.
Un essai in vivo a l'avantage de refléter l'interaction complexe entre ccellules ancer et de l'environnement de tissu de l'hôte dans les tumeurs solides, nécessaires à la prolifération du cancer et l'invasion 13. Actuellement, nous étudions l'utilisation de l'essai sur la membrane chorio-allantoïdien (CAM-test) comme un modèle de xénogreffe reproductible pour le sarcome 14,15. Ce test est largement utilisé pour l'étude de l'angiogenèse tumorale 16,17. Dans la littérature, cependant, nous avons trouvé des protocoles différents pour ce test, tandis que d'autres études ont observé une différence marquée de la croissance ou de l'angiogenèse selon différents protocoles 18,19.
Dans cet article, nous examinons l'effet des conditions de la CAM-dosage variable sur le comportement des cellules en utilisant des greffes tumorales, les suspensions de cellules uniques dérivées de tumeurs et de cultures cellulaires de sarcome établies.
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Protocol
Voir la Figure 1 pour un aperçu
Matériel tumoral
1. L'obtention et la préparation des échantillons tumoraux
Pour l'utilisation du matériel malade, l'approbation du comité d'éthique est nécessaire, et le consentement éclairé doit être obtenu à partir du patient.
- matériau de récolte de mandataire (minimum 1 cm 3) au moment de l'intervention, que ce soit une biopsie ou une résection d'un sarcome. Le site approprié de la biopsie est définie en utilisant dynamique de contraste IRM.
- Placer le matériau immédiatement dans un flacon stérile contenant du DMEM additionné de 1 000 U de pénicilline et 1 mg / ml de streptomycine.
- Transporter le flacon immédiatement (30 - 90 min) au laboratoire.
Toutes les procédures suivantes sont effectuées sous flux laminaire.
- Verser le contenu du flacon dans une boîte de Pétri stérile.
- Mettre l'échantillon tumoral dans de petites parties de maximum 1 mm 3 à l'aide d'un scalpel stérile. Retirez toutes les pièces calcifiées comme ils ont tendance à nuire à la transformation du tissu.
- Prendre au hasard 10 greffes tumorales pour l'application de la CAM.
2. Préparation des tumeurs dérivées des suspensions monocellulaires
Durée approximative: 3 heures
- Peser le tissu restant de l'échantillon.
- Mettre 2 - 4 g de tissu dans un tube à dissociateur, plus d'un tube peut être nécessaire de digérer tout le tissu de la tumeur restante.
- Pour la digestion de 2 - 4 g de tissu, ajouter la solution de 2,5 ml de collagénase 2 (500 U / ml de RPMI 1640) et une solution de DNase 2,5 ml (22 KU / ml RPMI 1640).
- Procédé du tissu selon le protocole de h_tumor de dissociateur. Il s'agit de 2 cycles d'incubation à 37 ° C en CO 2 incubateur tandis que le tube est secoué doucement pendant 30 min.
- Filtrer la suspension restante à travers un tamis cellulaire 150 um.
- Centrifuger le lysat à 1000 rpm pendant 5 kmn.
- Eliminer le surnageant.
- Reprendre le culot dans 10 ml de tampon de lyse érythrocytaire (ELB), permettant 10 minutes d'incubation avec suspension régulière.
Note: tampon de lyse érythrocytaire est fabriqué comme suit: Ajouter 0,037 g EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g de NH 4 Cl à 1000 ml aqua, utiliser NaOH 10 N pour ajuster le pH à 7,3, filtre sous pression à 0,22 um filtrer. Conserver à 4 ° C.
- Ajouter 25 ml de milieu de culture (DMEM complété avec 10% de sérum de veau foetal, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine) pour arrêter la réaction.
- Centrifuger la suspension à 1000 rpm pendant 5 min. La couleur de la pastille doit être blanc maintenant.
- Eliminer le surnageant.
- Ajouter 5 ml de milieu de la boulette. Filtrer la suspension à travers un tamis cellulaire um 70.
- Compter le nombre de cellules vivantes / ml à l'aide d'un compteur automatique de cellules.
