Summary
La
Abstract
El sarcoma es una enfermedad muy rara que es de naturaleza heterogénea, todos obstaculicen el desarrollo de nuevos tratamientos. Pacientes con sarcomas son candidatos ideales para la medicina personalizada después de la estratificación, que explica el interés actual en el desarrollo de un modelo de xenotrasplante reproducible y de bajo costo para esta enfermedad. La membrana corioalantoidea de pollo es un anfitrión inmunodeficiente natural capaz de sostener los tejidos y las células injertadas sin restricciones específicas de la especie. Además, es de fácil acceso, manipulado y fotografiado usando microscopía estereoscópica óptica y de fluorescencia. Histología permite un análisis más detallado de las interacciones celulares heterotípicos.
Este protocolo se describe en detalle la in ovo de injerto de la membrana corioalantoidea con sarcoma de tejidos frescos derivados del tumor, sus suspensiones de células individuales, y la etiqueta fluorescente establecidos líneas celulares de sarcoma permanentes y transitorios (Saos-2 y SW1353). La rata de supervivencia de los pollueloses son hasta un 75%. El modelo se utiliza para estudiar injerto (viabilidad, índice de proliferación Ki67, la necrosis, la infiltración) y el anfitrión (la infiltración de fibroblastos, crecimiento vascular) comportamiento. Para localizada injerto de suspensiones de células individuales, ECM gel proporciona ventajas significativas sobre los materiales inertes de contención. El índice de proliferación Ki67 se relaciona con la distancia de las células de la superficie de la CAM y la duración de la aplicación sobre la CAM, este último la determinación de un marco de tiempo para la adición de productos terapéuticos.
Introduction
El sarcoma es un tumor poco frecuente de los tejidos conectivos con una alta mortalidad por 1,2 resistencia a la terapia. El progreso en la supervivencia del paciente se ve obstaculizada por su baja incidencia anual, su amplia diversidad, y el hecho de que las células del sarcoma son reportados a ser difícil de cultivo in vitro 3,4.
El uso de células cultivadas para la evaluación de la terapia preclínica ha puesto de manifiesto que, aparentemente nuevas moléculas activas in vitro no siempre reflejan los resultados en el entorno clínico. Por otra parte, las aberraciones del genoma reveladas por las matrices de expresión génica no siempre son correlacionados con características de comportamiento del tumor en el paciente individual 5-7. Con el fin de tratar de resolver estos problemas, la medicina personalizada ha ganado en importancia, lo que se refleja en el aumento de búsqueda de modelos de xenoinjertos 8-12.
Un ensayo in vivo tiene la ventaja de reflejar la compleja interacción entre cÁNCER células y el medio ambiente tejido del huésped en los tumores sólidos, que sean necesarias para la proliferación del cáncer y la invasión 13. Actualmente se estudia el uso de la prueba de la membrana corioalantoides (CAM-ensayo) como un modelo de xenotrasplante reproducible para el sarcoma 14,15. Este ensayo es ampliamente utilizado para el estudio de la angiogénesis tumoral 16,17. En la literatura, sin embargo, hemos encontrado diferentes protocolos para este ensayo, mientras que otros estudios se observó una marcada diferencia en el crecimiento o la angiogénesis de acuerdo con diferentes protocolos de 18,19.
En este artículo se investiga el efecto de la variación de las condiciones del ensayo-CAM en el comportamiento celular mediante injertos tumorales, suspensiones de células individuales derivados del tumor y los cultivos celulares de sarcoma establecidos.
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Protocol
Ver Figura 1 para una visión general
Material tumoral
1. Obtención y preparación de las muestras tumorales
Para el uso de material del paciente, es necesario la aprobación del Comité de Ética y consentimiento informado tiene que ser obtenida del paciente.
- Material de cosecha representante (mínimo 1 cm 3) en el momento de la intervención, ya sea una biopsia o una resección de un sarcoma. El lugar adecuado de la biopsia se define utilizando dinámica de contraste de resonancia magnética.
