Summary
Gli
Abstract
Sarcoma è una malattia molto rara, che è di natura eterogenea, tutte ostacolando lo sviluppo di nuove terapie. Pazienti sarcoma sono candidati ideali per la medicina personalizzata dopo stratificazione, che spiega l'attuale interesse per lo sviluppo di un modello di xenotrapianto riproducibile e di basso costo per questa malattia. Il corioallantoidea membrana pulcino è un ospite immunodeficienti naturale in grado di sostenere i tessuti e le cellule innestate senza restrizioni specie-specifici. Inoltre, esso è facilmente accessibile, manipolato e ripreso con stereomicroscopia ottica e fluorescenza. Istologia permette ulteriori analisi dettagliata delle interazioni cellulari eterotipiche.
Questo protocollo descrive in dettaglio l'in ovo innesto della membrana corioallantoidea con sarcoma dei tessuti derivati freschi del tumore, le loro sospensioni di cellule singole, e stabilite le linee cellulari del sarcoma permanenti e transitori fluorescente (Saos-2 e SW1353). La sopravvivenza ratto pulcinoes sono fino al 75%. Il modello è utilizzato per lo studio del trapianto (viabilità, indice di proliferazione Ki67, necrosi, infiltrazione) e host (fibroblasti infiltrazione, crescita interna vascolare) comportamento. Per localizzata innesto di sospensioni di cellule singole, ECM gel offre vantaggi significativi rispetto ai materiali di contenimento inerti. L'indice di proliferazione Ki67 è legato alla distanza delle cellule dalla superficie della CAM e la durata della applicazione sul CAM, quest'ultimo determina un intervallo di tempo per l'aggiunta di prodotti terapeutici.
Introduction
Sarcoma è un tumore raro del tessuto connettivo con un alto tasso di mortalità a causa di terapia resistenza 1,2. I progressi nella sopravvivenza del paziente è ostacolato dalla loro bassa incidenza annuale, la loro grande diversità, e il fatto che le cellule del sarcoma sono segnalati per essere difficile da coltura in vitro 3,4.
L'uso di cellule in coltura per la valutazione preclinica terapia ha rivelato che le nuove molecole, apparentemente attivi in vitro non sempre riflettono i risultati in ambito clinico. Inoltre, aberrazioni genomiche rivelati da array di espressione genica non sono sempre correlati alle caratteristiche di comportamento tumorali nel singolo paziente 5-7. Per cercare di risolvere questi problemi, la medicina personalizzata ha acquistato importanza, che si riflette in una maggiore ricerca di modelli di xenotrapianto 8-12.
I test in vivo ha il vantaggio di riflettere la complessa interazione tra ccellule Ancer e dell'ambiente tessuto ospite in tumori solidi, necessari per la proliferazione del cancro e l'invasione 13. Attualmente si studia l'uso del dosaggio a membrana Chorio-allantoideo (CAM-assay) come un modello di xenotrapianto riproducibile per sarcoma 14,15. Questo saggio è ampiamente usato per lo studio di angiogenesi tumorale 16,17. In letteratura, tuttavia, abbiamo trovato protocolli diversi per questo test, mentre altri studi hanno osservato una marcata differenza nella crescita o angiogenesi secondo diversi protocolli 18,19.
In questo articolo analizziamo l'effetto delle condizioni del CAM-dosaggio variabile sul comportamento delle cellule tumorali utilizzando innesti, sospensioni di cellule singole derivate da tumore e colture cellulari sarcoma affermati.
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Protocol
Vedere la Figura 1 per una panoramica
Materiale tumorale
1. Raccogliere ed elaborare campioni tumorali
Per l'uso del materiale del paziente, l'approvazione del comitato etico è necessario, e il consenso informato deve essere ottenuto dal paziente.
- Raccolto materiale rappresentativo (minimo 1 cm 3) al momento dell'intervento, sia una biopsia o una resezione di un sarcoma. Il corretto sito di biopsia è definita utilizzando dinamico contrasto per risonanza magnetica.