3. Cancer lignées cellulaires
SAOS2 cellules d'ostéosarcome (numéro ATCC: HTB-85) exprimant la protéine fluorescente verte ont été électroporation par le vecteur pEGFP-C1 en utilisant la lignée cellulaire Nucleofector Kit V selon le protocole du fabricant. Pour établir des lignées cellulaires stables, les cellules transfectées ont été sélectionnées dans G418 (1 mg / ml) pendant 4 semaines en ligne avec les précédents établis protocole 20. En outre le tri a été effectué par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) selon les instructions du fabricant.
Les cellules provenant de la lignée de cellules de chondrosarcome SW1353 (numéro ATCC: HTB-94) ou de suspensions de cellules individuelles de tumeur fraîchement préparés sont étiquetés à l'aide d'une membrane lipophile fluorescent tache rouge.
- Retirez les cellules du flacon de culture d'une manière classique en utilisant la trypsine (0,5% p / v) d'acide éthylène diamine (EDTA, 0,2% poids / volume) solution.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min à 1000 rpm.
- Retirez le supernatant.
- Ajouter 1 ml de milieu sans sérum et 5 pi Dil (Vybrant Rouge) / 10 6 cellules.
- Envelopper le flacon dans une feuille d'aluminium et le mettre dans le CO 2 incubateur pendant 10 min à 37 ° C.
- Centrifuger à nouveau pendant 5 min à 1000 rpm et éliminer le surnageant.
Essai sur la membrane chorioallantoïque
1. L'incubation des oeufs
- Les œufs fécondés provenant d'une écloserie commerciale locale garantissant 95% fécondation des œufs sont obligatoires.
- Les œufs fécondés peuvent être stockés à température ambiante jusqu'à 10 jours.
Remarque: avant de commencer l'incubation, la saleté, les plumes et les excréments sont soigneusement retirés des coquilles d'œufs mécaniquement par un essuyage à sec avec du papier absorbant, qui ont une grossière plutôt qu'une structure de surface molle. Essuyer les œufs avec 70% d'éthanol dénaturé ou tout autre réactif de nettoyage permet de réduire considérablement le taux de survie des embryons de poulet.
- Mettez les œufs dans le Incubteur d'un côté, le marquage de la surface supérieure. Le jour où les œufs sont placés dans l'incubateur est désignée 0 jours de développement embryonnaire.
- Réglez la température d'incubation à 37,8 ° C, et une humidité de 47%. Assurez-vous que l'option de rotation automatique est désactivée.
2. Ouverture des œufs
Durée: ± 60 min pour 25 oeufs
Le jour de développement 3, les œufs sont ouverts sous flux d'air laminaire. Ouverture des œufs lors d'une nouvelle résultats de la phase de développement des dommages à la CAM, comme la membrane a tendance à coller à la coque. Une lampe infrarouge est utilisé pour garder les œufs au chaud pendant la procédure. Pour améliorer la stérilité, nous recommandons l'utilisation de gants à la main.
- Placez l'oeuf dans le coquetier, avec le côté marqué vers le haut.
- Abaisser le niveau de la CAM en enlevant deux ml d'albumine à travers une aiguille de calibre 18 insérées à la pointe de l'œuf. Si l'aiguille est émoussée après perforation plusieurscoquilles d'œufs, remplacer l'aiguille. Si non, trop de force doit être exercée, ce qui entraîne des dommages au jaune d'œuf ou d'une fracture de la coquille. Parfois l'aiguille est bloqué par le chalazes, l'un des 2 bandes spirales suspension le jaune dans l'albumen. Ceci peut être résolu en poussant doucement le piston vers le bas jusqu'à ce que le bloc est résolu. Si le jaune d'oeuf est aspiré dans la seringue, remplacer l'aiguille ainsi que la seringue. Parfois, l'embryon meurt après cet événement. Si une quantité insuffisante d'albumine est enlevé, la CAM sera endommagé lors de la coquille est enlevée.
- Appliquer un film adhésif semi-perméable sur le côté supérieur de la coquille marquée afin d'empêcher déversement de particules de coquille sur la CAM en coupant la fenêtre.