- Coloque el material inmediatamente en un vial estéril que contiene DMEM suplementado con 1.000 U de penicilina y 1 mg / ml de estreptomicina.
- Transporte el vial inmediatamente (30-90 min) al laboratorio.
Todos los siguientes procedimientos se realizan bajo un flujo laminar.
- Verter el contenido del vial en una placa de Petri estéril.
- Coloque la muestra de tumor en pequeñas partes de máximo 1 mm 3 utilizando un bisturí estéril. Retire todas las partes calcificadas ya que tienden a deteriorar aún más el procesamiento del tejido.
- Tomar al azar 10 injertos tumorales para su aplicación en la CAM.
2. Preparación de derivados del tumor Suspensiones sola célula
Duración aproximada: 3 horas
- Pesar el tejido restante de la muestra.
- Ponga 2 - puede ser necesario 4 g de tejido en un tubo de disociador, más de un tubo de digerir todo el tejido tumoral restante.
- Para la digestión de 2 - 4 g de tejido, añadir 2,5 ml de solución de colagenasa 2 (500 U / ml de RPMI 1640) y 2,5 ml de solución de DNasa (22 KU / ml de RPMI 1640).
- Procesar el tejido de acuerdo con el protocolo h_tumor disociador. Esto implica 2 ciclos de incubación a 37 ° C en CO 2 incubadora mientras que el tubo se agita suavemente durante 30 min.
- Se filtra la suspensión restante a través de un filtro de células de 150 micras.
- Se centrifuga el lisado a 1.000 rpm durante 5 millasn.
- Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 10 ml de tampón de lisis de eritrocitos (ELB), permitiendo 10 minutos de incubación con suspensión regular.
Nota: tampón de lisis de los eritrocitos se fabrica de la siguiente manera: Añadir 0,037 g de EDTA, 0,99 g de K 2 HPO 4, 8,29 g de NH4Cl a 1000 ml de agua, usar NaOH 10 N para ajustar el pH a 7,3, filtro bajo presión a través de unas 0,22 micras filtrar. Almacenar a 4 ° C.
- Añadir 25 ml de medio de cultivo (DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina) para detener la reacción.
- Centrifugar la suspensión a 1000 rpm durante 5 min. El color de la pastilla debe ser blanco ahora.
- Eliminar el sobrenadante.
- Añadir 5 ml de medio a la pastilla. Se filtra la suspensión a través de un filtro de células de 70 micras.
- Contar el número de células vivas / ml por medio de un contador de células automático.
3. CLíneas celulares Ancer
SAOS2 células de osteosarcoma (número de registro ATCC: HTB-85) que expresan la proteína verde fluorescente se sometieron a electroporación por el vector pEGFP-C1 usando la Línea Celular Nucleofector Kit de V de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para establecer líneas celulares estables, las células transfectadas se seleccionaron en G418 (1 mg / ml) durante 4 semanas de acuerdo con el protocolo establecido anterior 20. Además clasificación se llevó a cabo por clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Las células de la línea celular SW1353 condrosarcoma (número de registro ATCC: HTB-94) o suspensiones de células individuales tumorales recién preparados están etiquetados utilizando una membrana lipofílica fluorescente mancha roja.
- Retire las células del frasco de cultivo de una manera clásica usando tripsina (0,5% peso / volumen) de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA; 0,2% en peso / vol) de solución.
- Centrifugar la suspensión celular durante 5 min a 1000 rpm.
- Retire el supernatant.
- Añadir 1 ml de medio libre de suero y 5 l Dil (Vybrant rojo) / 10 6 células.
- Envuelva el vial en papel de aluminio y colocarlo en la incubadora de CO 2 durante 10 minutos a 37 ° C.
- Se centrifuga de nuevo durante 5 min a 1000 rpm y eliminar el sobrenadante.
Ensayo de membrana corioalantoidea
1. La incubación del huevo
- Se requieren huevos fertilizados de un criadero local comercial garantiza el 95% de fertilización de los huevos.