- Posizionare immediatamente il materiale in un flacone sterile contenente DMEM supplementato con 1.000 U penicillina e 1 mg / ml di streptomicina.
- Trasportare il flacone immediatamente (30 - 90 min) al laboratorio.
Tutte le seguenti procedure sono eseguite sotto flusso laminare.
- Versare il contenuto della fiala in una piastra di Petri sterile.
- Mettere il campione di tumore in piccole parti di al massimo 1 mm 3 utilizzando un bisturi sterile. Rimuovere tutte le parti calcificate in quanto tendono a mettere in pericolo l'ulteriore elaborazione del tessuto.
- Casualmente prendere 10 innesti tumorali per la domanda da CAM.
2. Preparazione delle derivate dal tumore sospensioni singola cella
Durata approssimativa: 3 ore
- Pesare il tessuto rimanente del campione.
- Mettere 2 - 4 g di tessuto in un tubo dissociatore, più di una valvola può essere richiesto per digerire tutto il tessuto tumorale residuo.
- Per la digestione di 2 - 4 g di tessuto, aggiungere 2,5 ml di soluzione di collagenasi 2 (500 U / ml RPMI 1640) e 2,5 ml di soluzione di DNasi (22 KU / ml RPMI 1640).
- Elaborare il tessuto secondo il protocollo h_tumor dissociatore. Questo comporta due cicli di incubazione a 37 ° C in incubatore CO 2 mentre il tubo viene agitato delicatamente per 30 min.
- Filtrare la sospensione rimanente attraverso un colino cellula 150 pm.
- Centrifugare il lisato a 1.000 rpm per 5 min.
- Rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet in 10 ml di tampone di lisi degli eritrociti (ELB), consentendo 10 minuti di incubazione con sospensione regolare.
Nota: tampone di lisi degli eritrociti è prodotto come segue: Aggiungere 0,037 g di EDTA, 0,99 g K 2 HPO 4, 8,29 g di NH 4 Cl a 1,000 ml di acqua, usare NaOH 10 N per regolare il pH a 7,3, filtro sotto pressione attraverso una 0,22 micron filtrare. Conservare a 4 ° C.
- Aggiungere 25 ml di terreno di coltura (DMEM supplementato con 10% siero fetale bovino, 100 U / ml di penicillina, e 100 pg / ml streptomicina) per arrestare la reazione.
- Centrifugare la sospensione a 1000 rpm per 5 min. Il colore del pellet dovrebbe essere bianco ora.
- Rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 5 ml di terreno al pellet. Filtrare la sospensione attraverso un colino cella 70 micron.
- Contare il numero di cellule vive / ml mediante un contatore automatico cella.
3. CAncer Linee Cellulari
SAOS2 cellule di osteosarcoma (numero ATCC: HTB-85) che esprimono maggiore proteina fluorescente verde sono state elettroporate da pEGFP-C1 vettoriale utilizzando la linea cellulare Nucleofector Kit V secondo il protocollo del produttore. Stabilire linee cellulari stabili, le cellule transfettate sono state selezionate in G418 (1 mg / ml) per 4 settimane in linea con le precedenti stabilita protocollo 20. Inoltre ordinamento è stato eseguito da fluorescenza separazione delle cellule attivate (FACS) secondo le istruzioni del produttore.
Cellule dalla linea cellulare SW1353 condrosarcoma (numero ATCC: HTB-94) o sospensioni di cellule singole tumorali appena preparati sono etichettati utilizzando una membrana lipofilo fluorescente rossa macchia.
- Rimuovere le cellule dal pallone di coltura in modo classico utilizzando tripsina (0,5% peso / vol) di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA; 0,2% peso / vol) di soluzione.
- Centrifugare la sospensione cellulare per 5 min a 1000 rpm.
- Rimuovere il supernatant.