- Faire un trou de mise en place d'un petit poinçon à la surface de l'oeuf.
- Couper une fenêtre de 1 cm 2 dans la coquille, à l'aide d'une paire de ciseaux chirurgicaux pointus stériles.
- Cœur battant de l'embryon et les vaisseaux adjacents peuvent être observés à thsurface de e du jaune d'oeuf. Retirez les œufs non fécondés ou d'embryons morts. Un aspect interrompu des vaisseaux sanguins caractérise embryons morts.
- Joint d'étanchéité de la fenêtre avec un film adhésif semi-perméable. Il n'est pas nécessaire de couvrir le site de ponction, à moins que la coquille a craqué lors de l'insertion de l'aiguille.
3. Procédure de vaccination
Durée: ± 1 h par lignée cellulaire
Le poussin embryonnaire jour 9 développement, les œufs sont inoculés sous flux d'air laminaire.
Evaluation de cellule cancéreuse la diffusion à travers la CAM nécessite confinement des cellules à une surface limitée lors de l'inoculation. Matrigel est une matrice (ECM) gel extracellulaire du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm fréquemment utilisé dans des conditions de culture de cellules expérimentales. Il s'agit d'un liquide lorsqu'il est refroidi, mais subira une polymérisation thermiquement activé lorsqu'il est mis à 20 - 40 ° C, formant ainsi un gel stable. Au cours deles expériences, Matrigel sont conservées dans une boîte contenant de la glace fondante.
Note: Nous insistons sur le fait de ne pas utiliser des lamelles perforées. Nous avons observé fixation et la croissance des cellules cancéreuses greffées sur le disque en plastique de sollicitation ainsi un potentiel de croissance des cellules sur la membrane elle-même.
- Remettre en suspension un culot cellulaire dans ECM gel refroidi à une concentration de 10 6 cellules/100 pi gel ECM. Conserver cette solution sur la fonte des glaces.
- Douanes partie de la membrane semi-perméable avec une paire de chirurgicale stérile sous flux d'air laminaire. Si le film adhésif est complètement supprimé, cela se traduira par une plus grande proportion de la mortalité embryonnaire due à la contamination.
- Touchez le droit CAM-dessous de la fenêtre de shell légèrement avec une tige de verre stérile, afin d'enlever la couche de cellules épithéliales. Toucher la CAM avec une tige de verre stérile s'avère être moins traumatisant que d'utiliser un scalpel n ° 11, qui exige plus de maniabilité et d'expérience. Petites hémorragies peuvent se produire.
- Adding matériel tumoral.
- Pour les greffes tumorales: abaissez doucement un morceau de tissu sur la CAM avec une paire de pinces stériles, sans presser.
- Pour la procédure de gel ECM: Ajouter 4x 25 pi de la suspension de gel cellule-ECM à la CAM, les uns sur les autres, ce qui permet le gel ECM à polymériser entre les applications. De cette manière, une plaque adhérente contenant les cellules cancéreuses est créé.
- Joint d'étanchéité de la fenêtre d'enveloppe à nouveau avec un film adhésif semi-perméable.
4. Imagerie et la récolte de la CAM
Durée: 2 h pour 25 oeufs
Le poussin embryonnaire jour le développement 16, les cames sont récoltés. Travaillant sous flux laminaire n'est pas nécessaire.
- Agrandir la fenêtre avec une paire de ciseaux chirurgicaux. Veillez à ne pas couper trop bas, sinon la CAM sera endommagé, entraînant une hémorragie des vaisseaux lésés.
- Ajouter 300 - 500 pi de PBS D avec une pipette sur la secte CAMionique contenant le matériau inoculée. Si aucune des sondes fluorescentes sont utilisées, le formaldéhyde tamponné peut être utilisé car cela rend la membrane rigide, ce qui facilite la coupe de la membrane.
- Faire une photographie de la came dans l'oeuf à travers un microscope à fluorescence stéréo, équipé d'une caméra numérique en couleurs, en utilisant à la fois la GFP ou le filtre DSR, et aucun filtre. Pour les greffes tumorales, toutes les photographies sont prises sans filtres. Éclairage par le dessus par LED est fortement recommandé lors de photographier (Figure 2).