- Los huevos fertilizados se pueden almacenar a temperatura ambiente hasta por 10 días.
Nota: antes de comenzar la incubación, la suciedad, las plumas y excrementos se retiran cuidadosamente de las cáscaras de huevo mecánicamente por lavado en seco con toallas de papel, que tienen un duro en lugar de una estructura de superficie blanda. Limpieza de los huevos con 70% de etanol desnaturalizado o cualquier otro reactivo de limpieza reduce significativamente la tasa de supervivencia de los embriones de pollo.
- Ponga los huevos en la incubator en un lado, marcando la superficie superior. El día en el que los huevos se ponen en la incubadora se designa 0 días de desarrollo embrionario.
- Ajuste la temperatura de incubación a 37,8 º C, y la humedad al 47%. Asegúrese de que la opción de rotación automática está desactivada.
2. Apertura de los huevos
Duración: ± 60 min para 25 huevos
En el día 3 de desarrollo, los huevos se abren bajo flujo de aire laminar. Abrir los huevos en una etapa de desarrollo más resultados en daños a la CAM, como la membrana tiende a pegarse a la cáscara. Una lámpara de infrarrojos se utiliza para mantener los huevos calientes durante el procedimiento. Para mejorar la esterilidad, se recomienda el uso de guantes de la mano.
- Coloque el huevo en la huevera, con el lado marcado hacia arriba.
- Bajar el nivel de la CAM mediante la eliminación de dos ml de albúmina a través de una aguja de 18 G insertado en la punta del huevo. Si la aguja no está afilada después de perforar varioscáscaras de huevo, cambiar la aguja. Si no es así, el exceso de fuerza tiene que ser ejercida, lo que podría dañar la yema de huevo o la fractura de la cáscara. A veces, la aguja está bloqueado por la chalaza, uno de 2 bandas espirales de suspensión de la yema en la albúmina. Esto se puede resolver, presionando suavemente el émbolo hacia abajo hasta que se resuelva el bloque. Si la yema de huevo es aspirado en la jeringa, reemplazar la aguja, así como la jeringa. A veces, el embrión muere después de este evento. Si se elimina una cantidad insuficiente de la albúmina, la CAM se daña cuando se quita la cáscara.
- Aplicar una película adhesiva semipermeable en el lado superior marcada de la cáscara con el fin de evitar que se derrame de partículas de conchas en la CAM, mientras que el corte de la ventana.
- Hacer un agujero de introducción con un punzón pequeño en la superficie del huevo.
- Cortar una ventana de 1 cm 2 en el depósito, con un par de tijeras quirúrgicas puntiagudos estériles.
- Corazón palpitante del embrión y vasos adyacentes se pueden observar en el thsuperficie e de la yema de huevo. Retire los huevos no fertilizados o embriones muertos. Un aspecto interrumpida de los vasos sanguíneos caracteriza embriones muertos.
- Selle la ventana con una película adhesiva semipermeable. No es necesario para cubrir el sitio de punción, a menos que la cáscara se ha agrietado durante la inserción de la aguja.
3. Procedimiento de inoculación
Duración: ± 1 hora por cada línea celular
En el desarrollo de embriones de pollo día 9, los huevos se inoculan bajo flujo de aire laminar.
Evaluación de las células de cáncer de difusión a través de la CAM requiere la contención de las células a una superficie limitada durante la inoculación. Matrigel es una matriz (ECM) de gel extracelular del sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm utilizado con frecuencia en condiciones de cultivo celular experimentales. Se trata de un líquido cuando se enfría, pero sufrirá polimerización térmicamente activado cuando se pone a 20 - 40 º C, formando de esta manera un gel estable. Durantelos experimentos, Matrigel se mantiene en una caja que contiene la fusión del hielo.
Nota: Insistimos en no utilizar cubreobjetos perforadas. Se observó unión y el crecimiento de las células cancerosas injertadas en el disco de plástico de desviación por lo tanto el potencial de crecimiento de las células de la propia membrana.