- Aggiungere 1 ml di mezzo privo di siero e 5 microlitri DII (Vybrant Rosso) / 10 6 cellule.
- Avvolgere la fiala in un foglio di alluminio e metterlo nel incubatore CO 2 per 10 min a 37 ° C.
- Centrifugare nuovamente per 5 min a 1000 rpm e rimuovere il surnatante.
Saggio membrana corioallantoidea
1. Uovo di incubazione
- Sono tenuti uova fecondate da un vivaio commerciale locale garantendo il 95% la fecondazione delle uova.
- Uova fecondate possono essere conservati a temperatura ambiente fino a 10 giorni.
Nota: prima di iniziare l'incubazione, sporcizia, piume ed escrementi vengono accuratamente rimossi dai gusci d'uovo meccanicamente da eliminare a secco con i tovaglioli di carta, che hanno una ruvida piuttosto che una struttura di superficie morbida. Pulendo le uova con il 70% di etanolo denaturato o altro reagente di pulizia riduce significativamente il tasso di sopravvivenza degli embrioni di pollo.
- Mettere le uova in incubator su un lato, che segna la superficie superiore. Il giorno in cui le uova sono messe in incubatrice è designato 0 giorno di sviluppo embrionale.
- Impostare la temperatura di incubazione a 37,8 ° C, e l'umidità al 47%. Assicurarsi che l'opzione di rotazione automatica è disattivata.
2. Schiusa delle uova
Durata: ± 60 min per 25 uova
Il giorno di sviluppo 3, le uova sono aperti in flusso d'aria laminare. Aprire le uova in ulteriori risultati inerenti allo sviluppo sui palchi dei danni al CAM, come la membrana tende ad attaccarsi al guscio. Una lampada a infrarossi viene utilizzata per mantenere le uova caldo durante la procedura. Per migliorare la sterilità, si consiglia l'uso di guanti.
- Mettere l'uovo nel portauovo, con il lato contrassegnato rivolto verso l'alto.
- Abbassare il livello della CAM rimuovendo due ml di albumina attraverso un ago 18 G inserita sulla punta dell'uovo. Se l'ago è spuntato dopo perforazione diversigusci d'uovo, sostituire l'ago. Se no, troppa forza deve essere esercitata, con conseguente danno per il tuorlo d'uovo o frattura del guscio. A volte, l'ago è bloccato dal chalazae, una delle due bande a spirale sospendono il tuorlo in albume. Questo può essere risolto spingendo delicatamente lo stantuffo verso il basso fino a quando il blocco è stato risolto. Se tuorlo viene aspirato nella siringa, sostituire l'ago e la siringa. A volte l'embrione muore dopo questo evento. Se una quantità insufficiente di albume viene rimosso, il CAM sarà danneggiato quando il guscio viene rimosso.
- Applicare una pellicola semipermeabile adesivo sul lato marcato superiore della calotta, per evitare la fuoriuscita di particelle shell sulla CAM durante il taglio la finestra.
- Fare un foro di introduzione con un piccolo punteruolo alla superficie dell'uovo.
- Tagliare una finestra di 1 cm 2 nella shell, con un paio di forbici chirurgiche sterili appuntiti.
- Cuore pulsante dell'embrione e dei vasi comunicanti possono essere osservati al secolosuperficie e del tuorlo d'uovo. Togliere le uova non fecondate o embrioni morti. Un aspetto interrotto dei vasi sanguigni che caratterizza gli embrioni morti.
- Sigillare la finestra con un film adesivo semipermeabile. Non è necessario coprire il sito di puntura, salvo che il serbatoio ha incrinato durante l'inserimento dell'ago.
3. Procedura di inoculo
Durata: ± 1 h ogni linea cellulare
Il pulcino di sviluppo embrionale giorno 9, le uova vengono inoculati sotto flusso d'aria laminare.
