Korunan Anatomik Örgütü ile bozulmamış Fare Burun Doku hazırlamak için etkili bir Manuel kemik sıyırma Yöntemi
Abstract
Memeli burun karmaşık iç yapıları ile çok fonksiyonlu bir organdır. Burun boşluğu gibi anatomik yerleri, morfolojisi ve fonksiyonlarında belirgin farklılık, koku solunum ve skuamöz epitel gibi çeşitli epitel ile kaplı olduğu. Erişkin farelerde, burun özellikle iç yapıları, ana koku epiteli (MEB) olarak posterior bu olanlara deneysel erişimi sınırlayarak, çeşitli kafatası kemikleri ile kaplıdır. Burada korunmuş anatomik organizasyonu ile neredeyse tüm ve sağlam burun dokuları elde etmek için etkili bir yöntem tarif. Bir mikroskop altında cerrahi aletler kullanarak, sırayla burun doku çevreleyen kafatası kemikleri çıkarın. Bu işlem hem paraformaldehid-sabit ve taze disseke, tenli fare başlarına yapılabilir. Tüm kemik sıyırma işlemi geleneksel kimyasal bazlı de için gerekli deneysel zaman çok daha kısadır 20-30 dk, alırkalsifikasyon. Ayrıca, burun doku hazırlık sağlam ince yatay ya da koronal veya sagittal kesitler elde etmek için önemlidir konka, arasında sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için kolay bir yöntem mevcut. Bizim yöntem kullanılarak hazırlanabilir burun doku özellikle bölgeye özgü inceleme ve karşılaştırma ilgilendiren çalışmalarda, bütün montaj tüm epitel gözlenmesi, hem morfolojik, immünositokimyasal, RNA in situ hibridizasyon ve fizyolojik çalışmalar için kullanılabilir.
Introduction
Memeli burun boşluğu doku ve farklı fonksiyonlara hizmet organların çeşitli türlerini içerir. Burun boşluğuna, akciğerlere ve dışına hava yolculuğu sağlayan, üst solunum yolu, ve giriş kısmını oluşturur. Solunan hava o da temizlik ya da rahatsız edici ve toksik maddeler ve bulaşıcı mikroorganizmaların 2 kaldırmak için filtreleme olarak sıcaklık ve nem klima 1 uğrar burun boşluğu geçer. Her iki tedavi burun epiteli ve bezleri ve damarlar da dahil olmak üzere subepitelial dokular, tarafından yürütülen ve alt solunum yolları ve akciğer korumak için büyük öneme sahiptir. Solunum ve epitel savunma rolüne ek olarak, nazal doku da geçen hava kimyasal maddelerin geniş bir tespit koku ve trigeminal sistemleri, periferal duyu cihazları içerir. Aktif olduğu sistemine bağlı olarak, burun kimyasalların duyusal algılama ya temin edebilirsinizkoku, tahriş, ya da ağrı 3,4 duygusu.
Periferik koku alma sistemi karmaşık ve burun boşluğu içinde çeşitli anatomik olarak ayrılmış koku alma duyu organları oluşur olduğunu. Bunlar arasında, ana koku epiteli (MEB) kemirgenler 5 burun epitel yaklaşık 45-52% oluşturur ve arka bölgede bulunduğu, en büyüğüdür. Anteroventral bölgede, burun septum her tarafında oturup vomeronasal organı 6, olarak bilinen boru yapıların bir çift vardır. Masera 7,8 ve Grüneberg ganglion 9 septal organı olarak bilinen koku duyu nöronlarının iki ek küçük gruplar, sırasıyla, ventral septum ve burun boşluğunun dorsal giriş bölgesine birlikte bulunur. Bu çevresel organlar ayırt edici morfolojik özellikleri, hücre belirteci ifade ve fizyolojik fonksiyonu ile nöro-epitel içerir. Birlikte koku binlerce tespitzarif hassasiyeti 10-12 ile moleküller.
Koku alma duyu organları ek olarak, burun boşluğunun diğer duyu sistemleri ev sahipliği yapmaktadır. Bu peptiderjik trigeminal sinir lifleri burun epitelinde, özellikle solunum yolu epitel 13,14 mevcut olduğu bilinmektedir. Bu liflerin bazı rahatsız edici ve zehirli kimyasallar tespit etmek ve bu tür öksürük ve 4,15 hapşırma gibi koruyucu refleksleri başlatmak için sorumludur. Rahatsız edici kokulu ve acı bileşikler de birçoğu trigeminal sinir lifleri 16-19 tarafından innerve tek kimyasal-duyusal hücreler (SCC), bir yeni keşfedilen nüfus ile tespit edilebilir. Bu SCC aynı zamanda bir koruyucu fonksiyon 16-18 hizmet olabileceğini ima, burun boşluğu ve vomeronasal giriş kanallarının giriş bölgesinde daha yüksek yoğunluğa sahip bulunmaktadır. Böylece, burun epitel fonksiyonu, morfolojisi önemli ölçüde farklı olabilir, ve hücre kompozisyon kendi bağlı olarakanatomik yerleri.