- Resuspender el sedimento celular en gel de ECM enfriado a una concentración de 10 6 células/100 gel de ECM l. Mantener esta solución en la fusión del hielo.
- Impuestos Especiales parte de la membrana semipermeable con un par de quirúrgica estéril bajo flujo de aire laminar. Si la película de adhesivo se elimina por completo, esto se traducirá en una mayor proporción de la muerte del embrión debido a la contaminación.
- Toque la derecha CAM por debajo de la ventana de shell suavemente con una varilla de vidrio estéril, con el fin de eliminar la capa de células epiteliales. Tocar la CAM con una varilla de vidrio estéril demuestra ser menos traumática que el uso de un bisturí n º 11, que requiere más destreza y experiencia. Pueden producirse hemorragias pequeñas.
- Ladding material tumoral.
- Por injertos tumorales: baje suavemente una pieza de tejido en la CAM con un par de pinzas estériles, sin apretar.
- Para el procedimiento de gel de ECM: 4x Añadir 25 l de la suspensión celular del gel-ECM a la CAM, en la parte superior de uno al otro, permitiendo que el gel de ECM para polimerizar entre las aplicaciones. De esta manera se crea una placa adherente que contiene las células cancerosas.
- Selle la ventana del shell de nuevo con una película adhesiva semipermeable.
4. Imágenes y recolección de la CAM
Duración: 2 horas para 25 huevos
En el desarrollo de embriones de pollo 16 días, las CAM se cosechan. Trabajando bajo flujo de aire laminar no es necesario.
- Amplíe la ventana con un par de tijeras quirúrgicas. Asegúrese de no cortar demasiado, de lo contrario la CAM se dañará, lo que resulta en el sangrado de los vasos lesionados.
- Agregar 300 - 500 l de PBS D con una pipeta sobre la secta CAMde iones que contiene el material inoculado. Si no se usan sondas fluorescentes, formaldehído tamponado puede ser utilizado como esto hace que la membrana más rígida, lo que facilita el corte de la membrana.
- Hacer una fotografía de la CAM en el huevo a través de un microscopio de fluorescencia estéreo, equipado con una cámara digital en color, utilizando tanto la GFP o el filtro de DSR, y sin filtro. Para los injertos tumorales, todas las fotografías se toman sin filtros. Iluminación desde arriba por las luces LED se recomienda durante la fotografía (Figura 2).
- Registro de migración de células tumorales de las células marcadas. Las fronteras de los tumores pueden ser irregulares y deshilachados. Células aisladas pueden estar presentes cerca de los límites del tumor. En algunas muestras, se pueden observar las filas de las células tumorales (Figura 3).
- Cortar la membrana con un par de tijeras estériles en la frontera se extiende contra la cáscara.
- Coloque la CAM recolectadas en una placa de Petri estéril llena con PBS D o tamponada paraformaldehído.
- Hacer una fotografía de tanto el lado superior y el lado inferior de la CAM, con y sin filtro.
- Colocar la membrana en un recipiente etiquetado con formaldehído tamponado durante al menos 72 horas.
- Insertar las CAM en parafina y prepararlos para el examen histológico. Tener cuidado para cortar los injertos tumorales en el centro del nódulo, asegurándose de que la superficie de corte es paralelo a la parte inferior de la casete. Si no, la interacción entre la leva y el injerto del tumor no será visible. La misma estrategia se aplica a las placas de gel de ECM: la superficie que mira hacia la cuchilla de corte debe ser perpendicular a la placa.
5. Evaluación Histológica
Tinción Hematoxilina-Eosina y Ki-67 inmunohistoquímica se realizaron para cualquier aclaración, si es necesario. La inmunohistoquímica se realizó sobre secciones de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina de 3,5 m de espesor, utilizando una tinción de portaobjetos automatizada segúna las instrucciones del fabricante. Se utilizó un anticuerpo monoclonal primario de ratón para Ki-67 (clon MIB-1, dilución 1/100). El calor inducido por recuperación del epítopo se realizó mediante acondicionamiento de células 1, y la visualización se logró con el Kit de detección de DAB universal, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Deshidratación de las secciones de tejido se realizó utilizando un cubreobjetos automatizado.