Valutazione della cellula tumorale diffondendo la CAM richiede contenimento delle cellule ad una superficie limitata durante l'inoculo. Matrigel è una matrice (ECM) gel extracellulare dal sarcoma di topo Engelbreth-Holm-Swarm frequentemente utilizzata in condizioni di coltura delle cellule sperimentali. Si tratta di un fluido quando raffreddato, ma a polimerizzazione attivato termicamente quando portato a 20 - 40 ° C, formando così un gel stabile. Durantegli esperimenti, Matrigel è conservato in una scatola contenente ghiaccio fondente.
Nota: Noi insistiamo a non utilizzare lamelle forate. Abbiamo osservato l'attaccamento e la crescita delle cellule tumorali innestate sul disco di plastica di polarizzazione in tal modo il potenziale di crescita delle cellule della membrana stessa.
- Risospendere il pellet cellulare in gel ECM raffreddato ad una concentrazione di 10 6 cellule/100 gel ECM microlitri. Conservare questa soluzione sulla fusione del ghiaccio.
- Parte delle accise della membrana semipermeabile con un paio di sterile chirurgica sotto flusso d'aria laminare. Se il film adesivo viene rimosso completamente, questo si tradurrà in una proporzione maggiore di morte embrionale causa della contaminazione.
- Toccare destra CAM sotto la finestra guscio leggermente con una bacchetta di vetro sterile, al fine di rimuovere lo strato di cellule epiteliali. Toccando la CAM con una bacchetta di vetro sterile dimostra meno traumatico rispetto all'utilizzo di un bisturi n ° 11, che richiede più praticità ed esperienza. Possono verificarsi piccole emorragie.
- Adding materiale tumorale.
- Per innesti tumorali: abbassare delicatamente un pezzo di tessuto sulla CAM con un paio di pinze sterili, senza schiacciarla.
- Per la procedura di gel ECM: 4x Aggiungere 25 microlitri della cellula-ECM sospensione gel alla CAM, uno sopra l'altro, permettendo al gel ECM per polimerizzare tra le applicazioni. In questo modo viene creata una placca aderente contenente le cellule tumorali.
- Sigillare di nuovo la finestra di shell con un film adesivo semipermeabile.
4. Imaging e raccolta del CAM
Durata: 2 ore per 25 uova
Il pulcino di sviluppo embrionale giorno 16, le camme sono raccolti. Lavorare sotto flusso d'aria laminare non è necessario.
- Ingrandire la finestra con un paio di forbici chirurgiche. Assicuratevi di non tagliare troppo basso, altrimenti la CAM sarà danneggiato, con conseguente sanguinamento dei vasi feriti.
- Aggiungere 300 - 500 ml di PBS D con una pipetta sulla setta CAMione contenente il materiale inoculato. Se non si utilizzano sonde fluorescenti, formaldeide tamponato può essere utilizzato come tale rende la membrana rigida per facilitare il taglio della membrana.
- Fare una fotografia della CAM nell'uovo attraverso un microscopio a fluorescenza stereo, dotato di una fotocamera digitale a colori, utilizzando sia la GFP o il filtro DSR, e senza filtro. Per gli innesti tumorali, tutte le fotografie sono fatte senza filtri. L'illuminazione dall'alto da luci a LED è fortemente raccomandato durante fotografare (Figura 2).
- Record di migrazione delle cellule tumorali per le cellule marcate. I confini dei tumori possono essere irregolari e sfilacciati. Cellule sparse possono essere presenti vicino ai confini del tumore. In alcuni esemplari, possono essere osservate file di cellule tumorali (Figura 3).
- Tagliare la membrana con un paio di forbici sterili al confine sdraiato contro il guscio.
- Posizionare il CAM raccolte in una capsula di Petri sterile pieno di PBS D o tamponata performaldeide.
- Fare una fotografia sia del lato superiore e il lato inferiore della CAM, con e senza filtro.