Hatta tek ve özel epitel içinde, bölgesel farklılıklar vardır. MEB böyle bir örnektir. Karmaşık ve yapılar kıvrılmış MEB hatları çeşitli konka,. Böylece onları nedeniyle, farklı MEB deneyimi farklı hava akış oranlarının bölgelere ve farklı difüzyon ve hava koku moleküllerini 20 kota kullanım oranları. Ayrıca, belirli bir koku reseptörü ifade koku duyu nöronlarının (OSNs) MEB 21,22 bölgeleri etrafından dört birinde yer olduğu bilinmektedir. Bu konumu fark nasıl etkilediğini koku bir OSN cevabı büyük ölçüde bilinmemektedir. Buna ek olarak, bazı nüfus OSN bölgesel olarak tercih sergiler. Guanil siklaz-D (GC-D)-ifade OSNs ectoturbinates 23,24 ve cul-de-sac bölgeler lehine bölgeli dağılımları var. Daha yakın zamanlarda, biz (tr geçici reseptör potansiyeli kanal M5 ifade kanonik OSNs bir alt bulunduPm5) ve tercihli olarak, lateral ve ventral bölgeleri 25 bulunur. Bu sonuçlar MEB tekdüze değildir gösterir. Ancak bu bölgesel farklılıklar koku kodlama nasıl etkilediğini anlaşılamamıştır. Ayrıntılı fizyolojik MEB incelenmesi ve burun mevcut yöntemlerle korunmuş anatomik organizasyonu ile sağlam nazal epitel elde zorluğu ile sınırlı olduğundan bu kısmındadır.
Burun epitel ağırlıklı olarak burun, maksilla, damak, elmacık ve etmoid kemikler de dahil olmak üzere kafatası ön kemikleri ile çevrilidir. Yetişkin fare ve diğer kemirgen modellerinde, bu kemikler özellikle yakından bağlantılı nazal doku, hassas konka zarar vermeden kaldırmak zordur ve zordur. Genellikle, kimyasal bazlı yumuşatma immünohistokimyasal, morfolojik ve in situ hibridizasyon çalışmalar için nazal dokuların cryosectioning izin kemikleri yumuşatmak için kullanılan, ancak, bağımlıding hayvanın yaşına, yumuşatma işlemi bir gecede en fazla 7 gün 24,26-28 sürebilir. Bu doku fiksatif korunmuş olması gerekir, çünkü bu tedavi de sınırlıdır. Ayrıca, kimyasal yumuşatma sert ve bazı hassas antikor 29,30 ve immün etkileyebilir. Fizyolojik çalışmalar için, canlı doku gereklidir ve bu nedenle, bu deneyler genellikle izole OSNs veya olan kafatası kemikleri ince ve 17,31,32 yumuşak yenidoğan elde MEB dilim yürütülmektedir. Fizyolojik çalışmalar da bölme kafa 25,33,34 tarafından bütün montaj hazırlıkları yararlanabilirler, ancak burun medial yüzeyi genellikle sadece diğer alanlarda fizyolojik kayıtları sınırlayıcı, kolayca erişilebilir.