- Fiche migration des cellules de tumeur des cellules marquées. Les frontières des tumeurs peuvent être irrégulières et effilochées. Cellules épars peuvent être présents près des frontières tumorales. Dans certains échantillons, des rangées de cellules tumorales peuvent être observées (Figure 3).
- Découper la membrane avec une paire de ciseaux stériles à la frontière se trouvant contre la coque.
- Placez le CAM récolté dans une boîte de Pétri stérile rempli de PBS D ou tamponné pourformaldéhyde.
- Faire une photographie à la fois du côté supérieur et le côté inférieur de la came, à la fois avec et sans filtre.
- Placez la membrane dans un contenant étiqueté avec du formaldéhyde tamponné pendant au moins 72 heures.
- Intégrer les CAM dans de la paraffine et de les préparer pour l'examen histologique. Prendre soin de couper les greffes de tumeurs au centre du nodule, en s'assurant que la surface de coupe est parallèle au fond de la cassette. Sinon, l'interaction entre le CAM et la greffe tumorale ne sera pas visible. La même stratégie s'applique à des plaques de gel ECM: la surface tournée vers la lame de coupe doit être perpendiculaire à la plaque.
5. L'évaluation histologique
Hématoxyline-éosine et Ki-67 immunohistochimie ont été effectuées pour obtenir des précisions, si nécessaire. L'immunohistochimie a été réalisée sur des coupes de tissus inclus dans la paraffine fixés au formol de 3,5 pm d'épaisseur, en utilisant une coloration de lames selon automatiséaux instructions du fabricant. Un anticorps monoclonal de souris primaire de Ki-67 (clone MIB-1, dilution 1/100) a été utilisé. Induite par la chaleur épitope a été réalisée en utilisant la cellule conditionné 1, et la visualisation a été réalisé avec le kit de détection DAB Universal, selon les instructions du fabricant. Déshydratation des sections de tissus a été réalisée à l'aide d'une colleuse automatique.
Pour la SAOS2 et les lignées de cellules SW1353, le nombre de cellules Ki67-positives et Ki67 négatif nuclei/100 um 2 ont été comptés en trois zones: l'une près de la frontière de la CAM, un près de la surface et un dans le centre de la plaque de gel ECM. Cette procédure a été répétée 6x pour chaque diapositive Ki-67 taché. L'indice de prolifération a été déterminée pour chaque diapositive en divisant le nombre de cellules Ki67-positives par le nombre total de cellules comptées.
La nécrose se définit par une perte de dispersion fine de la chromatine dans le noyau de la cellule, accompagné par fading des marges de cellules distinctes. Pour xénogreffes, la nécrose est marqué comme complet, partiel (souvent à la surface), ou absents. L'infiltration de cellules tumorales dans la came est défini par l'observation de cellules tumorales dans le mésoderme de la CAM, et est marqué comme étant présent ou absent.
Trois points sont marqués pour le comportement de l'hôte. l'infiltration des fibroblastes est défini comme cellules allongées sortant du CAM et d'envahir la greffe / plaque tumeur, et est marqué comme étant présent ou absent. Interposition vasculaire peut être observé comme interposition de la prolifération des vaisseaux chiches, caractérisés par la présence d'érythrocytes de poulet nucléées.
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Representative Results
Évaluation de la CAM
Greffes tumorales deviennent adhérentes à la CAM (figure 2A). Suspensions de cellules isolées à partir de matériaux patients présentent souvent une séché, plaque légèrement surélevée (figure 2D). Après exérèse de la CAM, marquée plissement de la membrane se produit (figures 2E et 2F).