- Mettere la membrana in un contenitore etichettato con formaldeide tamponata per almeno 72 ore.
- Incorpora la Cam in paraffina e li prepara per l'esame istologico. Aver cura di tagliare gli innesti tumorali al centro del nodulo, assicurandosi che la superficie di taglio è parallelo al fondo della cassetta. Se non, l'interazione tra la camma e l'innesto del tumore non sarà visibile. La stessa strategia vale per le placche gel ECM: la superficie rivolta verso la lama di taglio deve essere perpendicolare alla placca.
5. Valutazione istologica
Ematossilina-eosina e Ki-67 immunoistochimica sono state eseguite per ulteriori chiarimenti, se necessario. L'immunoistochimica è stata eseguita su sezioni di tessuto incluse in paraffina fissati in formalina di 3,5 micron di spessore, utilizzando un Stainer presentazione automatica secondoalle istruzioni del produttore. È stato usato un anticorpo monoclonale di topo primario Ki-67 (clone MIB-1, diluizione 1/100). Indotta dal calore epitopo recupero è stata effettuata utilizzando cellule condizionata 1, e la visualizzazione è stato raggiunto con l'universale DAB Detection Kit, secondo le istruzioni del produttore. Disidratazione delle sezioni di tessuto è stata effettuata utilizzando un Montavetrini automatizzato.
Per il linee cellulari SW1353 SAOS2 e, il numero di Ki67-positive e negative Ki67-cellula nuclei/100 micron 2 sono stati contati in tre zone: una vicino al confine della CAM, uno vicino la superficie e una al centro di il gel placca ECM. Questa procedura è stata ripetuta per ogni slitta 6x Ki-67 tinto. L'indice di proliferazione è stata determinata per ciascun vetrino dividendo il numero di cellule Ki67-positive per il numero totale di cellule contate.
Necrosi è definito da una perdita di dispersione fine della cromatina nel nucleo della cellula, accompagnato da fading dei margini delle celle distinte. Per xenotrapianti, necrosi è segnato come completo, parziale (spesso in superficie), o assenti. Infiltrazione di cellule tumorali nella camma è definita dalla osservazione di cellule tumorali nel mesoderma della CAM, ed è segnato come presente o assente.
Tre elementi sono segnati per comportamento host. Fibroblasto infiltrazione è definito come cellule allungate lasciando la CAM e invadendo l'innesto del tumore / targa, ed è segnato come presente o assente. Vascolare ricrescita può osservare come la crescita interna di vasi proliferanti pulcino, caratterizzati dalla presenza di eritrociti nucleati pulcino.
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Representative Results
Valutazione della CAM
Innesti tumorali diventano aderente al CAM (Figura 2A). Sospensioni di cellule singole a partire da materiali paziente spesso mostrano una, la placca leggermente rialzato secca (Figura 2D). Dopo l'asportazione della CAM, contrassegnato raggrinzimento della membrana avviene (figure 2E e 2F).
Per le linee cellulari commerciali la placca diventa più opaco nel tempo, indicando proliferazione cellulare. Diverse linee cellulari in ECM gel hanno un modello di crescita distinto sulla CAM. SAOS2 forma una placca diffusione, con un netto aumento della superficie da giorno 7 dopo l'inoculazione, mentre il segnale GFP rimane forte, indicando cellule vitali. Migrazione delle cellule SAOS2 può essere parallelo immaginario per i vasi della CAM (Figura 3). Quando si osserva attraverso lo stereomicroscopio, i vasi sanguigni possono essere visti quando non viene utilizzato alcun filtro. Le cellule tumorali non possono essere individuate se non filter viene utilizzato. Non è possibile visualizzare i vasi sanguigni quando viene inserito un filtro GFP. Ruotando il filtro e spegnimento, lo stretto contatto tra le cellule migranti ei vasi sanguigni può essere visto. Puntiforme sanguinamento può essere osservata attraverso la placca (Figura 4, serie 1 e 2). Le placche contenenti SW1353 celle mostrano una riduzione della superficie e tendono a contrarre il CAM, risultante in una membrana rugosa dopo la raccolta esso (Figura 4, righe 5 e 6). Il segnale DSR diminuisce la sonda fluorescente diventa diluito dopo molte divisioni cellulari. Dal giorno 7, il sanguinamento si osserva frequentemente. Se si verifica emorragia, il segnale DSR diminuisce anche.
