Een effectieve Manual Uitbenerij methode om Intact Mouse neusweefsel bereiden met Bewaarde Anatomische Organisatie
Abstract
De zoogdieren neus is een multi-functioneel orgaan met ingewikkelde interne structuren. De neusholte is bekleed met diverse epitheel zoals reuk, ademhalings-en geschubde epitheel sterk kunnen verschillen in anatomische locaties, morfologie en functies. In volwassen muizen, is de neus bedekt met verschillende schedelbeenderen, het beperken van experimentele toegang tot interne structuren, vooral die in het achterste, zoals de belangrijkste reukepithelium (MOE). Hier beschrijven we een effectieve methode voor het verkrijgen van nagenoeg de volledige en intacte nasale weefsels met bewaarde anatomische structuur. Met behulp van chirurgische instrumenten onder een dissectie microscoop, we achtereenvolgens verwijder de schedel botten rond de neus weefsel. Deze procedure kan worden uitgevoerd op zowel paraformaldehyde-vaste en vers ontleed, gevilde muis hoofden. De gehele uitbenen duurt ongeveer 20-30 min, die aanzienlijk korter is dan de experimentele tijd die conventionele chemische basis deverkalking. Daarnaast presenteren we een eenvoudige methode om luchtbellen gevangen tussen turbinates, die van cruciaal belang voor het verkrijgen van intacte dunne horizontale of coronale of sagittale secties van de nasale voorbereiding weefsel te verwijderen. Neusweefsel bereid met onze methode kan worden gebruikt voor de hele montage waarneming van het gehele epitheel, evenals morfologische, immunocytochemische en RNA in situ hybridisatie en fysiologische studies, vooral in studies waar regiospecifieke onderzoek en vergelijking van belang.
Introduction
De zoogdieren neusholte bevat verschillende types van weefsels en organen die verschillende functies dienen. De neusholte maakt het inlaatdeel van de bovenste luchtwegen, die luchtvaart kunnen in en uit de longen. Ingeademde lucht door de neusholte waar het ondergaat temperatuur en vochtigheid conditionering 1, alsmede reinigings-of filteren aan irriterende en giftige stoffen en besmettelijke micro-organismen te verwijderen 2. Beide behandelingen worden uitgevoerd door nasale epitheel en subepitheliale weefsels, waaronder klieren en vaten uitgevoerd en zijn van cruciaal belang voor de bescherming van de lagere luchtwegen en de longen. Naast zijn rol bij de respiratie en epitheliale verdediging, de nasale weefsel bevat ook perifere sensorische apparaten van olfactorische en trigeminus systemen die een groot aantal chemische stoffen te detecteren in de passerende lucht. Afhankelijk van het systeem is geactiveerd, kan sensorische detectie van chemische stoffen in de neus te lokken ofweleen gevoel van geur, irritatie of pijn 3,4.
Het perifere olfactorische systeem is complex en bestaat uit verschillende anatomisch gescheiden olfactorische zintuigen in de neusholte. Onder hen, de belangrijkste reukepithelium (MOE) is de grootste, die goed is voor ongeveer 45-52% van de nasale epitheel bij knaagdieren 5 en is gelegen in de posterieure regio. In de anteroventral regio, is er een paar buisvormige structuren bekend als de vomeronasale orgaan 6, die zitten langs elke zijde van de nasale septum. Twee extra kleine groeperingen van olfactorische sensorische neuronen, die bekend staat als het septum orgaan van Masera 7,8 en de Gruneberg ganglion 9, wonen langs de ventrale septum en de dorsale binnenkomst gebied van de neusholte, respectievelijk. Deze perifere organen bevatten neuro-epitheel met onderscheidende kenmerken in morfologie, celmarker expressie, en fysiologische functie. Duizenden geur samen ontdekken zemoleculen met exquise gevoeligheid 10-12.
Naast de olfactorische zintuigen, de neusholte herbergt ook andere sensorische systemen. Het is bekend dat peptiderge trigeminal zenuwvezels aanwezig in het nasale epitheel, met name het luchtwegepitheel 13,14 zijn. Sommige van deze vezels te detecteren irriterende en giftige chemicaliën en zijn verantwoordelijk voor het initiëren van beschermende reflexen zoals hoesten en niezen 4,15. Irriterende geurende en bittere verbindingen kunnen ook worden gedetecteerd door een recent ontdekte populatie van solitaire chemosensory cellen (SCC), waarvan vele zijn geïnnerveerd door nervus zenuwvezels 16-19. Deze SCC liggen in een hogere dichtheid in het ingangsgebied van de neusholte en vomeronasal invoer leidingen, doorschemeren dat zij ook een beschermende functie dienen 16-18. Aldus kan neusepitheel aanzienlijk verschillen in functie, morfologie en celsamenstelling afhankelijk van hunanatomische locaties.