Pour les lignées cellulaires commerciaux la plaque devient plus opaque dans le temps, indiquant la prolifération des cellules. Différentes lignées cellulaires de gel ECM ont un modèle de croissance distinct sur la CAM. SAOS2 forme une plaque d'épandage, avec une nette augmentation de la surface de 7 jours après l'inoculation, alors que le signal GFP demeure forte, indiquant cellules viables. La migration des cellules SAOS2 peut être visualisé parallèlement aux vaisseaux de la CAM (Figure 3). Quand on l'observe à travers la loupe binoculaire, les vaisseaux sanguins peuvent être vus quand aucun filtre n'est utilisé. Les cellules tumorales ne peuvent être repérés en l'absence de filter est utilisé. Il n'est pas possible de visualiser les vaisseaux sanguins quand un filtre GFP est inséré. En tournant le filtre on et off, le contact étroit entre les cellules migrantes et les vaisseaux sanguins peut être vu. Ponctuelle saignement peut être observé à travers la plaque (Figure 4, lignes 1 et 2). Les plaques contenant des cellules SW1353 montrent une diminution de la surface et ont tendance à contracter le CAM, résultant en une membrane plissée après la récolte (Figure 4, lignes 5 et 6). Le signal DSR diminue à mesure que la sonde fluorescente devient dilué après plusieurs divisions cellulaires. De jour 7, on observe souvent des saignements. Si le saignement se produit, le signal DSR diminue également.
Réaction vasculaire peut être visualisée après exérèse de la came à la vue inférieure montre vaisseaux tortueux autour du greffon ou de la plaque (figure 2). Réaction vasculaire de la CAM est observée dans le groupe tumorgraft, le groupe de suspension cellulaire unique (<strong> Figure 2C et 2F) et le groupe contrôle ECM gel (figure 2G), mais pas dans les groupes témoins de solutions cellulaires (figure 2H). De nouveaux vaisseaux tortueux peuvent être observés entrant dans l'échantillon, de branchement (Figure 2I, pointes de flèches) et anastomose (figure 2I, astérisques) avec l'autre; aussi de petites zones de saignement surviennent (Figure 2I, flèches). Néovascularisation de la tumeur peut être quantifié sur des lames H & E dans les différentes zones de la plaque tumeur / tumeur.
Preuve histologique montre que les cellules SAOS2 maintenir une apparence de cellule unique dans tout le volume complet du gel ECM, provoquant une augmentation de l'épaisseur et du diamètre de la plaque. Ils envahissent la couche mésodermique de la CAM (figure 5A, flèche), élargissant ainsi la distance entre l'endoderme et l'ectoderme les couches de la CAM comme une fermeture éclair d'ouverture (figure 5A (figure 5B, flèche). Le nombre de cellules et les agrégats de cellules d'augmenter de façon constante dans le temps, et le nombre de cellules non prolifératives augmente à partir de 7 jours, en particulier à la surface de la plaque. Pour SW1353, la contraction de la CAM peut également être apprécié sur le lames H & E par rapport aux diapositives de SAOS2 H & E.
Malgré leur site ectopique de croissance, nous avons constaté que les caractéristiques essentielles et les caractéristiques immunohistochimiques des tumeurs de sarcome d'origine ont été conservés dans la CAM. En outre, les greffes tumorales deviennent revascularized comme en témoigne l'apparition de globules rouges nucléés chiches, les greffes tumorales deviennent infiltrés par des fibroblastes de poulet et les cellules tumorales de la greffe infiltré le tissu hôte CAM, illustrant la fiabilité et Robustness de l'essai CAM (Figure 6, encart en bas à gauche). Pour plus d'informations, nous renvoyons à Sys et al. 14.
Moment de la récolte
Le comptage des cellules des cellules Ki67-positives et Ki67 négatif indique une augmentation constante du nombre total de cellules du jour 4 pour les deux lignées cellulaires. Après ce jour le nombre total de cellules reste stable. Sept jours après l'inoculation, le nombre de cellules Ki67-positives et le nombre total de cellules commence à décliner. En ce qui concerne le nombre de cellules, il existe une corrélation significative entre les trois zones. Cependant, une plus grande proportion de cellules Ki67-positives à proximité de la came, et une plus grande proportion de cellules Ki67-négatives à la surface de la plaque sont observées (Figure 4, les lignes 3, 4, 7 et 8).
L'indice de prolifération demeure relativement stable jusqu'à sept jours après l'inoculation, après quoi elle commence à décliner. Le proliferatiol'indice n de la lignée de cellules SW1353 est nettement plus faible (P <0,05) par rapport à la lignée cellulaire SAOS2.