Reazione vascolare può essere visualizzato dopo l'asportazione della CAM alla vista inferiore, mostrando vasi tortuosi che circondano l'innesto o placca (Figura 2). Vascolare reazione della CAM è osservata nel gruppo tumorgraft, il gruppo sospensione singola cella (<strong> Figura 2C e 2F) e il gruppo di controllo gel ECM (figura 2G), ma non nei gruppi di controllo soluzione di cellule (Figura 2H). Nuovi vasi tortuosi possono essere osservati nel campione, ramificazione (Fig. 2I, punte di freccia) e anastomosing (Figura 2I, asterischi) con un altro; inoltre si verificano piccole aree di sanguinamento (Fig. 2I, frecce). Neovascolarizzazione del tumore può essere quantificato in H & E vetrini nelle diverse zone della placca tumore / tumore.
Evidenza istologica mostra che SAOS2 cellule mantengono un aspetto singola cella tutto il volume totale di ECM gel, provocando un aumento dello spessore e diametro della placca. Invadono lo strato mesoderma della CAM (Figura 5A, freccia), allargando così la distanza tra il endodermale e gli strati ectodermica della CAM come una cerniera di apertura (figura 5A (Figura 5B, freccia). Il numero di cellule e ammassi cellulari aumentare costantemente nel tempo, e il numero di cellule aumenta non proliferativa da 7 giorni, specialmente in corrispondenza della superficie della placca. Per SW1353, la contrazione del CAM può anche essere apprezzato sul H & diapositive E rispetto alle H & E scivoli di SAOS2.
Nonostante il loro sito ectopica di crescita, abbiamo scoperto che le caratteristiche essenziali e le caratteristiche di immunoistochimica dei tumori del sarcoma originali sono stati mantenuti nel CAM. Inoltre gli innesti tumorali diventano rivascolarizzati come dimostra la comparsa di eritrociti nucleati pulcino, gli innesti tumorali diventano infiltrate da fibroblasti di pollo e le cellule tumorali dal trapianto infiltrato il tessuto ospite CAM, illustrando l'affidabilità e Robustness del dosaggio CAM (Figura 6, riquadro in basso a sinistra). Per informazioni dettagliate si rimanda al Sys et al. 14.
Tempo di vendemmia
Cellula conteggio delle cellule Ki67-positivi e negativi-Ki67 mostra un aumento costante del numero totale di celle da 4 giorni per entrambe le linee cellulari. Dopo questa giornata il numero totale di cellule rimane stabile. Sette giorni dopo l'inoculazione, il numero di cellule Ki67-positive e il numero totale di cellule inizia a diminuire. Riguardo al numero di celle, vi è una correlazione significativa tra le tre zone. Tuttavia, si osservano una maggiore proporzione di cellule Ki67-positive vicino alla CAM, e una proporzione maggiore di cellule Ki67-negativi sulla superficie della placca (Figura 4, righe 3, 4, 7 e 8).
L'indice di proliferazione rimane relativamente stabile fino a sette giorni dopo l'inoculazione, dopo di che si comincia anche a diminuire. Il proliferatioindice n della linea cellulare SW1353 è notevolmente inferiore (P <0.05) rispetto alla linea cellulare SAOS2.
Anche se vi è una correlazione significativa tra le tre zone, è essenziale per contare i campi in tutte e tre le regioni del gel placca ECM, come si osserva una maggiore proporzione di cellule Ki67-positive vicino alla CAM e una quota maggiore di Ki67-negativi cellule alla superficie della placca (Figura 7).