Zelfs binnen een en gespecialiseerde epitheel, zijn er regionale verschillen. De MOE is een voorbeeld van. De MOE lijnen verschillende turbinates die ingewikkeld en gekrulde structuur. Door hen, verschillende regio's van de MOE ervaring verschillende luchtstroom, en dus verschillende diffusie en klaring van de lucht geurmoleculen 20. Ook is het bekend dat olfactorische sensorische neuronen (ASN) expressie brengen van een bepaalde geur receptor bevinden zich in vier omzeild zones van de MOE 21,22. Hoe deze locatie verschil invloed reactie van een OSN aan geurstoffen is grotendeels onbekend. Bovendien hebben sommige OSN bevolkingsgroepen vertonen regionale voorkeur. Guanylylcyclase-D (GC-D) tot expressie OSNs hebben zonale distributies begunstiging van de cul-de-sac gebieden van de ectoturbinates 23,24. Meer recent, vonden we een subpopulatie van canonieke OSNs die transient receptor potential kanalen M5 uitdrukt (trPM5) en is bij voorkeur gelegen in de laterale en ventrale gebieden 25. Deze resultaten geven aan dat MOE niet uniform. Echter, hoe deze regionale verschillen beïnvloeden olfactorische codering wordt niet begrepen. Dit komt voor een deel omdat grondig fysiologische onderzoek van de MOE en de neus is beperkt door de moeilijkheid om intacte neusepitheel met bewaarde anatomische organisatie met behulp van de huidige methoden.
De nasale epitheel worden voornamelijk omringd door de voorste beenderen van de schedel, inclusief de neus, bovenkaak, palatine, jukbeen, en ethmoid botten. In volwassen muizen en andere knaagdiermodellen deze beenderen zijn hard en moeilijk zonder de nauw verbonden nasale weefsel, met name de delicate turbinates verwijderen. Vaak wordt chemische basis ontkalking gebruikt om botten zacht zodat cryosectioning nasale weefsels van morfologische, immunohistochemische en in situ hybridisatie studies, maar afhanding van de leeftijd van het dier, kan de ontkalking proces nachts tot 7 dagen duren 24,26-28. Deze behandeling is eveneens beperkt, omdat het vereist weefsel fixeermiddel bewaard. Daarnaast kunnen chemische ontkalking hard zijn en invloed hebben op de immunokleuring van sommige gevoelige antilichamen 29,30. Voor fysiologische studies, is levend weefsel nodig is, en dus zijn deze experimenten vaak uitgevoerd op geïsoleerde OSNs of MOE plakjes verkregen van pasgeborenen waarvan de schedel botten zijn dun en zacht 17,31,32. Fysiologische studies kunnen ook gebruik maken ganse berg voorbereidingen door het splitsen van het hoofd 25,33,34, maar meestal alleen de mediale oppervlak van de neus is goed bereikbaar, fysiologische opnames beperken op andere gebieden.
Hier beschrijven we een effectieve, handmatige ontbenen methode om intacte nasale weefsels te bereiden met bewaard gebleven originele anatomische structuur en morfologie. We sequentieel verwijder de belangrijkste beenderen van de voorsteschedel onder een dissectie microscoop om een bijna volledig intact neusepithelium bloot terwijl de dunne turbinate botten intact, tenzij de muizen zijn zeer oud en cryosectioning nodig is. Ook de werkwijze uit te breiden tot het verband tussen de nasale weefsels en reukkwabben, evenals de rest van de hersenen te behouden, waardoor het gemakkelijker gelijktijdig onderzoek van zowel perifere als centrale circuits. De methode kan worden gebruikt om paraformaldehyde-gefixeerde, evenals verse, levende neusweefsel bereiden. Zo is onze methode zal naar verwachting morfologische, immunohistochemische en fysiologische studies van de ademhaling, reukzin, en nasale schade en ziekte te vergemakkelijken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier toonden we aan een stap-voor-stap procedure voor het isoleren van intacte olfactorische en respiratoire weefsel van de muis neus door het achtereenvolgens verwijderen van het omringende bot terwijl het sparen onder het weefsel. We tonen aan dat een zorgvuldige botverwijdering zelfs de meest delicate weefsels in hun geheel kunnen bewaren. We delen ook inzicht in mogelijke modificaties van deze techniek, waarbij isoleren we zowel de hersenen en neus weefsel samen om de zenuwverbinding behouden. Deze nieuwe werkwijze …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies voor onderzoek (NIH / NIDCD 009269, 012831 en ARRA administratieve supplement NIH subsidies) te Weihong Lin. We hebben vooral danken de heer Tim Ford bij UMBC voor zijn technische bijstand bij video-opnamen en verwerken. Wij willen ook dr. Daphne Blumberg, mevrouw Chere Petty bij UMBC en de heer Nicholas McCollum bedanken van Olympus America Inc voor hun uitrusting hulp bij video-opnamen.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. . Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l’esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