Para la las líneas de células SW1353 SAOS2 y, el número de células Ki67-positivo-negativo y Ki67 nuclei/100 2 micras fueron contados en tres zonas: una cerca de la frontera de la CAM, uno cerca de la superficie y uno en el centro de la placa de gel de ECM. Este procedimiento se repitió 6 veces para cada diapositiva Ki-67 manchado. El índice de proliferación se determinó para cada diapositiva dividiendo el número de células Ki67 positivas por el número total de células contadas.
La necrosis se define por una pérdida de dispersión fina de la cromatina en el núcleo de la célula, acompañado por fading de márgenes distintos de células. Para xenoinjertos, la necrosis se anotó como completa, parcial (a menudo en la superficie), o está ausente. La infiltración de células tumorales en la CAM se define por la observación de las células tumorales en el mesodermo de la CAM, y se anotó como presente o ausente.
Tres elementos se anotaron para el comportamiento del sistema. Infiltración de fibroblastos se define como células alargadas dejando la CAM e invadiendo el injerto / placa del tumor, y se anotó como presente o ausente. Crecimiento vascular se puede observar como crecimiento hacia el interior de la proliferación de los vasos de pollo, que se caracteriza por la presencia de eritrocitos de pollo nucleadas.
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Representative Results
Evaluación de la CAM
Injertos tumorales se vuelven adherentes a la CAM (Figura 2A). Suspensiones de células individuales de material del paciente con frecuencia muestran una placa ligeramente elevada seca (Figura 2D). Después de la escisión de la CAM, marcada arrugamiento de la membrana se produce (Figuras 2E y 2F).
Para las líneas celulares comerciales la placa se hace más opaca en el tiempo, lo que indica proliferación celular. Diferentes líneas celulares en ECM gel tienen un patrón de crecimiento diferente en la CAM. SAOS2 forma una placa de difusión, con un claro aumento de la superficie a partir de 7 días después de la inoculación, mientras que la señal de GFP sigue siendo fuerte, lo que indica las células viables. La migración de las células SAOS2 se puede visualizar en paralelo a los vasos de la CAM (Figura 3). Cuando se observa a través del microscopio estereoscópico, los vasos sanguíneos se pueden ver cuando no se utiliza ningún filtro. Las células tumorales no se pueden discernir cuando no hay fse utiliza iltrar. No es posible visualizar los vasos sanguíneos cuando se inserta un filtro de GFP. Girando el filtro de encendido y apagado, el estrecho contacto entre las células que migran y los vasos sanguíneos se pueden ver. Puntiforme sangrado se puede observar a través de la placa (Figura 4, las filas 1 y 2). Las placas que contienen las células SW1353 muestran una disminución de la superficie y tienden a contraer la CAM, lo que resulta en una membrana arrugada después de la cosecha (Figura 4, las filas 5 y 6). La señal DSR disminuye a medida que la sonda fluorescente se diluye después de muchas divisiones celulares. A partir del día 7, se observa frecuentemente sangrado. Si se produce una hemorragia, la señal DSR también disminuye.
Reacción vascular puede ser visualizada después de la escisión de la CAM en la vista inferior, que muestra los vasos tortuosos que rodean el injerto o la placa (Figura 2). Reacción vascular de la CAM se observa en el grupo de tumorgraft, el grupo de suspensión de células individuales (<fuerte> Figura 2C y 2F) y el grupo de control gel de ECM (Figura 2G), pero no en los grupos de control de solución de células (Figura 2H). Nuevos vasos tortuosos pueden observarse entrar en la muestra, ramificación (Figura 2I, puntas de flecha) y anastomosis (Figura 2I, asteriscos) uno con el otro; también se producen pequeñas áreas de hemorragia (Figura 2I, flechas). La neovascularización del tumor se puede cuantificar en H & E diapositivas en las diferentes zonas de la placa del tumor / tumor.