Figura 1. Panoramica del protocollo. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Fotografie scattate durante il raccolto preoccupazioni fila superiore di pesca di uno tumorgraft da un condrosarcoma:. A = in situ, B = vista superiore in piastra di Petri, C = vista più bassa in capsula di Petri. Medio preoccupazioni fila raccolta di una sospensione singola cella in ECM gel: D = in situ, E = vista superiore in capsula di Petri, F = vista inferiore. Riga inferiore G = controllo matrigel, H = soluzione di controllo cellulare, I = bassa vista la visualizzazione di vasi di ramificazione e di sanguinamento. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 3. GFP fotografia di SAOS2 
Figura 4. Questa figura mostra le fotografie di entrambi SAOS2 (superiore 4 righe) e SW1353 (inferiore 4 righe) al giorno 1-8 dopo l'inoculazione. Riga 1 (scala bar 2 mm) mostra le fotografie del CAM in situ attraverso uno stereomicroscopio con filtro GFP. Row 2 (scala bar 2 mm) mostra gli stessi campioni attraverso lo stereomicroscopio mentre illuminato da LED dall'alto. Row 3 e 4 mostrano la H & E (riga 3, barra della scala 200 micron) e Ki67-macchiato (riga 4, barra di scala 200 o 500 micron), le immagini istologiche dagli stessi campioni. riga 5 (scala bar 2 mm) mostra le fotografie del CAM in situ attraverso uno stereomicroscopio con filtro DSR. riga 6 (scale bar 2 mm) mostra gli stessi campioni attraverso lo stereomicroscopio mentre illuminato da LED dall'alto. Row 7 e 8 mostrano la H & E (riga 7, scala bar 200 micron) e Ki67-macchiato (riga 8, barra di scala 200 e 500 micron) immagini istologiche dagli stessi campioni. Clicca qui per ingrandire la figura. 
Figura 5. Confronto di proliferazione delle cellule tumorali di SAOS2 e SW1353. Una crescita = di SAOS2 B = crescita di SW1353. 
Figura 6. Eritrociti nucleati pulcino può essere osservato nei capillari durante un liposarcoma tumorgraft alto grado (HE, 100X), inserto inferiorea sinistra. 
Figura 7. Grafico che mostra Ki67 + e Ki67-cellule nel tempo secondo la distanza dal CAM per entrambe le linee cellulari. Zona A = contro la CAM, zona C = superficie della placca, zona B = in-tra zona A e C.
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Discussion
Tempo di inoculazione e raccolto
Temporizzare il giorno di inoculazione è stata effettuata utilizzando SAOS2 in ECM gel (36 CAM) e variava tra lo sviluppo embrionale giorno 5 e 10.
Prima giornata di incubazione 9, il CAM non è stato sempre abbastanza grande per sostenere il gel ECM abbiamo applicato. Alla raccolta, le cellule tumorali a volte hanno dovuto essere recuperato dal CAM più profondo, e alcuni campioni di gel ECM giacevano sciolto nel albume o in CAM. Nei giorni 5 e 6, è stato difficile evitare di mettere le cellule tumorali sull'embrione pulcino, causando malformazioni pulcino o morte. Dal giorno 9, il CAM è stato completamente copre la superficie sotto la finestra nella maggior uova, ed ECM gel placche dimostrato aderente al CAM al momento del raccolto. Pertanto, abbiamo trovato il momento ideale per l'inoculazione di essere il giorno 9 dello sviluppo embrionale.
Per la determinazione del momento ideale di raccolta, SAOS2 e SW1353 sono state raccolte dopo respectively 1, 2 (solo SAOS2-GFP), 4, 5, 6, 7 e 8 giorni di post-inoculazione, o tra sviluppo embrionale giorno 10 e 17. A seguito di queste variazioni, la differenza di lunghezza di applicazione sulla CAM stato notato 1-12 giorni.