Burada, korunmuş orijinal anatomik organizasyon ve morfolojisi ile sağlam burun dokuları hazırlamak için etkili, el kemik sıyırma yöntem açıklanmaktadır. Biz sırayla ön en önemli kemikleri çıkarınfareler çok eski olmadıkça ince konka kemikleri sağlam tutmak ve cryosectioning ise neredeyse tamamen sağlam burun epitel ortaya çıkarmak için bir diseksiyon mikroskop altında kafatası gereklidir. Ayrıca, böylece çevresel hem de merkezi devrelerinin aynı anda inceleme kolaylığı, nazal doku ve olfaktor arasındaki bağlantı, hem de beynin geri kalanı korumak için yöntem uzanır. Önerilen yöntem, paraformaldehid sabit, hem de taze, canlı nazal doku hazırlamak için de kullanılabilir. Böylece, yöntem solunum, koku alma ve burun hasar ve hastalık, morfolojik immünohistokimyasal ve fizyolojik çalışmalar kolaylaştırmak için bekleniyor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, aşağıdaki doku koruyucu iken sırayla çevreleyen kemik kaldırarak fare burnundan sağlam koku ve solunum doku izole etmek için bir adım-adım prosedürü gösterdi. Dikkatli kemik kaldırma bütün olarak bile en hassas dokuları korumak olduğunu göstermektedir. Biz de sinir bağlantısını korumak için birlikte beyin ve burun dokusu hem izole edildiği bu tekniğin olası değişiklikler, fikir paylaşmak. Bu yeni yöntem, in situ hibridizasyon ile immünohistokimyasal, RNA, daha fazla işle…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Weihong Lin için araştırma destekleri (NIH / NIDCD 009.269, 012.831 ve ARRA idari ek NIH hibe) tarafından desteklenmiştir. Biz özellikle kamera çekimi ve işleme yaptığı teknik yardım için UMBC de Bay Tim Ford teşekkür ederim. Ayrıca videoya, kendi ekipman yardım için Olympus America Inc Dr Daphne Blumberg, UMBC de Bayan Chere Petty ve Bay Nicholas McCollum teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Dissection | |||
| Rongeur, 1.0 mm Jaw width | World Precision Instruments (WPI) | 501333 | |
| Fine forceps, Dumont 3 | WPI | 503235 | |
| Fine forceps, Dumont 55 | WPI | 14099 | |
| Fine forceps, Dumont AA | Fine Science Tools (FST) | 11210-20 | |
| Specimen forceps, Serrated | VWR | 82027-440 | |
| Operating scissors | WPI | 501753 | |
| Iris scissors, Straight | Miltex | V95-304 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZ40 | |
| [header] | |||
| Tissue embedding | |||
| Optimum cutting temperature (OCT) compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| Plastic embedding mold | VWR | 15160-215 | |
| Aspirator vacuum pump | Fisher Scientific | 09-960-2 | |
| [header] | |||
| Section staining | |||
| Neutral red | ACROS Organic | CAS 553-24-2 | Nuclei staining |
References
- Naclerio, R. M., Pinto, J., Assanasen, P., Baroody, F. M. Observations on the ability of the nose to warm and humidify inspired air. Rhinology. 45, 102-111 (2007).
- Bjermer, L. The nose as an air conditioner for the lower airways. Allergy. 54, 26-30 (1999).
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413, 211-218 (2001).
- Bryant, B., Silver, W. L. . Chemisthesis: The common chemical sense. , (2000).
- Gross, E. A., Swenberg, J. A., Fields, S., Popp, J. A. Comparative morphometry of the nasal cavity in rats and mice. J. Anat. 135, 83-88 (1982).
- Halpern, M. The organization and function of the vomeronasal system. Annu. Rev. Neurosci. 10, 325-362 (1987).
- Rodolfo-Masera, T. Su l’esquoestizenza di un particulare organo olfacttivo nel setto nasale della cavia e di altri roditori. Arch. Ital. Anat. Embryol. 48, 157-212 (1943).
- Levai, O., Strotmann, J. Projection pattern of nerve fibers from the septal organ: DiI-tracing studies with transgenic OMP mice. Histochemistry and Cell biology. 120, 483-492 (2003).
- Storan, M. J., Key, B. Septal organ of Gruneberg is part of the olfactory system. J. Comp. Neurol. 494, 834-844 (2006).
- Restrepo, D., Arellano, J., Oliva, A. M., Schaefer, M. L., Lin, W. Emerging views on the distinct but related roles of the main and accessory olfactory systems in responsiveness to chemosensory signals in mice. Horm. Behav. 46, 247-256 (2004).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell Mol. Life Sci. 63, 1465-1475 (2006).
- Munger, S. D., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Subsystem organization of the mammalian sense of smell. Annu. Rev. Physiol. 71, 115-140 (2009).
- Finger, T. E., St Jeor, V. L., Kinnamon, J. C., Silver, W. L. Ultrastructure of substance P- and CGRP-immunoreactive nerve fibers in the nasal epithelium of rodents. J. Comp. Neurol. 294, 293-305 (1990).
- Papka, R. E., Matulionis, D. H. Association of substance-P-immunoreactive nerves with the murine olfactory mucosa. Cell Tissue Res. 230, 517-525 (1983).
- Baraniuk, J. N., Kim, D. Nasonasal reflexes, the nasal cycle, and sneeze. Curr. Allergy Asthma Rep. 7, 105-111 (2007).
- Lin, W., Ogura, T., Margolskee, R. F., Finger, T. E., Restrepo, D. TRPM5-expressing solitary chemosensory cells respond to odorous irritants. J. Neurophysiol. 99, 1451-1460 (2008).