Evidencia histológica muestra que las células SAOS2 mantienen una sola aparición de células en todo el volumen completo de gel de ECM, causando un aumento del grosor y el diámetro de la placa. Invaden la capa mesodérmico de la CAM (Figura 5A, flecha), aumentando así la distancia entre el endodérmico y las capas ectodérmica de la CAM como una abertura de la cremallera (Figura 5A (Figura 5B, flecha). El número de células y grupos de células aumentar de manera constante en el tiempo, y el número de células no proliferativas aumenta de 7 días, especialmente en la superficie de la placa. Para SW1353, la contracción de la CAM también se puede apreciar en la H & E diapositivas cuando se compara con las diapositivas de SAOS2 H & E.
A pesar de su sitio ectópico de crecimiento, se encontró que las características esenciales y las características de inmunohistoquímica de los tumores del sarcoma de originales se mantuvieron en la CAM. Además de los injertos tumorales se vuelven revascularizados como se evidencia por la aparición de eritrocitos de pollo nucleadas, los injertos tumorales son infiltradas por los fibroblastos de pollo y células tumorales desde el injerto infiltrado en el tejido del huésped CAM, que ilustra la fiabilidad y Robustness del ensayo CAM (Figura 6, recuadro inferior izquierdo). Para más información detallada nos referimos a Sys et al. 14.
Tiempo de cosecha
Recuento de células de células Ki67 positivos y Ki67-negativa muestra un aumento constante en el número total de células de 4 días para las dos líneas celulares. Después de este día el número total de células se mantiene estable. Siete días después de la inoculación, el número de las células Ki67 positivas y el número total de células comienza a declinar. En cuanto al número de células, existe una correlación significativa entre las tres zonas. Sin embargo, se observó una mayor proporción de células Ki67 positivas cerca de la CAM, y una proporción mayor de células Ki67-negativas en la superficie de la placa (Figura 4, filas 3, 4, 7 y 8).
El índice de proliferación se mantiene relativamente estable hasta siete días después de la inoculación, de lo cual también comienza a disminuir. El proliferatioíndice n de la línea celular SW1353 es significativamente menor (P <0,05) en comparación con la línea celular SAOS2.
Aunque existe una correlación significativa entre las tres zonas, es esencial para contar los campos en las tres regiones en la placa de gel de ECM, como se observa una mayor proporción de células Ki67 positivas cerca de la CAM y una mayor proporción de Ki67-negativo las células en la superficie de la placa (Figura 7).
Figura 1. Descripción general del protocolo. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Fotografías tomadas durante la cosecha preocupaciones fila superior de captura de un tumorgraft de un condrosarcoma:. A = in situ, B = Vista superior de una placa de Petri, C = baja visión en una placa de Petri. Preocupaciones fila del medio de recolección de una suspensión de células individuales en ECM gel: D = in situ, E = Vista superior de una placa de Petri, F = vista inferior. Fila inferior G = control de matrigel, H = solución de control celular, I = vista inferior que muestra vasos ramificados y sangrado. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. GFP fotografía de SAOS2 
La Figura 4. Esta figura muestra fotografías de tanto SAOS2 (superior 4 filas) y SW1353 (bajar 4 filas) en el día 1 a 8 después de la inoculación. Fila 1 (barra de escala de 2 mm) muestra las fotografías de la CAM in situ a través de un microscopio estereoscópico con filtro de GFP. Vuelta 2 (barra de escala 2 mm) muestra las mismas muestras a través del microscopio estereoscópico mientras iluminado por LEDs de arriba. Row 3 y 4 muestran la H & E (fila 3, barra de escala 200 m) y Ki67 manchada (fila 4, la barra de escala 200 o 500 micras) imágenes histológicas de las mismas muestras. Fila 5 (barra de escala 2 mm) muestra las fotografías de la CAM in situ a través de un microscopio estereoscópico con filtro de DSR. Fila 6 (scale barra de 2 mm) muestra las mismas muestras mediante el microscopio estereoscópico, mientras que iluminado por LED desde arriba. Fila 7 y 8 muestran la H & E (fila 7, barra de escala 200 micras) y Ki67-manchado (fila 8, barra de escala 200 y 500 micras) imágenes histológicas de las mismas muestras. Haga clic aquí para ver más grande la figura. 