Bien qu'il existe une corrélation significative entre les trois zones, il est essentiel de compter les champs dans les trois régions de la plaque de gel ECM, comme nous observons une plus grande proportion de cellules Ki67-positives proches de la CAM et une plus grande proportion de Ki67 négatif les cellules à la surface de la plaque (figure 7).
Figure 1. Présentation du protocole. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 2. Les photos prises lors de la récolte des préoccupations de la rangée supérieure de récolte d'un tumorgraft d'un chondrosarcome:. A = in situ, B = view inférieur à boîte de Pétri = vue supérieure en boîte de Pétri, C. Préoccupations rangée du milieu de récolte d'une suspension cellulaire unique en gel ECM: D = in situ, E = vue supérieure en boîte de Pétri, F = faible vue. Rangée du bas G = matrigel contrôle, H = contrôle de la solution cellulaire, I = vue inférieure affichant vaisseaux arborescents et des saignements. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 3. photographie de GFP de SAOS2 
Figure 4. Cette figure montre des photographies de deux SAOS2 (en haut à 4 lignes) et SW1353 (en bas à 4 rangées) au jour 1 et 8 après l'inoculation. Rang 1 (barre d'échelle de 2 mm) montre les photos de la CAM in situ au moyen d'un microscope stéréoscopique avec filtre GFP. Row 2 (barre d'échelle 2 mm) montre les mêmes échantillons à travers la loupe binoculaire tout éclairé par LED d'en haut. Row 3 et 4 montrent le H & E (ligne 3, barre d'échelle 200 um) et Ki67 teinté (ligne 4, échelle bar 200 ou 500 um) des images histologiques à partir des mêmes échantillons. rangée 5 (barre d'échelle 2 mm) montre les photos de la CAM in situ à travers une loupe binoculaire avec filtre DSR. Ligne 6 (scale bar 2 mm) montre les mêmes échantillons à travers la loupe binoculaire tout éclairé par LED d'en haut. rangée 7 et 8 montrent le H & E (ligne 7, barre d'échelle 200 um) et Ki67 teinté (ligne 8, barre d'échelle 200 et 500 um) images histologiques à partir des mêmes échantillons. Cliquez ici pour agrandir la figure. 
Figure 5. Comparaison de la prolifération des cellules tumorales de SAOS2 et SW1353. Une croissance de SAOS2 = B = croissance de SW1353. 
Figure 6. Érythrocytes de poulet nucléées peuvent être observés dans les capillaires à travers un tumorgraft de liposarcoma de haut grade (HE, 100X), encadré plus basgauche. 
Figure 7. Graphique montrant Ki67 et Ki67 cellules + au cours du temps en fonction de la distance de la CAM pour les deux lignées cellulaires. Zone A = contre la came, la zone C = surface de la plaque, la zone B = au-entre la zone A et C.
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Discussion
Moment de l'inoculation et la récolte
Chronométrant le jour de l'inoculation a été effectuée à l'aide SAOS2 en gel ECM (36 CAM) et variait entre embryonnaire journée de perfectionnement 5 et 10.
Avant le jour d'incubation 9, le CAM a pas toujours assez grand pour soutenir le gel ECM, nous avons appliqué. A la récolte, les cellules tumorales devaient parfois être récupérés à partir de la CAM profond, et quelques échantillons de gel ECM gisaient en vrac dans l'albumen ou sur le CAM. Aux jours 5 et 6, il était difficile d'éviter de mettre les cellules tumorales sur l'embryon de poulet, ce qui entraîne des malformations chiches ou de mort. De jour 9, le CAM a été entièrement recouvrir la surface en dessous de la fenêtre dans la plupart des œufs, et des plaques de gel ECM prouvé adhérente à la CAM au moment de la récolte. Par conséquent, nous avons trouvé le moment idéal pour l'inoculation d'être 9e jour du développement embryonnaire.