- Ogura, T., et al. Cholinergic microvillous cells in the mouse main olfactory epithelium and effect of acetylcholine on olfactory sensory neurons and supporting cells. J. Neurophysiol. 106, 1274-1287 (2011).
- Finger, T. E., et al. Solitary chemoreceptor cells in the nasal cavity serve as sentinels of respiration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 8981-8986 (2003).
- Gulbransen, B. D., Clapp, T. R., Finger, T. E., Kinnamon, S. C. Nasal solitary chemoreceptor cell responses to bitter and trigeminal stimulants in vitro. J. Neurophysiol. 99, 2929-2937 (2008).
- Zhao, K., Dalton, P., Yang, G. C., Scherer, P. W. Numerical modeling of turbulent and laminar airflow and odorant transport during sniffing in the human and rat nose. Chemical Senses. 31, 107-118 (2006).
- Ressler, K. J., Sullivan, S. L., Buck, L. B. A zonal organization of odorant receptor gene expression in the olfactory epithelium. Cell. 73, 597-609 (1993).
- Vassar, R., Ngai, J., Axel, R. Spatial segregation of odorant receptor expression in the mammalian olfactory epithelium. Cell. 74, 309-318 (1993).
- Fulle, H. J., et al. A receptor guanylyl cyclase expressed specifically in olfactory sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 3571-3575 (1995).
- Juilfs, D. M., et al. A subset of olfactory neurons that selectively express cGMP-stimulated phosphodiesterase (PDE2) and guanylyl cyclase-D define a unique olfactory signal transduction pathway. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 3388-3395 (1997).
- Lin, W., Arellano, J., Slotnick, B., Restrepo, D. Odors detected by mice deficient in cyclic nucleotide-gated channel subunit A2 stimulate the main olfactory system. The Journal of Neuroscience: The Official journal of the Society for Neuroscience. 24, 3703-3710 (2004).
- Ishii, T., Omura, M., Mombaerts, P. Protocols for two- and three-color fluorescent RNA in situ hybridization of the main and accessory olfactory epithelia in mouse. J. Neurocyt. 33, 657-669 (2004).
- Lee, A. C., Tian, H., Grosmaitre, X., Ma, M. Expression patterns of odorant receptors and response properties of olfactory sensory neurons in aged mice. Chemical Senses. 34, 695-703 (2009).
- Packard, A., Schnittke, N., Romano, R. A., Sinha, S., Schwob, J. E. DeltaNp63 regulates stem cell dynamics in the mammalian olfactory epithelium. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 8748-8759 (2011).
- Matthews, J. B., Mason, G. I. Influence of decalcifying agents on immunoreactivity of formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Histochem J. 16, 771-787 (1984).
- Athanasou, N. A., Quinn, J., Heryet, A., Woods, C. G., McGee, J. O. Effect of decalcification agents on immunoreactivity of cellular antigens. J. Clin. Pathol. 40, 874-878 (1987).
- Hegg, C. C., Irwin, M., Lucero, M. T. Calcium store-mediated signaling in sustentacular cells of the mouse olfactory epithelium. Glia. 57, 634-644 (2009).
- Spehr, M., et al. Essential role of the main olfactory system in social recognition of major histocompatibility complex peptide ligands. The Journal of Neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 1961-1970 (2006).
- Ma, M., Chen, W. R., Shepherd, G. M. Electrophysiological characterization of rat and mouse olfactory receptor neurons from an intact epithelial preparation. J. Neurosci. Methods. 92, 31-40 (1999).
- Cygnar, K. D., Stephan, A. B., Zhao, H. Analyzing responses of mouse olfactory sensory neurons using the air-phase electroolfactogram recording. J. Vis. Exp. (37), e1850 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J. Vis. Exp. (65), e3564 (2012).
- Lin, W., Margolskee, R., Donnert, G., Hell, S. W., Restrepo, D. Olfactory neurons expressing transient receptor potential channel M5 (TRPM5) are involved in sensing semiochemicals. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 2471-2476 (2007).
- Lin, W., Ezekwe, E. A., Zhao, Z., Liman, E. R., Restrepo, D. TRPM5-expressing microvillous cells in the main olfactory epithelium. BMC Neurosci. 9, 114 (2008).
- Ogura, T., Krosnowski, K., Zhang, L., Bekkerman, M., Lin, W. Chemoreception regulates chemical access to mouse vomeronasal organ: role of solitary chemosensory cells. PLoS One. 5, e11924 (2010).
- Sathyanesan, A., Feijoo, A. A., Mehta, S. T., Nimarko, A. F., Lin, W. Expression profile of G-protein βγ subunit gene transcripts in the mouse olfactory sensory epithelia. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 84 (2013).