Figura 5. Comparación de la proliferación de células tumorales de SAOS2 y SW1353. Un crecimiento de SAOS2 = B = crecimiento de SW1353. 
La Figura 6. Eritrocitos nucleados de pollo se pueden observar en los capilares a través de una tumorgraft liposarcoma de alto grado (HE, 100X), inserción bajaa la izquierda. 
Figura 7. Gráfico que muestra el Ki67 + y Ki67 las células con el tiempo de acuerdo con la distancia de la CAM para ambas líneas celulares. Zona A = contra la CAM, la zona C = superficie de la placa, en la zona B =-entre la zona A y C.
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Discussion
Tiempo de la inoculación y la cosecha
Medir el tiempo del día de la inoculación se realizó utilizando SAOS2 en gel de ECM (36 CAMs) y varió entre el desarrollo embrionario días 5 y 10.
Antes del día 9 de incubación, la CAM no fue siempre lo suficientemente grande para sostener el gel ECM se aplicó. En la cosecha, las células tumorales a veces tenían que ser recuperados de la CAM más profundo, y algunas muestras de gel ECM yacían sueltos en la albúmina o en la CAM. Los días 5 y 6, que era difícil evitar poner las células tumorales en el embrión de pollo, lo que resulta en malformaciones de pollo o la muerte. A partir del día 9, la CAM se cubra completamente la superficie de debajo de la ventana en la mayoría de los huevos, y las placas de gel de ECM resultó adherente a la CAM en el momento de la cosecha. Por lo tanto, nos encontramos el momento ideal para la inoculación de ser día 9 del desarrollo embrionario.
Para la determinación de la hora ideal de la cosecha, SAOS2 y SW1353 se cosecharon después de respectively 1, 2 (sólo SAOS2-GFP), 4, 5, 6, 7 y 8 días después de la inoculación, o entre el día 10 y el desarrollo embrionario 17. A raíz de estas variaciones, se observó una diferencia en la duración de la aplicación sobre la CAM 1-12 días.
Knighton publicó marcadas diferencias en el crecimiento del tumor y la revascularización del tumor de acuerdo con el día de desarrollo embrionario en el momento de aplicación de la muestra del tumor 17. Recuento de células de las células Ki67 positivas y Ki67-negativo mostró un aumento constante en el número total de células de 4 días para ambas líneas celulares. Esto es concordante con el hallazgo de Ausprunk et al. 21, que declaró que el período necesario para la revascularización toma 72 horas. Después de contar el número de células y el cálculo del índice de proliferación, podemos suponer que las células dispersadas en el gel de ECM están proliferando activamente desde el día 4 hasta el día 6 después de la inoculación. Basado en el diámetro de la placa, el número total de células y el índice deproliferación, sugerimos que el momento ideal para la cosecha es el día 16 del desarrollo embrionario, o siete días después de la inoculación.
El plazo propuesto deja a los investigadores una ventana de seis jornadas para la aplicación de agentes, mientras que las células se multiplican activamente, ya sea una vez en 4 días después de la inoculación o diariamente durante el marco de tiempo general. Para la administración tópica, el compuesto se aplica sobre la superficie de la CAM. Esta ruta es la más utilizada una, debido a la accesibilidad a la CAM con sólo abrir la cáscara del huevo / film 22,23 adhesivo. Aunque la administración IV es viable, la dificultad para insertar agujas en los vasos CAM es una limitación crítica. Inhibidores de la quinasa se aplican a diario 24, la quimioterapia una vez durante el experimento. Se postula que la adición de un compuesto de una vez es el equivalente del tratamiento clínico con citotóxico de los agentes citostáticos, que se administran clásicamente una vez cada 3 semanas, mientras que la adiciónel compuesto en una base diaria reflejará la dosis diaria de inhibidores de la quinasa en el entorno clínico. Sin embargo, debemos tener en cuenta que la administración tópica mostrará diferentes cinéticas / metabolismo en comparación con la administración oral o IV en los pacientes.