Pour la détermination du moment idéal de la récolte, SAOS2 et SW1353 ont été récoltés après respectively 1, 2 (SAOS2-GFP uniquement), 4, 5, 6, 7 et 8 jours après l'inoculation, ou entre le jour de développement embryonnaire 10 et 17. Suite à ces variations, une différence de longueur de la demande sur le CAM a été noté de 1 à 12 jours.
Knighton a publié des différences marquées dans la croissance tumorale et la revascularisation tumeur en fonction du jour du développement embryonnaire au moment de l'application de l'échantillon tumoral 17. Le comptage des cellules Ki67-positives et Ki67 négatif cellulaire a montré une augmentation régulière du nombre total de cellules du jour 4 pour les deux lignées cellulaires. Ceci est concordant avec le constat de Ausprunk et al. 21 ans, qui a déclaré que la période nécessaire pour revascularisation prend 72 heures. Après avoir compté le nombre de cellules et le calcul de l'indice de prolifération, nous pouvons supposer que les cellules dispersées dans le gel ECM sont activement prolifèrent du jour 4 jusqu'au jour 6 après l'inoculation. Sur la base du diamètre de la plaque dentaire, le nombre total de cellules et l'indice deprolifération, nous suggérons que le moment idéal pour la récolte, c'est le jour 16 du développement embryonnaire, soit sept jours après l'inoculation.
Le délai proposé laisse aux chercheurs une fenêtre de six jours pour l'application d'agents tandis que les cellules sont activement prolifèrent, soit une fois le jour 4 après l'inoculation ou tous les jours pendant le laps de temps ensemble. Pour l'administration topique, le composé est appliqué sur la surface de came. Cet itinéraire est le plus couramment utilisé un, en raison de l'accessibilité à la CAM en ouvrant simplement la coquille / film 22,23 adhésif. Bien que l'administration IV est faisable, la difficulté à insérer des aiguilles dans les vaisseaux CAM est une limitation critique. inhibiteurs de kinases sont appliquées sur une base quotidienne 24; chimiothérapie une fois au cours de l'expérience. Nous émettons l'hypothèse que l'ajout d'un composé fois l'équivalent du traitement clinique avec cytotoxique des agents cytostatiques, qui sont classiquement administrés une fois toutes les 3 semaines, tout en ajoutantle composé sur une base quotidienne tiendra compte de la dose quotidienne d'inhibiteurs de kinases dans le cadre clinique. Cependant, nous devons garder à l'esprit que l'administration topique montrera différentes cinétique / métabolisme par rapport à administration orale ou IV chez les patients.
Importance de la technique et de possibles applications futures
La préservation de la morphologie des cellules est d'une importance primordiale lorsque les cultures de cellules sont utilisées dans des modèles précliniques. L'utilisation de matrices extracellulaires homogènes telles que le collagène de type I ou 25 ECM gel 26 restaure l'environnement des cellules tumorales, ce qui permet un mode de croissance plus naturel.
Contrairement aux essais in vivo, dans des essais in vitro ne contiennent pas de cellules stromales telles que les cellules vasculaires angiogéniques, des cellules immunitaires infiltrant ou des cellules fibroblastes associés au cancer nécessaires pour reconstituer le microenvironnement tumorigène 27. Lorsque la came-dosage est utilisé pour l'évaion de tumorgrafts, nous avons décrit un «cône d'invasion» typique de la CAM vers les tumorgrafts, reflétant le recrutement de cellules stromales de la nana par le tumorgraft 14.
Le CAM-test fournit une combinaison de la restauration de la matrice extracellulaire par gel ECM et fournir des cellules hôtes pour la reconstitution du microenvironnement tumorigène. Comme le CAM et la tumorgraft / plaque sont facilement accessibles, l'administration de composés est facile. De cette façon, le CAM-analyse ouvre de nouvelles perspectives pour l'évaluation préclinique de types de tumeurs rares telles que les sarcomes.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les cellules de la lignée cellulaire de chondrosarcome SW1353 ont été aimablement fournies par le professeur PCW Hogendoorn et Dr. J. Bovée de l'Université de Leiden, Pays-Bas. Nous remercions J. Mestach et G. Wagemans pour une excellente assistance technique et G. De Bruyne pour le dessin professionnel de la vue d'ensemble de notre protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
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