Knighton pubblicato marcate differenze nella crescita tumorale e rivascolarizzazione tumore per giorno di sviluppo embrionale al momento dell'applicazione tumore campione 17. Il conteggio delle cellule delle cellule Ki67-positivi e Ki67-negativi ha mostrato un aumento costante del numero totale di cellule provenienti da 4 giorni per entrambe le linee cellulari. Questo è concorde con il ritrovamento di Ausprunk et al. 21, che ha dichiarato che il periodo necessario per la rivascolarizzazione prende 72 ore. Dopo il conteggio del numero di celle e calcolo dell'indice di proliferazione, si può supporre che le cellule disperse nel gel ECM sono attivamente proliferando dal giorno 4 al giorno 6 dopo l'inoculazione. In base al diametro della placca, il numero totale di cellule e l'indice diproliferazione, ci suggeriscono che il momento ideale per la raccolta è il giorno 16 di sviluppo embrionale, o sette giorni dopo l'inoculazione.
L'arco di tempo suggerito lascia ricercatori una finestra di sei giorni per l'applicazione di agenti, mentre le cellule si moltiplicano attivamente, sia una volta il giorno 4 dopo l'inoculazione o tutti i giorni durante l'intero periodo di tempo. Per la somministrazione topica, il composto viene applicato sulla superficie CAM. Questo percorso è il più comunemente usato, a causa della accessibilità al CAM semplicemente aprendo il guscio / pellicola adesiva 22,23. Sebbene la somministrazione IV è fattibile, la difficoltà di inserire aghi nei vasi CAM è una limitazione critica. Inibitori della chinasi sono applicati su base giornaliera 24; chemioterapia una volta durante l'esperimento. Ipotizziamo che l'aggiunta di un composto, una volta è l'equivalente del trattamento clinico con citotossico dei citostatici, gestiti classicamente volta ogni 3 settimane, mentre l'aggiuntail composto su base giornaliera rifletterà la dose giornaliera di inibitori della chinasi in ambito clinico. Tuttavia, dobbiamo tenere a mente che la somministrazione topica mostrerà diverse cinetiche / metabolismo rispetto orale o somministrazione per via endovenosa nei pazienti.
Significato della tecnica e le possibili applicazioni future
Conservazione della morfologia cellulare è di primaria importanza quando le colture cellulari vengono utilizzati in modelli preclinici. L'utilizzo di matrici extracellulari omogenei quali collagene tipo I o 25 ECM gel 26 ripristina l'ambiente cellula tumorale, permettendo un modello di crescita più naturale.
Contrariamente alle prove in vivo, in vitro non contenere cellule stromali come le cellule vascolari angiogenici, infiltranti cellule immunitarie o di cellule fibroblastiche cancro-associate necessarie per ricostituire il microambiente tumorigenico 27. Quando il CAM-dosaggio è utilizzato per il Votoione di tumorgrafts, abbiamo descritto un tipico 'cono invasione' dal CAM verso i tumorgrafts, riflettendo il reclutamento di cellule stromali del pulcino dal tumorgraft 14.
La CAM-test fornisce una combinazione di ripristinare la matrice extracellulare da ECM gel e fornendo le cellule ospiti per la ricostituzione del microambiente cancerogeno. Come la CAM e la tumorgraft / targa sono facilmente accessibili, la somministrazione di composti è facile. In questo modo, il CAM-dosaggio apre nuove prospettive verso la valutazione preclinica di tipi di tumore rari come sarcomi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Le cellule della linea cellulare SW1353 condrosarcoma sono stati gentilmente forniti dal Prof. Dr. PCW Hogendoorn e il Prof. Dr. J. Bovée di Leida, Paesi Bassi. Ringraziamo J. Mestach e G. Wagemans per l'eccellente supporto tecnico, e G. De Bruyne per il disegno professionale della panoramica del nostro protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
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