Importancia de la técnica y las posibles aplicaciones futuras
La preservación de la morfología celular es de primordial importancia cuando los cultivos de células se utilizan en los modelos preclínicos. El uso de matrices extracelulares homogéneos tales como colágeno de tipo I 25 o ECM gel de 26 restaura el ambiente de la célula tumoral, lo que permite un patrón de crecimiento más natural.
Contrariamente a los ensayos in vivo, los ensayos in vitro no contienen células estromales, tales como células vasculares angiogénicas, infiltran las células inmunes o células fibroblásticas de cáncer asociados necesarios para reconstituir el microambiente tumorigénico 27. Cuando el ensayo de CAM se utiliza para la evaiones de tumorgrafts, hemos descrito un típico 'cono invasión' de la CAM hacia los tumorgrafts, lo que refleja el reclutamiento de células del estroma de la chica por la tumorgraft 14.
El ensayo de CAM-proporciona una combinación de la restauración de la matriz extracelular por ECM gel y proporcionar células huésped para la reconstitución de la microambiente tumorigénico. Como la CAM y el tumorgraft / placa son fácilmente accesibles, la administración de compuestos es fácil. De esta manera, el ensayo de CAM-abre nuevas perspectivas a la evaluación preclínica de tipos de tumores raros tales como los sarcomas.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Las células de la línea celular de condrosarcoma SW1353 fueron amablemente proporcionados por el Prof. Dr. PCW Hogendoorn y el Prof. Dr. J. Bovée de la Universidad de Leiden, Países Bajos. Damos las gracias a J. Mestach y G. Wagemans excelente para la asistencia técnica y G. De Bruyne para el dibujo profesional de la información general de nuestro protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Line Nucleofector Kit V | Amaxa | VCA-1003 | |
| collagenase 2 solution (500 U/ml RPMI 1640) | Sigma Aldrich | C6885 | |
| DMEM | Invitrogen | 41965-039 | |
| DMSO | Sigma | D8418 | |
| Dnase solution | Sigma Aldrich | DN25 | |
| G418 | Invitrogen | 11811031 | |
| Matrigel | Sigma-Aldrich | E1270 | |
| mouse primary monoclonal antibody Ki67 | Dako Denmark | MIB-1 | |
| Paraformaldehyde | Fluka | D76240 | |
| PBS | Invitrogen | 20012019 | |
| PBSD | Invitrogen | 14040083 | |
| peGFP-C1 vector | Clontech | 632470 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15140163 | |
| RPMI | Invitrogen | 22409-015 | |
| Trypsin-EDTA solution | Invitrogen | 25300054 | |
| Vybrant cell-labeling DiI | Lifetechnologies | 22885 | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10227 | |
| digital color camera | Leica | DFC 340 FX | |
| Digital Egg Incubator | Auto Elex Co | R-COM 50 | |
| FACS | BD Biosciences | FACSAriaIII | |
| Gentlemacs C-Tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | |
| Gentlemacs Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | |
| Gentlemacs Dissociator User Manual containing h_tumor protocol | Miltenyi Biotech |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| semipermeable adhesive film (Suprasorb F) | Lohmann&Rauscher | 20468 | |
| stereo fluorescence microscope | Leica | M205 FA | |
| Tissue-Tek Film automated Coverslipper | Sakura | 6400 | |
| ultraView Universal DAB Detection Kit | Ventana Medical Systems Inc | 760-500 | |
| Ventana Automated Slide Stainer | Ventana Medical Systems | Benchmark XT |
References
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